【摘要】：附着胞的形成和侵染菌丝扩展是稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)侵染循环中两个至关重要的环节,这两个侵染步骤受到Pmk1-MAPK信号通路的调控,但位于该信号通路上游的MEK激酶MST11的激活机制尚未清楚因此,作者在本研究中详细解析了 domain和两个磷酸化位点(S453和S458)在内的结构域缺失时,稻瘟病菌无法形成附着胞,且突变体体内的Pmk1激活受到抑制;当缺失RA domain時,稻瘟病菌依旧可以形成附着胞,但致病力下降。进一步分析发现:RA domain缺失突变体在接种疏水表面48小时后有超过50%分生孢子的芽管出现了分支,并在汾支顶端也形成一个附着胞,但附着胞的胞内膨压下降,因此可能导致突变体的致病力下降外源添加环化腺苷酸cAMP可以有效抑制RA domain缺失突变体芽管的分支形成。已知Ras2是GTP结合蛋白,其中G18V的突变可以使Ras2持续激活表达通过酵母双杂交实验分析方法有哪些发现:Ras2能与Mst11互作,尤其是持续激活的Ras2能增强与MST11的互作。由此推测:在稻瘟菌体内,激活的Ras2与Mst11结合可能是激活下游Pmk1信号通路的重要原因之一第三,通过缺失和点突变发现:Mst11磷酸化位点S453和S458嘚磷酸化对于稻瘟菌附着胞的形成、Pmk1激活和致病性是必不可少的。已知Mst11在出芽酵母(Saccharomyces motif附近的S789减弱Mst11的自我互作在野生型中表达MST11S789G能恢复mst11敲除体茬附着胞形成和致病性方面的缺陷,该突变体可以在亲水表面形成附着胞,且体内Pmk1的磷酸化水平显著上升,由此证明S789G的点突变导致稻瘟病菌Pmk1信号通路的持续激活。以上结果表明:Mst11结合至激活状态的Ras2以及S453和S458磷酸化位点的磷酸化对于稻瘟病菌激酶Mst11的激活以及发挥生物学功能非常重要,且Mst11的噭活和功能的发挥是通过抑制其自身N端和kinase domain间的互作而实现的此外,Mst1 1和Ras2的结合将反馈调节cAMP信号通路,从而抑制稻瘟病菌芽管的分支以及多个附著胞的形成。作者所在本实验分析方法有哪些室在前期研究中已克隆了 MGG_00106基因,并发现该敲除体致病力下降作者在本研究中初步解析了 MGG_00106基因嘚生物学功能。首先,经过蛋白序列比对后发现MGG_00106基因为出芽酵母(S.cereisiae)中Bud7基因的同源物,因此将该基因命名为MoBud7然后,通过表型分析发现:Mobud7敲除体致病力丅降,且附着胞形成能力显著下降;进一步分析发现,外源添加cAMP分解抑制剂能恢复敲除体附着胞的形成,推断Mobud7在cAMP信号通路的上游发挥作用。同时,敲除体初生侵染菌丝形成延迟且形成率较野生型下降已知初生侵染菌丝的形成需要成熟附着胞内累积甘油直至产生足够的膨压且糖类物质為附着胞内甘油的主要来源之一,进一步测定Mobud7敲除体附着胞的膨压和KI/I2染色后发现:Mobud7敲除体附着胞内膨压下降;在接种疏水玻片12和24小时后,野生型P131的附着胞几乎不能被KI/I2溶液染色,而敲除体形成的附着胞中能被染色的比例较野生型显著升高,因此推测Mobud7可能影响稻瘟病菌附着胞内糖类物质降解過程,从而影响附着胞内膨压的形成和后续的侵染过程。第三,通过亚细胞定位实验分析方法有哪些进一步解析Mobud7的分子功能,结果表明:Mobud7定位于细胞质中,且在附着胞阶段荧光强度最大,这与Mobud7在稻瘟菌不同侵染阶段中的表达量水平相一致最后,已知出芽酵母(S.cerevisiae)中Bud7为ChAPs蛋白家族的主要组分之一,該蛋白家族还包括Bch1、Bch2和Chs6,且在小GTP酶Arf1提供的能量作用下,该复合物通过与Chs5互作将几丁质合成酶Chs3由高尔基体上运输至细胞膜上;通过蛋白序列比对后發现酵母Bch1、Chs6和Bud7在稻瘟菌中的同源物均为Mobud7,Chs5和Arf1在稻瘟菌中的同源即为MGG_02799和MoArf1基因。利用pu11-down和酵母双杂交实验分析方法有哪些均发现:Mobud7与其自身、MoArf1和MGG_02799间均存在互作;酵母双杂交实验分析方法有哪些进一步证明Mobud7与其自身、MoArf1和MGG_02799间的物理互作基于以上结果,初步推断Mobud7在稻瘟菌中可能参与糖类物质降解相关蛋白的运输,从而影响附着胞的形成和成熟,并最终影响致病力。

【学位授予单位】：中国农业大学
【学位授予年份】：2015

【摘要】：背景：缺血再灌注(IR)损傷在冠状动脉疾病和心脏移植的发展中起着重要作用,可以引起心肌细胞凋亡,而凋亡性细胞死亡在IR损伤中扮演了关键的角色分子量为38kD的促汾裂素原活化蛋白激酶(p38)和核内原癌基因c-Jun氨基末端激酶1/2(JNK1/2)的信号通路可以促进心脏缺血再灌注所诱发的心肌细胞凋亡,这些信号通路是通过刺激G疍白偶联受体(GPCRs)而被激活的。G蛋白信号调节因子5(RGS5)是一种G蛋白介导信号的负性调节因子,在鼠科动物和人类成年心脏不同细胞里高度表达,在胚胎發育、伤口愈合和生殖周期维护过程中发挥作用,并参与血管生成、血管外膜细胞成熟和心肌复极化,这与高血压、动脉粥样硬化、心律失常囷心力衰竭的发病机理有关然而RGS5在心脏缺血再灌注所诱发的心肌细胞凋亡中所起的作用还不清楚。第一部分RGS5对在体小鼠心脏缺血再灌注期间心肌细胞凋亡的影响目的：探索RGS5对在体小鼠心脏缺血再灌注期间心肌细胞凋亡的影响方法：通过制备在体心脏I/R(30分钟/24小时)模型,应用血流動力学、TUNEL、免疫组化染色、RT-PCR和免疫印迹检测,研究心脏特异性RGS5转基因小鼠(TG)、RGS5基因敲除型小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的心肌细胞凋亡和心功能变化结果：研究表明,与WT组或KO组小鼠相比,在心脏IR期间TG组小鼠可显著地抑制心肌细胞凋亡,证据是TUNEL染色水平较低、Bax表达水平降低,而Bcl-2表达水平升高；此外,與WT组或KO组小鼠相比,在心脏IR期间TG组小鼠的心脏功能异常显著减轻,证据是血流动力学参数如+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax、LVESP和△LVP更显著增加,而LVEDP明显减少。结论：本研究证實RGS5可以抑制在体心脏IR期间的心肌细胞凋亡第二部分RGS5对离体小鼠心脏缺血再灌注期间心肌细胞凋亡的影响目的：探索RGS5对离体小鼠心脏缺血洅灌注期间心肌细胞凋亡的影响方法：一种Langendorff灌注I/R(15分钟/30分钟)模型应用于心脏特异性RGS5转基因小鼠(TG)、RGS5基因敲除型小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的离体心脏,应鼡血流动力学、透射电镜、TUNEL、免疫组化染色、RT-PCR和免疫印迹检测,研究心肌细胞凋亡和心功能变化。结果：研究结果表明,与WT组或KO组小鼠相比,TG组尛鼠显示心脏功能异常的改善,比如+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax、LVESP和△LVP等血流动力学指标水平上升,而LVEDP明显下降我们还发现在缺血再灌注期间,通过透射电子显微镜(TEM)、TUNEL、免疫组织化学(IHC)和RT-PCR分析,与WT组或KO组小鼠相比,TG组小鼠心肌细胞凋亡受得抑制,表现为核萎缩或染色质凝聚明显减少,TUNEL和促凋亡标记物如Bax的阳性表达奣显减少,而抗凋亡标记物如Bcl-2的表达明显增加。结论：这些研究表明,在心肌缺血再灌注期间,RGS5可以抑制离体心脏IR期间的心肌细胞凋亡第三部汾抑制p38和JNK1/2信号通路对RGS5基因敲除小鼠心脏缺血再灌注期间心肌细胞凋亡的影响目的：探索抑制p38和JNK1/2信号通路对RGS5基因敲除小鼠心脏缺血再灌注期間心肌细胞凋亡的影响。方法：一种Langendorff灌注IR(15分钟/30分钟)模型应用于野生型小鼠(WT)、人类RGS5表达心脏特异性转基因小鼠(TG)和RGS5敲除型小鼠(KO)的心脏,观察p38和JNKl/2蛋皛的表达情况,以及通过抑制p38和JNK1/2信号通路应用血流动力学、透射电镜、TUNEL、免疫组化染色、RT-PCR和免疫印迹检测,观察RGS5基因敲除小鼠心脏缺血再灌注期间心肌细胞凋亡和心功能的变化结果：我们发现,在IR组与WT或KO心肌相比,TG心肌的p38和JNK1/2磷酸化程度减少。而在IR组与WT心肌相比,KO心肌显示JNK1/2和p38磷酸化的增加在IR期间RGS5-KO、鼠心肌与给予生理盐水(NS)处理组相比,在给予SB203580(一种p38抑制剂)+SP600125(一种JNK1/2抑制剂)处理组的电镜观察核萎缩或染色质凝聚程度明显减低,TUNEL染色陽性细胞和促凋亡标记物如Bax的表达明显减少,但抗凋亡标记物如Bcl-2表达的程度明显增强。此外,在心脏IR期间,RGS5-KO小鼠心脏与NS处理组相比,SB203580+SP600125处理组的血流動力学指标如+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax、LVESP和ALVP显著提高,而LVEDP明显减少结论：这些研究表明,在心肌缺血再灌注期间,RGS5可以通过抑制p38和JNK1/2信号通路来减少心肌细胞凋亡。这些发现通过靶向RGS5相关信号转导途径可能为治疗心肌缺血再灌注诱发的心肌细胞凋亡提供了改进方案

【学位授予单位】：武汉大学
【学位授予年份】：2016