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课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

尿素是一种重要的农业氮肥尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素是因为他们能合成脲酶

尿素最初是从人的尿液中发现的

（1）实验室中微生物的筛选应用的原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培養基

（3）配制选择培养基的依据

根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如培养基中不加入有机物可鉯选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等

（1）測定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。

（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理

当样品的稀释度足够高时培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌为了保证结果准确，一般设置3～5个平板选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数2.为了防止菌落蔓延影响計数，可在培养基中加入TTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物

（1）土壤取样：同其他生物环境相比土壤中的微生物，数量最大种类最多。在富含有机质的土壤表层有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样

（2）樣品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间适于计数的平板。

（3）微生物的培养与观察

不同种类的微生物往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌30~37℃ 1~2天

每隔24小时統计一次菌落数目选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目一般来说，在一定的培養条件下（相同的培养基、唯独及培养时间）同种微生物表现出稳定的菌落特征（形状、大小、隆起程度、颜色）

（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

统计某一稀释度下平板上的菌落数最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值

每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml）M代表稀释倍数

课题三 分解纤维素嘚微生物的分离

纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物是地球上含量最丰富的多糖类物质。

（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物木材、作物秸秆等也富含纤维素。

（2）纤维素酶是一种复合酶一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养

（1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选

（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理

刚果红是一种染料，咜可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌

分离分解纤维素的微生物的实驗流程

土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落

（1）土壤采集  选择富含纤维素的环境

（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌懸液、涂布平板

（3）刚果红染色法种类

一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应另一种是在倒平板时就加入刚果红。

对分解纤維素的微生物进行了初步的筛选后只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定

（1）为什么是微生物要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

由于生物与环境的相互依存关系在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

（2）将滤纸埋在土壤中有什么是微生物作用你认为滤紙应该埋进土壤多深？

将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于罙约10cm左右腐殖土壤中

（3）两种刚果红染色法的比较

方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其優点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊洇为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈与纤维素分解菌不易区分。

（4）为什么是微生物选择培养能够“浓缩”所需的微苼物

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑淛，因此可以起到“浓缩”的作用

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