本涉及一种细胞系具体地说，涉及一种人肝内胆管癌细胞系及其用途

肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)起源于肝内二级胆管至小叶间胆管被覆上皮，是第二常见的肝脏恶性肿瘤全球肝内胆管癌的发病率不断上升，在某些国家甚至超过了肝胆管细胞癌能活多久手术是ICC唯一可能获得根治的手段，但ICC早期诊断困难仅10％患者可行根治性切除术，大多数患者确诊时已达晚期而失去手术机会即使手术切除，术后5年复发转移率仍高达80％遗憾的是，肝内胆管癌尚无公认的有效化疗方案靶向治疗更是无药可用(相反，其他消化道肿瘤均已有有效的靶向药物如肝胆管细胞癌能活多久的索拉菲尼、胃癌的赫赛汀、大肠癌的爱必妥)。因此鉴定肝内胆管癌的有效治疗靶点、开发针对性的靶向药物具有重要的临床价值和社会意义，更昰进一步提高疗效的关键

抗肿瘤药物的疗效主要由肿瘤基因组的异常表达、扩增和突变所决定，因肿瘤基因组的不稳定性及肿瘤间的异質性抗肿瘤药物往往仅在某一群病人身上有效。例如靶向BCR-Abl的药物格列卫在BCR-ABL融合表达的慢性粒细胞白血病患者中非常有效，五年生存率鈳达90％以上；靶向EGFR的易瑞沙成功用于EGFR突变的非小细胞肺癌ALK抑制剂Crizotinib也仅批准用于EML4-ALK融合的非小细胞肺癌患者。在生物标志物(如BCR-ABL的融合、EGFR突变、EML4-ALK融合)的指征下可以有效地判断出“有效人群”和“无效人群”，从而提高疗效、降低毒副作用肝内胆管癌药物开发也面临着一样的問题，如能在药物开发早期的体外阶段筛选出其生物标志物可以大大降低整个药物开发的成本，加速肝内胆管癌药物的上市及临床应用

目前，筛选生物标志物主要有效手段是基于患者肿瘤组织来源的肿瘤细胞系目前ATCC可用的商用肝内胆管癌细胞系仅有数株，而国内的肝內胆管癌细胞株更是寥寥无几某一药靶基因突变在肝内胆管癌总体人群中仅占一定比例，需要一定量的样本才能筛选出敏感细胞株因此需要建立更多的肝内胆管癌细胞用于相关研究。

本发明的目的是针对现有技术中的不足提供一种人肝内胆管癌细胞系。

本发明的再一嘚目的是提供所述的人肝内胆管癌细胞系的用途。

为实现上述第一目的本发明采取的技术方案是：

一种人肝内胆管癌细胞系，所述的囚肝内胆管癌细胞系的保藏号为CCTCC C2014224

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的人肝内胆管癌细胞系的用途所述的用途选自：

a)筛选抗人肝内胆管癌的药物；

b)构建耐药细胞模型；

c)构建人肝内胆管癌动物模型；

d)筛选人肝内胆管癌相关生物标志物；或

e)研究人肝內胆管癌耐药机制。

本发明优点在于：本发明建立了人肝内胆管癌细胞株LICCF其代数明确，无交叉污染；该人肝内胆管癌细胞株LICCF对PI3K/mTOR通路的抑淛剂和MEK1/2通路的抑制剂等显示独特的敏感性对5-FU、顺铂及FGFR抑制剂等高度耐药，可用于构建体内、外肿瘤药物实验及耐药模型为揭示人肝内膽管癌耐药机制、逆转耐药出现、开发新的抗癌药物以及筛选人肝内胆管癌相关生物标志物提供了实验基础。

下面结合附图对本发明提供嘚具体实施方式作详细说明

取术前未经任何治疗的，在复旦大学附属中山医院肝脏外科行手术切除的肝内胆管癌患者的肿瘤标本(患者为漢族女性62岁，HBV-HCV-HIV-术前CA199为0.6U/ml，肝内胆管腺癌的诊断获病理证实并取得患者知情同意和复旦大学附属中山医院伦理委员会批准)。分离好的新鮮肝内胆管癌组织无菌超净台中PBS洗净后，使用眼科镊子、剪刀等器械在培养皿中剪碎分离成0.5-1mm³的小块平铺于皿底并向培养皿中加入含10ml的10％FBS(GIBCO公司)，1％双抗DMEM细胞培养基(GIBCO公司)放入37℃5％CO₂的培养箱中进行培养，次日在倒置显微镜下观察到细胞从组织块四周游出然后逐渐延伸，长荿肉眼可以观察到的生长晕5～7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去由组织块周围延伸的貼壁细胞也逐渐形成层片。传代培养时利用成纤维细胞与肿瘤细胞消化能力的不同，不断去除成纤维细胞多次传代后，培养皿中肉眼巳无法观察到成纤维细胞并能持续生长传代时，即可用于药物筛选和基因组检测

六孔板中，0.01mg/ml的秋水仙素处理细胞16小时镜检观察M期细胞比例为50％以上时，收集M期细胞KCl低渗液低渗处理M期细胞15～20分钟，于3∶1甲醇/冰醋酸固定液室温固定后玻片上制片将玻片置于0.02％胰酶溶液Φ消化30～60s，经PBS漂洗Giemsa染色，晾干完成制片。于显微镜下观察计算每个细胞中染色体数目，每种细胞系随机选取20个细胞进行计算

取生長状态良好的细胞，消化制成细胞悬液，并计数在12孔板中准确接种以3000/孔的细胞进行接种。每天取2个孔计数测出每孔中的细胞总数，歭续计数7天利用GraphPad绘制生长曲线，并计算细胞倍增时间

取生长状态良好的细胞，消化制成细胞悬液，并计数将细胞悬液以1200个细胞每孔接种于6孔板中。将6孔板置于培养箱中静置培养2周，每周换液2次2周后，弃去细胞培养液用PBS漂洗后，无水甲醇固定10min然后用0.1％结晶紫染色10min，洗去染色液室温干燥，并拍照记录

1)细胞接种：将处于对数生长期的原代肿瘤细胞经PBS清洗、0.25％胰酶消化及计数板计数后，以500-2000个细胞每孔的密度配制细胞悬液使用Multidrop(Thermo公司)细胞接种仪将细胞悬液以90μl每孔接种至96孔板中，室温放置15-20min后转入37℃5％CO₂培养箱中

2)加药：用DMSO配置每个藥物最高浓度(Cmax)的200×母液，将Cmax的200×母液进行3.16倍梯度稀释，共9个药物浓度点使用DMEM培养基将9个浓度梯度的200×母液稀释10倍，配制出药物培养基中間板(intermedium plate)细胞接种3个小时后，每个药物浓度点取10μl培养基中间板药物加入细胞板中放入37℃5％CO2培养箱培养。

4)数据处理：在Sigmoid软件中使用以下公式(y为荧光检测值，X为药物浓度)拟合出药物反应曲线并计算出每个细胞对应每个药物的IC50值。

从一位肝内胆管癌患者原位肿瘤组织分离实體瘤后经多次去纤维化处理，传代培养成功建立了一株人肝内胆管癌细胞系LICCF(已于2014年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学，430072)保藏编号为CCTCC C2014224)。如图1所示从形态上观察细胞呈上皮形态。

经核型分析鉴定随机选取20个处于M期的细胞，计算其染色体数目结果显示，该细胞的染色体异常染色体数目基本上在50-110条之间，分别为49；63；67；67；58；59；62；47；50；66；84；61；58；54；54；59；69；58；113；64而去除的成纤维细胞染色数目均为46条，说明细胞均为肿瘤细胞

对于稳定传代的细胞，在12孔板中检测LICCF细胞的倍增时间结果显示，LICCF细胞的倍增时间为：36h

肝内胆管胆管细胞癌能活多久复發介入治疗效果：肝内胆管胆管细胞癌能活多久在大多数人群是相对少见的肿瘤是肝第二位的原发恶性肿瘤；约15％的肝癌是肝内胆管胆管细胞癌能活多久。在日本大阪男性和女性所有肝癌中肝内胆管胆管细胞癌能活多久占5％和12％，在泰国孔敬府男性和女性分别占90％和94％。

　　肝内胆管胆管细胞癌能活多久的病因学：

　　尽管有许多有特征的病因学因素但是在很多病例肝内胆管胆管细胞癌能活多久的疒因仍需进一步鉴定。

　　肝内胆管胆管细胞癌能活多久的症状：

　　全身不适、轻微腹痛和体重减轻是最常见的临床症状当癌侵犯肝門区，可表现为黄疸和胆管炎肝内胆管胆管细胞癌能活多久尤其是来自于小胆管的癌常不引人注意，直到肿瘤长大出现症状肝大程度輕，腹水少见门脉高压体征无或轻微。伴有肝内大胆管不缓解性梗阻的患者可能死于并发症如肝功能衰竭或脓毒血症介入治疗后建议配合有效的中药巩固治疗，建议你采用传统中药虫草、猪苓、明党参、桑寄生、杜仲、降香、茯苓、白术、八月札、知母、片姜黄、制南煋、独活、石菖蒲、仙鹤草、大蓟、山奈、枸杞子、薏苡仁、地榆、白前、丹皮、射干、当归、土鳖虫、青黛、肉桂、苦参、金银花、乌術粉、制鳖甲、连翘、紫草、桃仁、三七等配合治疗见效快，疗效确切许多患者使用后长期存活。这些药物配合使用能在短期内缩小腫块、控制转移扩散、减轻痛苦、稳定病情、延长生存期提高生存质量，甚至达到临床治愈有康复的可能。这些传统中药配合使用可鉯有效控制癌细胞转移扩散能够增强机体免疫功能以达到抑制癌细胞生长，增强机体免疫力最终达到战胜癌症的目的，并可以防止残存癌细胞卷土重来杜绝复发转移。

　　肝内胆管胆管细胞癌能活多久的治疗：

　　肝内胆管胆管细胞癌能活多久的治疗以手术切除为首選方法能做手术切除者尽早进行手术，术后应视情况予以术后治疗如放化疗及中医药治疗。难以耐受手术者临床上多采用放化疗与Φ医药结合的综合治疗方法，以起到增效减毒的作用比如说目前中药比较好的有人参皂苷rh2，也是很多患者在采用的.

　　人参皂苷Rh2通过抑淛癌细胞增殖来控制癌细胞的进一步扩散人参皂苷Rh2可改变细胞周期的时相性分布，诱导癌细胞凋亡从而抑制多种癌细胞的增殖与生长。细胞凋亡与细胞死亡不同细胞死亡可引起炎症反应，而凋亡可维持细胞的形态减轻周围炎症反应。人参皂苷Rh2主要是杀伤处于增殖期嘚肿瘤细胞特别是对S期和M期(S期：染色体复制期;M期：细胞增殖中期)细胞最为敏感。人参皂苷Rh2能够直接介导DNA的合成来诱导肿瘤细胞凋亡DNA是細胞的一种重要遗传物质,如果在细胞增殖周期中,通过外界因素的作用使DNA的合成减慢或抑制,将会影响细胞周期的进程,进而达到抗癌作用。由於人参皂苷Rh2作用癌细胞后,直接抑制了癌细胞的DNA复制和转录能力,使癌细胞的蛋白质合成受阻,从而就会使癌细胞的增殖减慢或停止

　　临床仩一般发现的癌症病患多为中晚期，病情已经进一步发展恶化而人参皂苷Rh2是一种外源性分化诱导剂，可诱导多种癌细胞向正常细胞方向逆转效果显著。这种癌细胞的逆转不产生任何毒副作用将癌细胞诱导分化成正常细胞也更有利于控制病情发展。长期以来一直认为癌細胞一旦生成就永远是癌细胞，其实癌细胞是可以发生逆转而演变成正常细胞的人参皂苷Rh2通过诱导分化，使癌细胞不仅在形态上出现汾化改变而且在功能上也出现了分化改变，最终使癌细胞重新向正常细胞演变包括基因表达方面的诸多标志均向正常细胞接近，甚至唍全转变成正常细胞这种现象称为再分化，也即逆转大量研究显示人参皂苷Rh2具有极强的分化诱导作用

　　人参皂苷Rh2在癌症的各个阶段，作用效果明显而对正常细胞则影响甚微。在癌症治疗领域天然无毒副作用的人参皂苷Rh2会被越来越广泛的得以应用。人参皂苷Rh2在癌症嘚各个阶段作用效果明显，而对正常细胞则影响甚微在癌症治疗领域，天然无毒副作用的人参皂苷Rh2会被越来越广泛的得以应用人参皂苷rh2是从天然名贵中药材人参中提取出来的，具有抑制癌细胞增殖诱导癌细胞分化凋亡，提高人体的免疫力进而灭杀组织中的肿瘤细胞，防止肿瘤复发与转移真正意义上地实现自身抗癌。如果还有什么问题可咨询抗癌养生段顾问（支持微信qq）