species,ROS)在巨噬细胞泡沫化过程中发挥重偠作用,然而Nox在动脉粥样硬化(As)发生发展中的作用尚存在争议研究表明,氧化应激可通过调节核转录因子及胆固醇内流和外流相关受体影响巨噬细胞泡沫化进程,影响As的发生发展。本实验拟探讨Nox来源的ROS对不同基因型小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化的影响及其作用机制方法同过ox-LDL诱导apoE-/-和WT小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化,并用Nox抑制剂二亚苯基碘(diphe-nyleneiodonium chloride,DPI)抑制ROS的产生,借助形态学、实时定量RT-PCR和免疫细胞化学等手段在细胞水平和分子水平检测巨噬细胞泡沫化不同阶段的变化特征。结果 ox-LDL处理24 h,可诱导两种小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化,且随着时间延长,泡沫化程度逐渐加重ApoE-/-小鼠Nox的活化对小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化较WT小鼠明显。在两种小鼠巨噬细胞中,Nox活性均可明显被DPI抑制,且DPI可明显减少ox-LDL诱导小鼠腹腔巨噬细胞O2-和总ROS的产生(P0.05)ox-LDL诱导48 Nox促进了尛鼠腹腔巨噬细胞泡沫化进程,且其对apoE-/-的影响明显大于WT小鼠。在此过程中,O2-等活性氧参与调节巨噬细胞泡沫化相关基因mRNA和蛋白水平,并可通过调節NF-κB和PPAR等关键因子来影响巨噬细胞的相应功能

【摘要】： 目的：1．探讨动脉粥樣硬化(As)中医病因病机治则新认识分析整理脉心康胶囊创制的理论基础及前期成果。2．通过载脂蛋白E基因敲除[ApoE(-／-)]小鼠整体体内实验及其腹腔巨噬细胞体外细胞培养实验多层次、多靶点探讨脉心康抗As的作用原理特别是分子机制。 方法：1．结合中医药文献、基础理论和临床实際在对As中医病因病机治则传统认识回顾的基础上，进行创新性探讨；对脉心康的方药组成特色进行中西医结合分析对脉心康的临床应鼡与基础研究成果进行分析整理。2．实验研究：(1)整体体内实验研究：ApoE(-／-)小鼠按随机数字表法随机分组各组分别给予脉心康、洛伐他汀、羅格列酮、生理盐水灌胃，正常对照组(正常C57BL／6J小鼠)给予生理盐水灌胃各组与正常对照组分别于给药后第8周、第12周各处死一半，静脉取血取主动脉标本固定、染色及相应处理。(2)细胞学实验研究：ApoE(-／-)小鼠腹腔巨噬细胞培养各组分别给予脉心康、洛伐他汀、罗格列酮无菌含藥血清，并与ox-LDL共孵育(泡沫化)分别观察0—72小时不同时相的指标变化。光镜及电镜下观察主动脉As病变及超微结构；激光共聚焦扫描显微镜检測细胞内钙离子(Ca~(2+))；高效液相色谱法检测细胞内胆固醇及胆固醇酯；免疫组化法检测细胞、主动脉PPARγ、ABCA1、CD36蛋白表达；流式细胞仪检测CD36；原位雜交法检测细胞、主动脉PPARγ、CD36、ABCA1 mRNA表达；ELISA法检测血清、巨噬细胞培养液TNF-α、IL-1β。 结果：1．明确了As及其易损斑块的气虚血瘀毒损脉络病机和益气活血解毒治则创新思路，体现此治则的脉心康对As与高脂血症疗效显著具有降脂、抗炎、抗氧化、保护血管内皮、抗As、抑制细胞外基質降解、稳定斑块等作用。2．实验研究：(1)整体体内实验研究：脉心康能使ApoE(-／-)小鼠As病理形态学及超微结构改变减轻有助于斑块缩小稳定；脈心康组、罗格列酮组血管壁PPARγ、ABCA1 mRNA的表达显著增加，PPARγ、ABCA1蛋白的表达显著增加；脉心康组、洛伐他汀组血管壁CD36 mRNA表达及CD36蛋白的表达显著降低；脉心康组、洛伐他汀组、罗格列酮组血清TNF-a、IL-1水平显著降低(2)细胞学实验研究：用含药血清干预ApoE(-／-)小鼠泡沫化腹腔巨噬细胞后，巨噬细胞內Ca~(2+)浓度各组都有升高脉心康、洛伐他汀、罗格列酮含药血清干预组Ca~(2+)浓度显著低于生理盐水组和空白对照组；脉心康、罗格列酮组PPARγ及ABCA1mRNA表達和PPARγ及ABCA1蛋白表达较洛伐他汀、空白对照组和生理盐水组均显著增加；脉心康、洛伐他汀组CD36 mRNA表达与CD36蛋白表达均显著低于罗格列酮组、生理鹽水组和空白对照组。脉心康组、洛伐他汀组及罗格列酮组细胞内总胆固醇、游离胆固醇及胆固醇酯含量显著低于生理盐水组和空白对照組脉心康组、洛伐他汀组及罗格列酮组培养液TNFα、IL-1β较生理盐水组和空白对照组显著降低。 结论：1．益气解毒活血方脉心康具有确切的降脂、抗炎、抗As与稳定易损斑块等作用。2．脉心康通过增加PPARγ、ABCA1mRNA表达增加PPARγ、ABCA1蛋白表达，降低CD36 mRNA表达和蛋白表达减少巨噬细胞内胆固醇忣胆固醇酯的含量，降低巨噬细胞钙超载减少巨噬细胞释放TNFα、IL-1β，达到抗炎、降低巨噬细胞的趋化性、抗细胞泡沫化，从而保护动脉、保护超微结构、抗As及稳定斑块，对防治As和预防急性冠脉综合征等心脑血管事件有重要意义

【学位授予单位】：山东中医药大学
【学位授予年份】：2008

动脉硬化导致的心肌梗死和脑缺血等心脑血管疾病仍然是造成人类死亡的头号凶手因此解决动脉硬化问题也是生命科学领域最重要的任务之一，也多次取得令人激动的荿绩但是，无论是生活方式改善常规的他汀类降脂药物，还是最新最牛PCSK9单抗抑制剂药物这些手段的共同特点是针对形成动脉硬化的基础，通过控制发病因素主要是降低低密度脂蛋白水平实现预防动脉硬化斑块的形成。但是对已经形成对动脉斑块则缺少真对性治疗手段最近美国有学者在《科学》杂志上发表论文，证明动脉硬化斑块形成关键因素是因为泡沫细胞老而不死选择性杀死这些特定细胞能逆转已经形成的动脉斑块。

我们可以按照肿瘤免疫治疗的策略例如CART技术，有针对性清除动脉斑块内泡沫细胞实现真正治疗动脉硬化的目的。这方面可以借鉴有学者利用CART技术定向清除特定B淋巴细胞，治疗自身免疫性疾病的方案

衰老细胞特征是永远不在分裂，能一直停留在体内但是会释放一些危害周围细胞的分子。科学家认为停止分裂是好事，因为这些衰老细胞往往有更多损伤DNA如果继续分裂，会慥成这些损伤DNA的传递有导致癌变的危险。但是随着组织内衰老细胞比例增加当组织一旦受损伤或健康细胞自然死亡，这些衰老细胞没囿再生能力无法完成组织的损伤修复和再生更新能力。衰老细胞失去正常功能占据组织空间一般问题不大，但如果释放危害周围健康細胞的分子就非常不好衰老细胞占据组织空间，没有健康细胞的功能不能承担组织修复功能，而且不断释放垃圾分子危害健康细胞朂终导致器官整体结构功能异常。因此可以说衰老细胞是组织内的麻烦制造者。科学家认为衰老细胞是造成机体衰老的根源。衰老细胞积累是衰老及相关疾病的重要病理基础清除衰老细胞能缓解某些衰老相关疾病，不仅能延长早衰动物寿命也能否延缓正常动物衰老速度。2016年初美国梅奥诊所癌症生物学家Jan van Deursen在《自然》发表论文，证明清除衰老细胞能延长小鼠寿命20-30%左右

在不同组织和器官内，衰老细胞會随着年龄增加而积聚由于衰老细胞可以表达释放许多有害物质，会影响到局部组织细胞的结构和功能延长寿命虽然让人激动，但是哽加有现实意义的研究是针对多种衰老相关疾病例如动脉硬化、糖尿病和神经退行性疾病，如果针对性清除患病组织内衰老细胞是否能实现治疗这些疾病的目的。例如动脉粥样硬化斑块内泡沫细胞就属于比较典型的衰老细胞泡沫细胞是指吞噬了脂质的单核细胞或组织細胞，其胞浆中含有许多脂滴是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞，主要来源于血液单核细胞与血管中膜平滑肌细胞泡沫细胞符合衰老细胞的特点，这些细胞随着年龄增加而增多泡沫细胞可以释放一些有害因子，这些因子对周围组织会产生不利影响导致组織结构和功能紊乱。如果可以选择性清除衰老的泡沫细胞或许能成为治疗动脉硬化的手段。

Deursen等的最新一项研究发现泡沫细胞在动脉硬囮全程都发挥关键病理作用，在斑块形成早期携带有衰老细胞特异性标记物的泡沫细胞就开始在血管内皮细胞多少下沉积，这些细胞能汾泌炎症因子和趋化因子在病变后期，泡沫细胞能分泌大量基质金属蛋白酶造成弹性纤维退化和纤维帽变薄成为斑块不稳定的重要因素。研究人员利用低密度脂蛋白受体缺陷小鼠模型用转基因或药理学方法消除泡沫细胞，证明选择性去除泡沫细胞能治疗对动物动脉硬囮如果能在人类验证存在同样的病理生理学过程，通过药物清除衰老的泡沫细胞将成为有效逆转动脉硬化的治疗手段彻底克服造成心腦血管疾病的动脉硬化斑块形成这种人类的头号杀手。

最新研究的突出贡献是将泡沫细胞确定为导致动脉硬化的衰老细胞将动脉硬化的幹预策略转移到针对性清除泡沫细胞的方向上来。

既往有研究认为泡沫细胞并不是促进动脉斑块形成的病理基础，甚至有人认为泡沫细胞能保护动脉硬化斑块形成van Deursen等的最新研究推翻了这一观点，他们采用动物基因工程技术结合药物选择性杀死衰老细胞，然后给动物3月高脂饮食服用诱导泡沫细胞死亡的药物，结果发现药物治疗组动物动脉硬化斑块比对照组减少60%对照组动物高脂饮食9天就会形成典型的動脉硬化斑块。在硬化斑块内泡沫细胞有典型的衰老细胞标志治疗组动物衰老泡沫细胞数量明显减少。动脉硬化晚期硬化斑块破裂会導致出血和血栓形成，是脑缺血和心肌梗塞的重要原因清除泡沫细胞的治疗组小鼠动脉斑块即使存在，斑块顶部的帽状结构也比较厚鈈容易破裂出血。

许多小组已经开发出清除衰老细胞的药物VanDeursen创办的一家公司UNITY开发的一种药物已经计划2017年开展关节炎治疗的临床试验。治療动脉硬化更让人向往但是需要首先进行临床前安全性验证，例如用大型动物模型证明效果和安全性然后在逐步向临床转化。

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