现货促销BD流式细胞 用的细胞筛大尛仪常用试剂与耗材——流式进样管细胞筛，溶血素鞘液微球

  从1968年 最早的商品化 流式细胞 用的細胞筛大小术(FC) 和荧光激活细胞分类术(FACS)诞生以来, 它们已得到大大改进但要成为实验室广泛接受的技术，除成本因素外还存在不少障碍。技术上的问题主要是细胞内低丰度分子的检测缺少“通用”细胞通透物 质，细胞自发荧光的干扰效应荧光分子间发射光谱的重叠，以忣缺少可识别目标分子的试剂特别是对于细胞分拣来说，由于液滴的形成收集、分拣细胞重分析或 培养前的稀释以及为获得足够数量嘚可用细胞需要的时间延误的原因，还存在细胞存活问题最后，特别是在处理低丰度对象时数据分析也是很棘手的。

有一篇关于 流式細胞 用的细胞筛大小仪理论的不错的综述介绍了流式细胞 用的细胞筛大小仪的操作语言。此外还有另一篇文章涵盖了提供流式细胞 用嘚细胞筛大小仪所用特定试剂的 主要抗体供应商。本文将聚焦于以下几点：

1）硬件的选择和注意事项

2）流式细胞 用的细胞筛大小仪和细胞汾选的实际问题

3）数据分析和软件这几个话题包含的内容不展开论述

希望读者在着手开展表1列出的一些流式细胞 用的细胞筛大小仪应用研究前，了解一些注意事项

表1. 流式细胞 用的细胞筛大小仪和/或细胞分拣的常见应鼡

表 2. 主要设备供应商

研究人员对研究对象进行了分类，超大型（浮游生物、母细胞、早期胚胎）非常小（微粒、细菌）或者高度不对称（精子、肌小管）。確保您将要使用的仪器以前在这一应用中被成功使用过喷嘴直径、流动细胞的几何形状、流速、液滴大小、检测器位置都会影响到结果。

再生医学和癌症治疗研究通常要求对细胞进行分离以确保纯度、细胞活力并且便于在流式细胞 用的细胞筛大小仪实验室和病人间运送。Closed cartridges (OwlCytonome公司) 似乎是制造商为解决这一问题的一个尝试。另一个途径是提供带有无菌罩或者可匹配标准尺寸无菌罩的细胞分拣仪

有几种可增強流体流动的技术，如声学对焦 (Life Technologies公司)、等压射流 (Stratedigm公司)、毛细管(Millipore公司)或微流控技术（几个还在开发中）。它们大多已在其他设备上应用卻未必已用于流式细胞 用的细胞筛大小 仪。为便于使用者获得及时反馈我建议本文读者加入 普渡大学流式细胞 用的细胞筛大小仪订阅。許多流式细胞 用的细胞筛大小仪方面的领军人物都会定期在该论坛上提供有价值的信息其他博客，比如Google+也有类似功能，但它们缺乏普渡团队的深度和广度

另外，还有一些有意思的技术在这一领域也很有影响首先，利用Miltenyi或其他公司的磁珠对目的细胞做预纯化或清洗可提高分拣效率当然，仅仅利 用一轮或多轮磁珠筛选而不用流式细胞 用的细胞筛大小仪许多研究也能开展起来，但这不是本文讨论的重點Amnis 公司已将流式细胞 用的细胞筛大小仪射流与荧光显微镜和数字成像整合在一起。其结果是一系列单个细胞的图像能够显示荧光团的分咘而非简单的平均荧光指数（MFI）。 DVS Sciences已极大地扩展了可用质谱（MS）检测结合报告抗体的金属螯合物的靶标数目前有33种不同的金属可被同時检测。该仪器被Time of Flight 称为"Cytof"  [1]考虑购买该仪器的研究人员应该确保他们有这一深度的细胞分析需要。此外细胞在等离子体中会被汽化，所以鼡于研究的细胞不能恢复

细胞分拣仪制造商有一点不能达成共识，激光检测是在细胞通过喷嘴后的液滴中（空气中的蒸汽）还是液滴形成前的流动细胞内，完成效果最好如图1， （上图）一个蒸汽系统（Influx也可能是FACSCalibur或其他设备），（下图）一个流动细胞系统（BD公司的 FACS Aria III）

图 1. 蒸汽的（顶部）和流动的（底部）细胞分拣装置的光学构造。BD Biosciences?转载许可。

这两者各有优势和局限蒸汽分拣仪硬件设备简单，检测點与收集装置间距离较短检测样品的激光数多。而流动细胞分拣系统通过比色皿提供层流和增强的样品 聚焦然而，流动细胞长度有限而且激光光学装置需要足够空间避免不同通道间的串扰。对于敏感性来说流动细胞系统明显占优，但蒸汽系统没有保持细胞清洁 的问題并且能提供额外的激光束。需要指出的是有些激光束本身对细胞有毒害作用。

细胞悬浮于液滴中然后使其经主脉冲自由下滴（或提供压力）。有关液滴如何带点和偏向的问题请参考Labome其他流式细胞 用的细胞筛大小仪的文章 图7。

此外关于培养基种类和细胞存活体积嘚问题。相关文章和普渡大学网站有大量关于培养基的建议但培养基通常会选用牛胎儿血清（FBS）。将细胞收集到 11 x 75 毫米或更大的管中需偠用到0.5 - 1 mL的牛胎儿血清。对于多层平板来说牛胎儿血清应该占一半的体积，因为还要考虑平板干掉的问题而如果仅仅是收集核酸，用于細胞裂解和核酸提取的同样的 产品就可以了此外还建议对进一步处理的细胞在营养丰富的生长培养基中进行复苏。

所有的流式细胞 用的細胞筛大小仪制造商都在增加分拣细胞存活方面取得了很大的进步微流体方面的最新进展可能使不通过液滴形成做细胞收集成为现实。鈈管答案是否是毛细管-基础系统或基于微通道的系统都必将规避分拣时的细胞压力问题。

试剂-抗体除非你用病人血清建立诊断检测不缺少提供流式细胞 用的细胞筛大小仪抗体的公司。请见Labome文章 列表然而，并非所有这些公司都有相同克隆-并且不是所有克隆在流式细胞 用嘚细胞筛大小分析中作用方式相同如果文章中没有列出想要的克隆，而你又想运行相似的实验请联系作者找出使用的哪一克隆。

多数公司不会公开抗体纯化和标记的方法但如果你是从一个声誉较好的公司购买，同一克隆标记相同的荧光基团就可以了除非是在发货途Φ受损，微生物污染或者保存不当按照制造商建议的储存条件，抗体至少能保质一年

然后，你应该决定你的实验是否要用荧光直接标記的抗体或者用二抗，生物素-链霉亲和素或其他配体-受体。除非您的实验室预算紧张应使用直接标记的抗体。直接标记的抗体背景較低没有裂解细胞释放的生物素造成干扰，重复性较好

另一种选择是用标记试剂盒或者第三基团标记的抗体，如 SoluLink或其他的一些抗体淛造商也提供用户定制标记，但应认真考虑公司在抗体标记方面的声誉如何所有的化学基团各有优劣，因此需要慎重考虑交联剂（请见Thermo Fisher Pierce   實用指南

有五种基本类型的荧光染料：小分子染料（如荧光异硫氰酸酯/ FITC和Alexa染料），蛋白染料（藻红蛋白、别藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白）串联染料，其中蛋白染料收集荧光将它传输至小分子染料，然后串联染料发 出同小分子染料（如APC-Cy7）量子点和多聚染料(  亮紫)相同波长的咣波所有的都各有优点和缺点，但蛋白染料和小分子染料在流式细胞 用的细胞筛大小仪中使用时间最长

我们很容易就能观察到标记的夶分子蛋白（> 100 kD）、疏水性染料或聚合物是如何改变单克隆抗体活性的。为说明相对相对大小图2显示了一个抗体分子与一个蛋白分子共轭嘚结构（在这种情况下辣根过氧化 物酶“只有”44 kD）。我们可以得出这样的结论：最安全的方法是使用以前别人用过的同一克隆抗体和荧光染料结合的抗体但是，我们为什么不能创造出一种独特的抗体呢-通 过表达细胞或非表达细胞共轭组合并表征其特异性然后滴定抗体最夶化其信噪比，这样你的实验室就有一个新的试剂了

试验中选择荧光染料基于以下几点：

1）流式细胞 用的细胞筛大小仪或细胞分拣仪上鈳以用什么样的激光器和滤波器

2）目标相对丰度-更亮的荧光染料应该用在低丰度的分子上

3）靶标是否在细胞内。胞内靶标被包埋于细胞中所以应该使用最亮的荧光染料两种激光仪器，比如Guava? EasyCyte 或者BD? FACSCalibur 只能使用四种荧光染料所以染料选择就像设置一个可用荧光染料基质并设其为檢测目标一样简单。PE通常是最亮的其次是APC，因此它们应该被连接到胞内 或低丰度的抗体上想了解发射光溢出量，例如PE通道中的异硫氰酸荧光素我们可以参考光谱分析 Invitrogen公司或者 BD公司。

如果超过两种激光/四种颜色我们就必须考虑自动还是手动补偿了。 [2]   [3] Fluorescence minus One (FMO)可以控制 [4] 分析仪器-特定波长、强弱和荧光染料的重组对于这些问题，我建议阅读相关文献并咨询您的流式核心管理层和内部专家

试剂 - 固定剂和通透缓冲液  使用的固定剂几乎都是多聚甲醛、PFA或者甲醛。这三种名字的固定剂都会用到但其活性成分是相同的。固定剂应在磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释至1-4%固定过程通常在冰上进行。如果是激酶或磷酸蛋白其磷酸酶需要迅速失活，因此PFA通常在37℃下使用

甲醛可与伯胺作用，因为抗體含有结合位点通常带有静电相互作用赖氨酸固定修饰可避免抗体与固定蛋白结合。这也是为什么根据已有实验方案可以节省时间和 试劑的原因显然，固定（包括通透）会迅速杀死细胞因此如果下一实验步骤是细胞分级分离或核酸提取，通常会先对固定细胞进行分拣操作

根据目标抗体是否分泌并在高尔基体内滞留，激酶或磷酸化蛋白是否需要磷酸酶抑制剂核蛋白是否需要磷脂双分子层部分溶解和DNA松弛，细胞透化需要选择不同的方式所有这些方法都会用到去污剂或酒精，去污剂最温和而酒精特别是甲醇最强效。

当目标在胞质内時首先需要用到最温和的去污剂皂素。低浓度通常0.1%的皂素，对胞内细胞因子着色就足够了 [5]一些非离子去污剂，如Triton X-100、吐温80也有使用泹皂素是最常见的选择。

对于激酶和磷酸化蛋白来说相关技术来自斯坦福大学的Gary Nolan 实验室 [6]   [7]。磷酸酶被PFA和预冷酒精灭活酒精也可以作为二佽固定和强效通透的试剂。文章中建议70%-100%浓度的酒精而70%和90%浓度的酒精最常见。也有通透前先染色的例子在去污剂和酒精中滴定抗体的网站-基于协议，可以在 Cytobank找到分析深度的例子请见图3。

醇类脱水作用的另一个受害者是那些细胞内表达鼡于流式细胞 用的细胞筛大小分析的荧光蛋白。它们包括绿色荧光蛋白、mCherry和Cerulean3如果荧光信号被醇类处理破坏，就需要用到荧光蛋白抗体来檢测变性荧光蛋白了

dyes）和细胞器染料（organelle dyes）。只有最常用的或者首次用到的染料才会被提及如果想查看其他的来源，请参见 分子探针備注：分子探针? 有15种染料。

台盼蓝（Trypan Blue）是第一种被发现不能进入活细胞而能自由进入死细胞的染料PubMed上有一篇参考文献提及它的使用可以縋溯到1914年，第一篇用于流式细胞 用的细胞筛大小 分析的文献可以在上面Beckman Coulter链接中找到而最早将台盼蓝作为活体染料的文章可以追溯到1980年  [8]。從那以后碘化丙啶（PI）和7-氨基放线菌素D（7-AAD）也被作为了活体染料的选择 [9]。7-AAD在流式细胞 用的细胞筛大小分析中往往较少会外溢到临近的通噵中因此明亮的DNA染料和另一种柔和的并且有重叠发射光谱的荧光分子一起使用的时候，一定要多加小心

核酸插入染料溴化乙锭(EtBr) 和碘化丙啶（PI）能够结合到DNA双螺旋的大沟。4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和Hoechst染料（有几种常用的）则结合小沟请注意， 一些染料 (例如碘化丙啶)也会结合箌RNA发卡结构形成的沟中因此如果要做DNA定量，需要用染料和RNA的混合液其它染料，如7-AAD不会与DNA大小 沟结合。

DNA 染料也用于细胞周期分析、染銫体倍数分析和基因组大小量化对于这些研究，通常会用到上面提到的DNA染料但数据分析要求非常苛刻。幸运的是有一篇很好的文章詳细概述了这一过程 [10]。

细胞凋亡测定就用到了流式细胞 用的细胞筛大小仪的多个特性与DNA结合而不透细胞膜的染料可用于鉴定晚期凋亡和壞死细胞。识别细胞周期蛋白（聚合酶的裂解结构和磷酸化 组蛋白H3）的抗体都可以购买到最早的细胞凋亡标记是磷脂酰丝氨酸（PS）溢出，它通常只在细胞质膜内膜上存在溢出被检测到，却并非用的抗体而是通 过一个Ca2+依赖的结合蛋白，膜联蛋白V（Annexin V）这一分子可以购买箌，通常连接几种不同的荧光剂它已经成为研究细胞凋亡的支柱。膜联蛋白V的详细分析请参见  [10]

谱系染料，例如羧基二醋酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）利用膜渗透结合蛋白然后通过琥珀酰亚胺酯与邻近蛋白作用。一旦被染色细胞经过几次分裂后仍然是染色状态，因为跟细胞分裂消耗的时间相比蛋白质的更新更缓慢。

阳离子和pH通道染料钙离子(Ca2+)用Fura-2和Indo-1染料检测 [12] 它们需要紫外线激发，因此许多流式细胞 用的细胞筛夶小分析常用的染料在它们身上却不能使用Magnesium Green和 一些Fura-衍生物已经被成功用到检测Mg2+上 [13]。其中有些是在可见光谱中激发的对pH值测定的荧光染料从1979年就开始使用了。要收集实时数据您的流式细胞 用的细胞筛大小仪要能显示带有时间轴的数据，收集率也必须在您想要测定的时候鈳以兼容多个样品

外排染料几种正常和转化细胞能够运输有机化合物到细胞外。当细胞发生癌变时这是极其重要的，从细胞中移除的汾子可以作为化疗药物然而，该转运过程在正常细胞 中也能被发现包括干细胞。一些外排的分子还具有荧光活性有转运活性的细胞外观不同，当这些染料存在的时候可通过流式细胞 用的细胞筛大小术分离。最常用的染料是 Hoechst 33342有转运活性的细胞被称为“侧群（SP）细胞”[14]。

细胞器染料标记细胞器的方法有三种首先，可以用质粒载体转染细胞该载体上携带荧光蛋白基因，以及将蛋白质同特定细胞器分離的足够肽段信息第二，有结合细胞器的 抗体 - 特异性标志物但它们需要细胞有通透性。染料往往使用简单稳定，荧光比多数荧光蛋皛更明亮一些可用于活细胞。Molecular Probes?提供多种染料包括产品明细一个有用 网站。

数据分析-软件软件使得围绕数据分析的问题变得稍稍简单了这也是本文这一部分要讨论的主题。然而大多数软件以最适合硬件的方式来匹配特定仪器的操作和数据分析。在众 多厂商里根据收集的信息是模拟的还是数字的，数据有很大的差异庆幸的是，有一些不错的第三方软件程序包有一个甚至是免费的，并且他们几乎不受仪器限 制能够开展多数想要的数据分析。

即使考虑到以上所列的困难我们仍然不能将用这些仪器收集到的信息的广度和深度细化为苼物学或医学的重要性的问题。在(  PubMed)搜索"flow cytometry" OR "FACS"的综述文献能找到许多这一话题的文章其中这两种方法中的一种或者两种都有所使用。表I为通过這种方式找到的应用列表

应使用流式细胞 用的细胞筛大小仪或细胞分拣仪自带的软件控制仪器，除非有令人信服的理由不要使用第三方軟件通常这涉及到购买仪器制造商不再支持的用过的仪器。多数机器 特定的软件允许进行一些分析一台双激光台式仪器可能没有边缘切割补偿、标准化和统计软件包。其次有些软件可能有大多数功能，但缺乏一个你需要的手稿或 演示文稿第三，可能你的合作者有一囼不同的仪器但你需要与他共享数据。最后你可能有数量有限的仪器软件副本，但也有许多用户想在他们自己的电脑上处 理数据而鈈破坏原始数据。表III是主要的软件套装和它们应用的仪器

首先，需要考虑仪器的类型较旧的仪器，如BD FACS Calibur和FACScan将数据处理为模拟信息。较噺的仪器如目前市场上大部分仪器，将数据处理为数字信息模拟仪器输出是一个FCS 2.x文件，它几乎可以被任何分析软件包读取数字数据鈳以导出为FCS 2.x或3.x文件，一些较旧的分析程序不能解析FCS3.0数据一个例子是一个由Joe Trotter编写的免费软件包，可从

不幸的是即使两台仪器生成同样的FCS 3.0數据，却并不意味着人们可以自由地分享不同制造商仪器之间的数据通常情况是文本格式的问题，可能有一些网上资源可以将一台仪器特定格式的文件转换 成另一台仪器的三个仪器独立包可以自动或有小的应用程序为用户这么做。

数字数据的优势是什么最重要的是，烸个数据点（细胞）包含相关数据这样，如果您将数据加载到分析软件包包括补偿在内的几乎所有参数可以修改。 FCS 2.x数据不能恢复为预補偿条件重新分析就受到限制了。

表3现有的流式细胞 用的细胞筛大小仪软件

Cytobank确实提供了一个基于订阅的高维数据集的功能该软件被称为 "SPADE"。

图 4. 典型的批量分析堆叠直方图

     FlowJo是目前最常用的流式细胞 用的细胞筛大小數据分析软件包程序安装在个人电脑上，TreeStar可以跟随目前数据分析和演示的趋势 FlowJo site提供了一个30天的试用版本10（苹果版是9.6）。这本手册有一個令人印象深刻的新功能列 表不用说，建议在购买前先试用一下图5是批处理分析产生一系列层叠直方图。流式细胞 用的细胞筛大小仪會快速生成大量数据分析大量批处理样品，然后以一种有意义的方式将它们展示出来是任何流式细胞 用的细胞筛大小分析软件包的必备能力

图 5. DeNovo软件得出的流式细胞 用的细胞筛大小分析结果

还有一个不错的选项是DeNovo 软件的FCS Express在线数据包。一位代表堆叠柱状图产生的一个批次analysisThe的替代方案也是一个非常不错的选择，是在网上包FCS快速从头软 件它也有一个令人印象深刻的功能列表，并且还产生了出版物 - Ready图形图6示絀了此分析软件包的功率，并获得的数据时在接近瞬时的钙的细胞内的波动。请注意X轴是时间和更迅速的细胞讯问，更有意义的数 据它也有一个令人印象深刻的新功能列 表，也生成直接用于发表的图形图6展示了此分析软件包的强大，对几乎瞬时的细胞内钙波动获得嘚数据请注意，X轴是时间细胞检测的越快，数据越有意义

请注意，FCS Express已经适应了它们的图像分析软件这一类型数据不断涌现，因此洳果一个人要从尖端仪器上生成数据必须留心，需匹配软件的数据类型

FCS从头分析软件         总结软件部分，流式细胞 用的细胞筛大小仪会产苼海量的数据 导出的FCS标准数据能够直接与不同仪器中的结果进行整合。仪器特异性的和仪器通用的分析软件包给新用户的是安全感的假潒要生成大量的数据并不难，但如 果我要试图解释这些数据实验的、收集的和分析的变量却是无穷的。要学习如何选择正确的试剂適当的处理细胞，设置仪器最优化您的应用程序补偿和运行恰 当的控制，阐明数据的意义这些技能的获得都需要耗费时间。除非你不咑算运行四个以上的荧光染料并且所有的染色都是在细胞表面最好是跟有经验的使用者紧 密合作，能避免所有自学者犯的常见错误如果你打算做细胞分拣并希望最后保留活细胞，这些是尤为重要的

总结       请看表I列出的30多种流式细胞 用的细胞筛大小的应用。找出最接近您嘚研究兴趣的一个然后在PubMed 或谷歌学术上做快速的文献检索。确保"cytometry"为关键词留心在最近的几篇文章中数据的展示方式，了解试剂的数量所用仪器的复杂性，以及数 据是如何被呈现出来的然后回到本文中，看看我界定的新用户和有经验的用户可能会面临的所有潜在风险对流式细胞 用的细胞筛大小仪的分析时间，试剂（和同种型对照补偿 珠，以及其他试剂和缓冲液）的成本做出估计然后根据您的特萣需要对其进行修订，安排少数有经验的使用者运行程序这是我希望给那些刚进入该领域或者将要 开展从简单分析到复杂多色实验的使鼡者推荐的最低限度的准备。一旦您完成了上述的准备工作表4列出了文中讨论的供应商和制造商的网址。

表4. 流式细胞 用的细胞筛大小仪供应商

胞内蛋白的检测可以包括细胞分泌产物（如细胞因子）、组成结构（如微管蛋白）或细胞内整合产物 (B rd U 或病毒蛋白等）就分泌产物而言，可以是某些形式的细胞激活研光 在这类实验中，可 以 使 用 蛋 白 质 分 泌 阻 断 剂（如 m onensin 或 brefeldin A 均可从Sigma A ld ric h 获得）使蛋白质不能分泌而在高尔基体中聚积，这有助于在设立实验时对抗體使用浓度的滴定以及证明抗体是否与正确的抗原结合 monensin 处理过的细胞应未处理过的细胞荧光强度高 [6]。此 外 为了保证荧光标记的染色是胞内蛋白（而不是膜上蛋白），在细胞被固定前可用未标记荧光的抗体与之预先孵育以封闭细胞表面抗原

对胞内染色的细胞首先要对细胞进行固定，并使细胞膜通透性增加对固定的细胞增加膜通透性才能使标记抗体进入细胞与胞内蛋白结合。常用的固定剂是 P B S 溶解的多聚甲醛（paraformaldehyd) 溶 液 它能使蛋白质发生交联，但是这种固定方法可能会限制抗体识别抗原固定剂的浓度范围为 0 . 2 5 % ?4 % ( w /V )。其他组织固定剂（如甲醇等）可能会使抗原结构改变从而影响抗体的染色因为有些抗体识别的是抗原的构象表位 。就增加细胞膜通透性的方法含 0.1% 皂素（saponin) 的平衡盐溶液就足以使抗体进入细胞 。 也可使用其他细胞膜渗透剂（如 0 . 0 2 % 的 T w e e n 2 0 ) 由于这种细胞膜通透作用可以消失，有必要在所有溶液中加人皂素 (包括染色和洗涤过程）

使用荧光直接标记的单克隆抗体（与多克隆抗体的间接标记相比）能使抗体的非特异性结合的可能性减至最小，这也使研究者有可能使用同型对照从而进一步验证抗体结合的特异性为了使样本保存的时间比隔夜保存更长，在细胞内染色完成后可将样本偅悬于甲醛溶液中

Alexa 4 8 8 标记的抗胞内抗原的单克隆抗体

在一些实验方案中，研究者可能希望同时标记胞内和胞外抗原在这种情况下，首先標记胞外抗原然后进行如下实验步骤（固定、增加膜通 透 性 、胞内标记）。

(1) 1500 g 离心 3m in 收 获 5 X10⁵个细胞吸管吸弃上清。加 人 imlPBS振荡混匀重悬细胞，获得单细胞悬液

(2) 加 入 Im l 冰上预冷的 4 % 甲醛固定液，室 温 孵 育 10 min (每隔几分钟振荡混匀细胞 确保细胞为单细胞悬液）。

(3) 1500 g·离心 3 min吸管吸弃上清。注意不要吹散细胞沉淀 imi PBS 重悬细胞沉淀。

(4) 1500 g·离心 3 min吸管吸弃上清。注意不要吹散细胞沉淀块 Im l 皂素缓冲液重悬细胞沉淀。

(5) 1500 g 离 心 3 min吸管吸棄上清。注意不要吹散细胞沉淀

(6) 100^1 皂素缓冲液重悬细胞沉淀。

(7) 加人适量抗体（一抗或同种型）

(8) 轻轻混匀试管室温避光孵育 30 min。

(12) 流式细胞 用嘚细胞筛大小仪每个样本获得 1 0000个门内细胞

图 13. 7 显示的是一个胞内染色流式细胞 用的细胞筛大小仪分析数据实例，其 中 x 轴 表 示 Alexa 488焚光强度^ 轴表示细胞数量，A 图为阴性对照B 图为阳性标记的胞内抗原。直方图中显示的是用软件分析的一群相同细胞中阳性（信）细胞和阴性（噪）細胞的荧光强度均值在标准化的流式细胞 用的细胞筛大小仪上（如本章中序言，仪器显示和质量控制中所述）仪器操作者应每天用已知 MESF 值的多个荧光强度的微珠校准仪器。这种情况下微珠数应该与荧光染
料分子数量一致。这样直方图所绘出的 MESF 的相对值与仪器显示的荧咣强度一致呈线性关系。如果研究者想要定量测量荧光 MESF 值 首先要告诉操作者，在样本上机前应将仪器设定在分析多种微珠荧光强度嘚设置，从而能得到样本的不同荧光强度这类实验可能对研究者希望比较抗原表达水平有用（细胞内的和细胞外的），如不同时间的、動物与动物之间的治疗前后的抗原表达