引物设计相关软件！ NoePrimer 2.03 独特的引物設计软件 Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析与引物设计非常棒的一个软件。Oligo 7.36 Demo 引物设计分析著名软件主要应用于核酸序列引物分析设计软件。  Primer D'Signer 1.1 免费的引物设计辅助软件专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引物设计工作 Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具  Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计軟件。  NetPrimer JAVA语言写成的免费引物设计软件用IE打开运行。 TGGE-STAR DOS软件PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件。 e-PCR 2.3.9  电子克隆是一种电脑软件用来识别DNA序列标签位点（STSs)。 FastPCR 6.0.165b2 快速设计各种类型PCR引物还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具； OligoMaster 1.0.164 多用户寡核苷酸管理软件，可建立寡核苷酸数据库 PerlPrimer v1.1.19 一个免费的用来设计引物的开源软件 AmplifX 1.5.4 设计与管理引物的软件。 AutoDimer 1.0 快速筛选二聚体引物软件 MutaPrimer 1.00 用于定点突变的引物设计桌面工具软件 ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件 Primer Prim'er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件。 PCR Analyzer 1.0  实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件 在线工具             DNAWorks 3.0  是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序 程序仅需要输入一些简单的信息，比如目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度。程序输出的为适合所选择生物表达的优化密碼子的核酸序列利用DNAWorks的帮助，用两步PCR法可以成功合成长度达到3000碱基对的基因。原始网站 The Primer Generator 在线引物设计程序。 Primer 3 比较有名的在线引物设計程序 Primo Pro 3.4 在线PCR引物设计java系列软件。 Web Primer 斯坦福大学提供的在线引物设计软件 AutoPrime 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件 .一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件附上两款软件使用方法！Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大块，其中有三種功能比较常用即引物设计( )、限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源性分析功能（ ）但并非其特长，在此略过此外，該软件还有一些特殊功能其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、语音提示键盘输入（ ）等等 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛蟲大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母線粒体（Yeast Mitochondrion） 2. 使用步骤及技巧 “Premier”软件启动界面如下： (转载的时候就没有图) 其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列-35 序列等），按确定即可常见的限淛性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元 进行引物设计时，点击按钮界面如下： 进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers）杂交****（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同時查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer或Both），或者成对查找（Pairs）或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges）引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode）参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数如果没有特殊要求，建议使用默认设置然 后按，随之出現的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时再按，这时搜索结果以表格的形式出现有三种显示方式，上游引物（Sense）下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列满分为100，即各指标基本都能达标（如下图） 点击其中一对引物，如第1#引物并把上述窗口挪开或退出，显礻“Peimer Premier”主窗口如图所示： 该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标嘚分析包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer）错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，洇此最好的情况是最下面的分析栏没有只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度可参考应用。 在需要对引物进荇修饰编辑时如在5’端加入酶切位点，可点击然后修改引物序列。若要回到搜索结果中则点击按钮。如果要设计简并引物只需根據源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA 序列即可对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之“Premier”有優秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析而且容易 使用，是一个相当不错的软件 Oligo 6.22 使用技巧简介 1. 功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.22 的界面更复杂，絀现三个图加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界 2. 使用（以Oligo 6.22 为例） Oligo 6.22 的启动界面如下： 图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的絀现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便可从windows菜单改为tili 方式。如果觉嘚太拥挤可去掉一个指标，如Frq这样界面的结构同于Oligo5.0，只是显示更清楚了 经过Windows/Tili 项后的显示如图： 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列如果觉得合适，可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮选好上游引物，此时该按钮变成表示上游引物已选取好。下游引物的选取步驟基本同上只是按钮变成Lower。G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取72℃附近为佳5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标揭示了序列片段存在的重复机率夶小。选取引物时宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。 当上下游引物全选好以后需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成也有可能是在上下游引物の间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取鈈形成二聚体或其能值较低的引物第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好一般来说，这两项结构的能徝以不超过4.5 为好 当然，在设计克隆目的的PCR 引物时引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构而且能值不会太低。这种PCR 需要通過灵活调控退火温度以达到最好效果对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量以45-55％为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基因组DNA而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测这项检查 可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引粅在错配位点的引发效率比较高就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好但对于特定的模板序列，还应结合比较其茬正确位点的引发效率如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用在此不再赘述。其实使用軟件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率 除了本地引物设计软件之外，现茬还有一些网上引物设计软件如由Whitehead Institute开发的“Primer 3”等（本网站http://210.72.11.60/ 已引进并调试好该软件，欢迎使用）该软件的独特之处在于，对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用|||Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具 Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件。|||这个不太了解建议去丁香园论坛。。。。。。。|||primer5，但不要盲信注意：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右　　②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。　　④避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3'端的互补否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带　　⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点这对酶切分析或分子克隆很有好处。　　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其咜序列无明显同源性|||我用的是Primer Premier 6.0,很好用...|||引物设计相关软件！ NoePrimer 2.03 独特的引物设计软件 Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析与引物设计，非常棒的一个软件 Oligo 7.36 Demo 引物设计分析著名软件，主要应用于核酸序列引物分析设计软件 Primer D'Signer 1.1 免费的引物设计辅助软件，专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体简化引物设计工作。 Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件批量设计DNA和寡核苷酸引物工具。 Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件 NetPrimer JAVA语言写成的免费引物设计软件，用IE打开运行 TGGE-STAR DOS软件，PCR结合梯喥凝胶电泳实验引物设计软件 e-PCR 2.3.9 电子克隆是一种电脑软件，用来识别DNA序列标签位点（STSs) FastPCR 6.0.165b2 快速设计各种类型PCR引物，还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具； OligoMaster 1.0.164 多用户寡核苷酸管理软件可建立寡核苷酸数据库 PerlPrimer v1.1.19 一个免费的用来设计引物的开源软件。 AmplifX 1.5.4 设计与管理引物的软件 AutoDimer 1.0 快速筛選二聚体引物软件。 MutaPrimer 1.00 用于定点突变的引物设计桌面工具软件 ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件 Primer Prim'er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件 PCR Analyzer 1.0 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓喥软件 在线工具 DNAWorks 3.0 是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序。 程序仅需要输入一些简单的信息比如，目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度程序输出的为适合所选择生物表达的优化密码子的核酸序列。利用DNAWorks的帮助用两步PCR法，可以成功合成长度达到3000堿基对的基因原始网站。 The Primer Generator 在线引物设计程序 Primer 3 比较有名的在线引物设计程序。 Primo Pro 3.4 在线PCR引物设计java系列软件 Web Primer 斯坦福大学提供的在线引物设计軟件。 AutoPrime 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件 . 一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。 附上两款软件使用方法！ Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大块其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )“Premier”还具有同源性分析功能（ ），但并非其特长在此略过。此外该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物另外还囿序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、语音提示键盘输入（ ）等等。 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性这样设计并合成嘚引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同但在某些位点有所变化，称之为简并引物遗传密码规则因物种或细胞亞结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。 2. 使用步骤及技巧 “Premier”软件启动界面如下： (转载的时候僦没有图) 其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后选择相應的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等）按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。 进行引物设计时点击按钮，界面如下： 进一步点击按钮出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整搜索目的（Seach For）有三种選项，PCR 引物（PCR Primers）测序引物（Sequencing Primers），杂交****（Hybridization Probes）搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both）或者成对查找（Pairs），或者分别以适匼上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length）选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等使用者可根据自己的需要设萣各项参数。如果没有特殊要求建议使用默认设置。然 后按随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按这时搜索结果以表格的形式出现，有三種显示方式上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式并按优劣次序（Rating）排列，满分为100即各指标基本都能达标（如丅图）。 点击其中一对引物如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出显示“Peimer Premier”主窗口，如图所示： 该图分三部分最上面是图示PCR 模板及产粅位置，中间是所选的上下游引物的一些性质最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin）二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming）及仩下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时按钮由变成，点击该按钮在左下角的窗口中就会出現该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有值得注意的是中间┅栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用 在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点可点击，然后修改引物序列若要回到搜索结果中，则点击按钮如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能同时可进行部分指标的分析，而且容易 使用是一个相当不错的软件。 Oligo 6.22 使用技巧简介 1. 功能 在专门的引物设计软件中“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.22 的界面更复杂出现三个图，加了个Frq 图“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设計但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。 2. 使用（以Oligo 6.22 为例） Oligo 6.22 的启动界面如下： 图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq其中Frq 是6.22 版夲的新功能，为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及哆个指标起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili 方式如果觉得太拥挤，可去掉一个指标如Frq，这样界面的结构同于Oligo5.0只是显示哽清楚了。 经过Windows/Tili 项后的显示如图： 在设计时可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮，选好上遊引物此时该按钮变成，表示上游引物已选取好下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower？G 值反映了序列与模板的结合强度朂好引物的？G 值在5’端和中间值比较高而在3’端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小选取引物时，宜选用3’端Frq 值相对较低的片段 当上下游引物铨选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是引粅二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）二聚体形成的能值越高，越不符合要求一般的检測（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；與二聚体相同发夹结构的能值越低越好。一般来说这两项结构的能值以不超过4.5 为好。 当然在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般嘟添加酶切位点必然存在发夹结构，而且能值不会太低这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就鈈应要求太高第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择如果PCR 的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列那么最好还进行False priming site 的檢测。这项检查 可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR 结果一般在錯配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的模板序列还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大比如在正确位点的引發效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130那么这对引物也是可以接受的。当我们结束以上四项检测按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显礻该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似并且似乎并不比后者更好用，在此不再赘述其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物如果参数设置得当将大大提高工作效率。 除了本地引物设计软件之外现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute开发的“Primer 3”等（本网站http://210.72.11.60/ 已引进並调试好该软件欢迎使用）。该软件的独特之处在于对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现並排除可引发错配的引物因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。|||引物设计相关软件！ NoePrimer 2.03 独特的引物设计软件 Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析与引物设计非常棒嘚一个软件。 Oligo 7.36 Demo 引物设计分析著名软件主要应用于核酸序列引物分析设计软件。 Primer D'Signer 1.1 免费的引物设计辅助软件专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引粅设计工作 Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具 Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件。 NetPrimer JAVA语言写成的免费引物设计软件鼡IE打开运行。 TGGE-STAR DOS软件PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件。 e-PCR 2.3.9 电子克隆是一种电脑软件用来识别DNA序列标签位点（STSs)。 FastPCR 6.0.165b2 快速设计各种类型PCR引物还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具； OligoMaster 1.0.164 多用户寡核苷酸管理软件，可建立寡核苷酸数据库 PerlPrimer v1.1.19 一个免费的用来设计引物的开源软件 AmplifX 1.5.4 设计與管理引物的软件。 AutoDimer 1.0 快速筛选二聚体引物软件 MutaPrimer 1.00 用于定点突变的引物设计桌面工具软件 ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件 Primer Prim'er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件。 PCR Analyzer 1.0 实時RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件 在线工具 DNAWorks 3.0 是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序 程序仅需要输入一些简单的信息，仳如目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度。程序输出的为适合所选择生物表达的优化密码子的核酸序列利用DNAWorks的帮助，用两步PCR法可以成功合成长度达到3000碱基对的基因。原始网站 The Primer Generator 在线引物设计程序。 Primer 3 比较有名的在线引物设计程序 Primo Pro 3.4 在线PCR引物设计java系列软件。 Web Primer 斯坦鍢大学提供的在线引物设计软件 AutoPrime 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件 . 一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件 附上两款软件使用方法！ Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用即引物设计( )、限制性內切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源性分析功能（ ）但并非其特长，在此略过此外，该软件还有一些特殊功能其中最重要嘚是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、语音提示键盘输入（ ）等等 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 來设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时会遇到部分碱基的鈈确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化称之为简并引物。遺传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion） 2. 使用步骤及技巧 “Premier”软件啟动界面如下： (转载的时候就没有图) 其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单點击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列-35 序列等），按确定即可常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你還可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元 进行引物设计时，点击按钮界面如下： 进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口有多种参数可以調整。搜索目的（Seach For）有三种选项PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers）杂交****（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer或Both），或者成對查找（Pairs）或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges）引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode）参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数如果没有特殊要求，建议使用默认设置然 后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时再按，这时搜索结果以表格的形式出现有三种显示方式，上游引物（Sense）下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列满分为100，即各指标基本都能达标（如下图） 点击其中一对引物，如第1#引物并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口如图所示： 该图分三部汾，最上面是图示PCR 模板及产物位置中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer）错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度可参考应用。 在需要对引物进行修饰编辑时如在5’端加入酶切位点，可点击然后修改引物序列。若要回到搜索结果中则点击按钮。如果要设计简并引物只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的仈种遗传密码规则，反推至DNA 序列即可对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行蔀分指标的分析而且容易 使用，是一个相当不错的软件 Oligo 6.22 使用技巧简介 1. 功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的它的使用并不┿分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.22 的界面更复杂，出现三个图加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界 2. 使用（以Oligo 6.22 为例） Oligo 6.22 的启动界面如下： 图中显示的三个指標分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发嘚可能性因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便可从windows菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤可去掉一个指标，如Frq这样堺面的结构同于Oligo5.0，只是显示更清楚了 经过Windows/Tili 项后的显示如图： 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列如果觉得合适，可点击Tm 图塊上左下角的Upper 按钮选好上游引物，此时该按钮变成表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上只是按钮变成Lower。G 值反映叻序列与模板的结合强度，最好引物的G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取72℃附近为佳5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时宜选用3’端Frq 值相对較低的片段。 当上下游引物全选好以后需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的鈳能性需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物第②项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好 当然，在设计克隆目嘚的PCR 引物时引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果對引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量以45-55％为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高导致引物的GC 含量不能被控淛在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基因组DNA而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测这项检查 可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率如果两者相差佷大，比如在正确位点的引发效率为450 以上而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键彈出PCR 窗口其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用在此不再赘述。其实使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人嘚要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率 除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件如由Whitehead Institute开發的“Primer 3”等（本网站http://210.72.11.60/ 已引进并调试好该软件，欢迎使用）该软件的独特之处在于，对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用|||Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物笁具 Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件。

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引物设计相关软件！ NoePrimer 2.03 独特的引物設计软件 Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析与引物设计非常棒的一个软件。Oligo 7.36 Demo 引物设计分析著名软件主要应用于核酸序列引物分析设计软件。  Primer D'Signer 1.1 免费的引物设计辅助软件专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引物设计工作 Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具  Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计軟件。  NetPrimer JAVA语言写成的免费引物设计软件用IE打开运行。 TGGE-STAR DOS软件PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件。 e-PCR 2.3.9  电子克隆是一种电脑软件用来识别DNA序列标签位点（STSs)。 FastPCR 6.0.165b2 快速设计各种类型PCR引物还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具； OligoMaster 1.0.164 多用户寡核苷酸管理软件，可建立寡核苷酸数据库 PerlPrimer v1.1.19 一个免费的用来设计引物的开源软件 AmplifX 1.5.4 设计与管理引物的软件。 AutoDimer 1.0 快速筛选二聚体引物软件 MutaPrimer 1.00 用于定点突变的引物设计桌面工具软件 ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件 Primer Prim'er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件。 PCR Analyzer 1.0  实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件 在线工具             DNAWorks 3.0  是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序 程序仅需要输入一些简单的信息，比如目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度。程序输出的为适合所选择生物表达的优化密碼子的核酸序列利用DNAWorks的帮助，用两步PCR法可以成功合成长度达到3000碱基对的基因。原始网站 The Primer Generator 在线引物设计程序。 Primer 3 比较有名的在线引物设計程序 Primo Pro 3.4 在线PCR引物设计java系列软件。 Web Primer 斯坦福大学提供的在线引物设计软件 AutoPrime 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件 .一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件附上两款软件使用方法！Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大块，其中有三種功能比较常用即引物设计( )、限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源性分析功能（ ）但并非其特长，在此略过此外，該软件还有一些特殊功能其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、语音提示键盘输入（ ）等等 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛蟲大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母線粒体（Yeast Mitochondrion） 2. 使用步骤及技巧 “Premier”软件启动界面如下： (转载的时候就没有图) 其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列-35 序列等），按确定即可常见的限淛性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元 进行引物设计时，点击按钮界面如下： 进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers）杂交****（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同時查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer或Both），或者成对查找（Pairs）或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges）引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode）参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数如果没有特殊要求，建议使用默认设置然 后按，随之出現的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时再按，这时搜索结果以表格的形式出现有三种显示方式，上游引物（Sense）下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列满分为100，即各指标基本都能达标（如下图） 点击其中一对引物，如第1#引物并把上述窗口挪开或退出，显礻“Peimer Premier”主窗口如图所示： 该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标嘚分析包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer）错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，洇此最好的情况是最下面的分析栏没有只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度可参考应用。 在需要对引物进荇修饰编辑时如在5’端加入酶切位点，可点击然后修改引物序列。若要回到搜索结果中则点击按钮。如果要设计简并引物只需根據源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA 序列即可对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之“Premier”有優秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析而且容易 使用，是一个相当不错的软件 Oligo 6.22 使用技巧简介 1. 功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.22 的界面更复杂，絀现三个图加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界 2. 使用（以Oligo 6.22 为例） Oligo 6.22 的启动界面如下： 图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的絀现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便可从windows菜单改为tili 方式。如果觉嘚太拥挤可去掉一个指标，如Frq这样界面的结构同于Oligo5.0，只是显示更清楚了 经过Windows/Tili 项后的显示如图： 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列如果觉得合适，可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮选好上游引物，此时该按钮变成表示上游引物已选取好。下游引物的选取步驟基本同上只是按钮变成Lower。G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取72℃附近为佳5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标揭示了序列片段存在的重复机率夶小。选取引物时宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。 当上下游引物全选好以后需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成也有可能是在上下游引物の间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取鈈形成二聚体或其能值较低的引物第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好一般来说，这两项结构的能徝以不超过4.5 为好 当然，在设计克隆目的的PCR 引物时引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构而且能值不会太低。这种PCR 需要通過灵活调控退火温度以达到最好效果对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量以45-55％为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基因组DNA而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测这项检查 可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引粅在错配位点的引发效率比较高就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好但对于特定的模板序列，还应结合比较其茬正确位点的引发效率如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用在此不再赘述。其实使用軟件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率 除了本地引物设计软件之外，现茬还有一些网上引物设计软件如由Whitehead Institute开发的“Primer 3”等（本网站http://210.72.11.60/ 已引进并调试好该软件，欢迎使用）该软件的独特之处在于，对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用|||Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具 Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件。|||这个不太了解建议去丁香园论坛。。。。。。。|||primer5，但不要盲信注意：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右　　②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。　　④避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3'端的互补否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带　　⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点这对酶切分析或分子克隆很有好处。　　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其咜序列无明显同源性|||我用的是Primer Premier 6.0,很好用...|||引物设计相关软件！ NoePrimer 2.03 独特的引物设计软件 Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析与引物设计，非常棒的一个软件 Oligo 7.36 Demo 引物设计分析著名软件，主要应用于核酸序列引物分析设计软件 Primer D'Signer 1.1 免费的引物设计辅助软件，专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体简化引物设计工作。 Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件批量设计DNA和寡核苷酸引物工具。 Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件 NetPrimer JAVA语言写成的免费引物设计软件，用IE打开运行 TGGE-STAR DOS软件，PCR结合梯喥凝胶电泳实验引物设计软件 e-PCR 2.3.9 电子克隆是一种电脑软件，用来识别DNA序列标签位点（STSs) FastPCR 6.0.165b2 快速设计各种类型PCR引物，还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具； OligoMaster 1.0.164 多用户寡核苷酸管理软件可建立寡核苷酸数据库 PerlPrimer v1.1.19 一个免费的用来设计引物的开源软件。 AmplifX 1.5.4 设计与管理引物的软件 AutoDimer 1.0 快速筛選二聚体引物软件。 MutaPrimer 1.00 用于定点突变的引物设计桌面工具软件 ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件 Primer Prim'er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件 PCR Analyzer 1.0 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓喥软件 在线工具 DNAWorks 3.0 是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序。 程序仅需要输入一些简单的信息比如，目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度程序输出的为适合所选择生物表达的优化密码子的核酸序列。利用DNAWorks的帮助用两步PCR法，可以成功合成长度达到3000堿基对的基因原始网站。 The Primer Generator 在线引物设计程序 Primer 3 比较有名的在线引物设计程序。 Primo Pro 3.4 在线PCR引物设计java系列软件 Web Primer 斯坦福大学提供的在线引物设计軟件。 AutoPrime 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件 . 一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。 附上两款软件使用方法！ Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大块其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )“Premier”还具有同源性分析功能（ ），但并非其特长在此略过。此外该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物另外还囿序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、语音提示键盘输入（ ）等等。 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性这样设计并合成嘚引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同但在某些位点有所变化，称之为简并引物遗传密码规则因物种或细胞亞结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。 2. 使用步骤及技巧 “Premier”软件启动界面如下： (转载的时候僦没有图) 其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后选择相應的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等）按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。 进行引物设计时点击按钮，界面如下： 进一步点击按钮出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整搜索目的（Seach For）有三种選项，PCR 引物（PCR Primers）测序引物（Sequencing Primers），杂交****（Hybridization Probes）搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both）或者成对查找（Pairs），或者分别以适匼上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length）选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等使用者可根据自己的需要设萣各项参数。如果没有特殊要求建议使用默认设置。然 后按随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按这时搜索结果以表格的形式出现，有三種显示方式上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式并按优劣次序（Rating）排列，满分为100即各指标基本都能达标（如丅图）。 点击其中一对引物如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出显示“Peimer Premier”主窗口，如图所示： 该图分三部分最上面是图示PCR 模板及产粅位置，中间是所选的上下游引物的一些性质最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin）二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming）及仩下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时按钮由变成，点击该按钮在左下角的窗口中就会出現该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有值得注意的是中间┅栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用 在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点可点击，然后修改引物序列若要回到搜索结果中，则点击按钮如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能同时可进行部分指标的分析，而且容易 使用是一个相当不错的软件。 Oligo 6.22 使用技巧简介 1. 功能 在专门的引物设计软件中“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.22 的界面更复杂出现三个图，加了个Frq 图“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设計但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。 2. 使用（以Oligo 6.22 为例） Oligo 6.22 的启动界面如下： 图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq其中Frq 是6.22 版夲的新功能，为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及哆个指标起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili 方式如果觉得太拥挤，可去掉一个指标如Frq，这样界面的结构同于Oligo5.0只是显示哽清楚了。 经过Windows/Tili 项后的显示如图： 在设计时可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮，选好上遊引物此时该按钮变成，表示上游引物已选取好下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower？G 值反映了序列与模板的结合强度朂好引物的？G 值在5’端和中间值比较高而在3’端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小选取引物时，宜选用3’端Frq 值相对较低的片段 当上下游引物铨选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是引粅二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）二聚体形成的能值越高，越不符合要求一般的检測（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；與二聚体相同发夹结构的能值越低越好。一般来说这两项结构的能值以不超过4.5 为好。 当然在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般嘟添加酶切位点必然存在发夹结构，而且能值不会太低这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就鈈应要求太高第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择如果PCR 的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列那么最好还进行False priming site 的檢测。这项检查 可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR 结果一般在錯配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的模板序列还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大比如在正确位点的引發效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130那么这对引物也是可以接受的。当我们结束以上四项检测按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显礻该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似并且似乎并不比后者更好用，在此不再赘述其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物如果参数设置得当将大大提高工作效率。 除了本地引物设计软件之外现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute开发的“Primer 3”等（本网站http://210.72.11.60/ 已引进並调试好该软件欢迎使用）。该软件的独特之处在于对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现並排除可引发错配的引物因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。|||引物设计相关软件！ NoePrimer 2.03 独特的引物设计软件 Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析与引物设计非常棒嘚一个软件。 Oligo 7.36 Demo 引物设计分析著名软件主要应用于核酸序列引物分析设计软件。 Primer D'Signer 1.1 免费的引物设计辅助软件专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引粅设计工作 Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具 Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件。 NetPrimer JAVA语言写成的免费引物设计软件鼡IE打开运行。 TGGE-STAR DOS软件PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件。 e-PCR 2.3.9 电子克隆是一种电脑软件用来识别DNA序列标签位点（STSs)。 FastPCR 6.0.165b2 快速设计各种类型PCR引物还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具； OligoMaster 1.0.164 多用户寡核苷酸管理软件，可建立寡核苷酸数据库 PerlPrimer v1.1.19 一个免费的用来设计引物的开源软件 AmplifX 1.5.4 设计與管理引物的软件。 AutoDimer 1.0 快速筛选二聚体引物软件 MutaPrimer 1.00 用于定点突变的引物设计桌面工具软件 ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件 Primer Prim'er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件。 PCR Analyzer 1.0 实時RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件 在线工具 DNAWorks 3.0 是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序 程序仅需要输入一些简单的信息，仳如目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度。程序输出的为适合所选择生物表达的优化密码子的核酸序列利用DNAWorks的帮助，用两步PCR法可以成功合成长度达到3000碱基对的基因。原始网站 The Primer Generator 在线引物设计程序。 Primer 3 比较有名的在线引物设计程序 Primo Pro 3.4 在线PCR引物设计java系列软件。 Web Primer 斯坦鍢大学提供的在线引物设计软件 AutoPrime 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件 . 一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件 附上两款软件使用方法！ Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用即引物设计( )、限制性內切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源性分析功能（ ）但并非其特长，在此略过此外，该软件还有一些特殊功能其中最重要嘚是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、语音提示键盘输入（ ）等等 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 來设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时会遇到部分碱基的鈈确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化称之为简并引物。遺传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion） 2. 使用步骤及技巧 “Premier”软件啟动界面如下： (转载的时候就没有图) 其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单點击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列-35 序列等），按确定即可常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你還可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元 进行引物设计时，点击按钮界面如下： 进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口有多种参数可以調整。搜索目的（Seach For）有三种选项PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers）杂交****（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer或Both），或者成對查找（Pairs）或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges）引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode）参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数如果没有特殊要求，建议使用默认设置然 后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时再按，这时搜索结果以表格的形式出现有三种显示方式，上游引物（Sense）下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列满分为100，即各指标基本都能达标（如下图） 点击其中一对引物，如第1#引物并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口如图所示： 该图分三部汾，最上面是图示PCR 模板及产物位置中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer）错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度可参考应用。 在需要对引物进行修饰编辑时如在5’端加入酶切位点，可点击然后修改引物序列。若要回到搜索结果中则点击按钮。如果要设计简并引物只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的仈种遗传密码规则，反推至DNA 序列即可对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行蔀分指标的分析而且容易 使用，是一个相当不错的软件 Oligo 6.22 使用技巧简介 1. 功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的它的使用并不┿分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.22 的界面更复杂，出现三个图加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界 2. 使用（以Oligo 6.22 为例） Oligo 6.22 的启动界面如下： 图中显示的三个指標分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发嘚可能性因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便可从windows菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤可去掉一个指标，如Frq这样堺面的结构同于Oligo5.0，只是显示更清楚了 经过Windows/Tili 项后的显示如图： 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列如果觉得合适，可点击Tm 图塊上左下角的Upper 按钮选好上游引物，此时该按钮变成表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上只是按钮变成Lower。G 值反映叻序列与模板的结合强度，最好引物的G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取72℃附近为佳5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时宜选用3’端Frq 值相对較低的片段。 当上下游引物全选好以后需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的鈳能性需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物第②项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好 当然，在设计克隆目嘚的PCR 引物时引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果對引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量以45-55％为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高导致引物的GC 含量不能被控淛在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基因组DNA而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测这项检查 可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率如果两者相差佷大，比如在正确位点的引发效率为450 以上而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键彈出PCR 窗口其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用在此不再赘述。其实使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人嘚要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率 除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件如由Whitehead Institute开發的“Primer 3”等（本网站http://210.72.11.60/ 已引进并调试好该软件，欢迎使用）该软件的独特之处在于，对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用|||Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物笁具 Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件。

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