专利名称：：制备成熟胰岛素多肽的方法制备成熟胰岛素多肽的方法发明领域本发明涉及在酵母中制备成熟人胰岛素类似物的方法。发明背景胰岛素是在胰岛J3细胞中产生的多肽激素。有活性的胰岛素分子是由通过两个二硫键相连的B-链和A-链组成的双链分子。胰岛素以结构为B-C-A的前体分子胰岛素原形式合成，其中C-肽链将B-链的C-末端氨基酸残基与A-链的N-末端氨基酸残基相连。成熟的双链胰岛素通过在位于与A-和B-链的接点处的碱性氨基酸残基对处切割C-肽形成。A-和B-链通过分别位于A7和B7以及A20和B19Cys残基之间的两个二硫键保持在一起。此外，生物学活性的胰岛素分子还在A6和All位Cys残基之间有一个内部二硫键。在开发出重组DNA技术之后，已经描述了许多在基因修饰宿主细胞中生产胰岛素及其前体的方法。因此在例如Fmnk,B.H.,Pettee,J.M.,Zimmerman,R.E.&Burck,P丄In:PeptidesSynthesis-Structure-Function.ProceedingsoftheSeventhAmericanPeptideSymposium(D.H.Rich和E.Gross,eds).PierceChemicalCompany,p.729(1981)中公开了从大肠杆菌(￡.co/O中制备胰岛素的方法。由于大肠杆菌不具备将所表达的多肽进行折叠的细胞机器且不确立在成熟胰岛素中连接A-和B-链的二硫键，所以，该策略包括了许多体外加工步骤，比如在重折叠过程中体外确立二碌b键以及随后的C-肽切割。与大肠杆菌形成对比，真核生物包含折叠和确立二硫键所必需的机器，且由此看来似乎是用于在基因修饰生物中生产成熟胰岛素的好候选者。美国专利US4,914,026公开了一种在酵母中生产成熟胰岛素的方法，其通过下述实现，在酵母宿主细胞中插入与酵母a-因子前导序列相连的人胰岛素原基因并在一定条件下使转化酵母细胞在营养培养基中生长，由此表达和分泌成熟形式的胰岛素原。Thim等人，ProcNatl.Acad.Sci.USA，第83巻，第6766誦6770页，公开了人胰岛素原以及多种带有经过修饰的C-肽的胰岛素前体的表达，所迷经过修饰的C-肽例如RREAENLQKR(SEEQIDNO:1)、RREAPLQKR(SEQIDNO:2)、RREALQKR(SEQIDNO:3)、KREALQKR(SEQIDNO:4)和RRLQKR(SEQIDNO:5)。SEQIDNO:5还公开于Thim等人，FEBSLetters,第212巻，第2期，第307-312页。此外，WO97/03089公开了式为BZA的胰岛素前体的表达，其中B和A是通过至少一个二硫键相连的人胰岛素A和B肽链，Z是包含至少一个蛋白酶剪切位点的多肽，例如KREQKLISEEALVDKR(SEQIDNO:6)。然而，所公开的胰岛素前体仅在培养基中产生微量分泌的成熟胰岛素。欧洲专利申请0163529A、PCT专利申请号WO95/02059和WO90/10075公开了基于胰岛素或胰岛素类似物前体在酵母中的表达来制备胰岛素和胰岛素类似物的方法，这些胰岛素或胰岛素类似物前体在从发酵液体培养基中初始回收后被酶促转化为成熟胰岛素或胰岛素类似物。这些前体分子包含特定的经过修饰的C-肽，且还包含胰岛素B-链的N-末端延伸。经过修饰的C-肽和可能的B-肽N-末端延伸被设计成不在酵母中细胞^皮切割，且由此前体作为单链肽分泌，其中A-和B-链仍然通过经过修饰的C-肽连接但具有正确定位的二硫键。之后通过许多随后的体外酶促步骤以切割C-肽和可能的N-末端延伸得到成熟的胰岛素或胰岛素类似物产物。这些酶促步骤是耗时的，常常是昂贵的，并且导入随后在进一步的下游加工步骤比如昂贵的层析步骤等中必须被除去的额外杂质。美国专利号6,348,327中公开了在不能天然形成分泌颗粒的基因工程改造的动物细胞中制备成熟胰岛素的方法。本发明的目的是开发能够分泌完全加工的成熟人胰岛素类似物的真菌菌抹，由此避免昂贵且费时的下游纯化方法步骤。发明概述一方面，本发明涉及通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞制备成熟人胰岛素类似物的方法，其中所述前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。根据本发明的人胰岛素类似物在真菌细胞内将作为单链前体表达，且将在该细胞内被切割，并以成熟、双链人胰岛素类似物分泌，无需进一步的体外加工。位于连接肽与胰岛素分子A-和B-链各接点处的切割位点可以相同或不同，但通常是相同的，且在一种实施方案中，位于与A-和B-链接点处的切割位点均为Kex2切割位点。在另一种实施方案中，切割位点为Ypsl位点。连接肽将具有经过最优化以确保在真菌细胞内发生切割以分泌正确成熟化的胰岛素类似物多肽的氨基酸组成。在本发明的一种实施方案中，对于与A-链接近的切割位点倒数第二位的氨基酸残基选自Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp、Val、Met和Ala。在本发明的另一种实施方案中，连接肽在对于与A-链接近的切割位点倒数第二位将包含Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Val或Ala氨基酸残基。在本发明的又一种实施方案中，连接肽在该位置将包含Leu或lie氨基酸残基。我们还发现，相同位置的氨基酸残基不应当是Asp、Glu或Gly。人胰岛素中C-肽的大小是35个氨基酸残基。因此在本发明的一个方面，该连接肽为约与天然C-肽相同长度。在一种实施方案中，连接肽将为2-35、2-34、2-33、2-31、2-30、2-29、2-28、2-27、2-26、2-25、2-24、2-23、2-22、2画21、2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3个氨基酸残基。在又一种实施方案中，连接肽将为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3陽25、3-24、3-23、3國22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3画11、3-10、3-9、3画8、3-7、3-6、3-5或3-4个氨基酸残基。在又一种实施方案中，连接肽将由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3031、32、33、34或35个氨基酸残基组成。真菌细胞将分泌大量正确加工的人胰岛素类似物，且在一种实施方案中，该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约50mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。在另一种实施方案中，该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约80mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。在另一种实施方案中，该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约100mg/L正确加工的成熟双链人胰烏素类似物。对来自胰岛素类似物前体分子的连接肽的切割越有效，靶蛋白的终产量越高。因此，连接肽的氨基酸组成使得能够分别对其与A-和B-链接点处的切割位点进行有效切割将是令人满意的。在本发明的一种实施方案中，至少50%表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。在另一种实施方案中，至少60%表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。在又一种实施方案中，至少70%表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。在又一种实施方案中，至少75%表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。在又一种实施方案中，至少85%或至少95%表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。真菌细胞可以是任何能够表达和分泌成熟胰岛素类似物的真菌细胞。然而，酵母，尤其是啤酒糖酵母(S.cerev/wae),已显示为最适于本发明目的的。人胰岛素分子有三个螺旋结构，一个在B-链中，且两个在A-链中。A-链含有通过A9-A11位环相连的两个螺旋部分A2-A8和A13-A19，且在胰岛素的T-状态构象中，残基B9-B19形成B-链的中央a-螺旋。已显示，胰岛素分子中的特定突变将增强这些螺旋结构的稳定性，从而导向高的生物学活性(参见N:Kaarsholm等人，Biochemistry1993,32，)。由本发明方法制备的胰岛素类似物通常将含有对人胰岛素类似物分子螺旋结构具有稳定作用从而导致更高产量分泌的突变。因此，在一种实施方案中，由本发明方法制备的胰岛素类似物在胰岛素分子A8、B10和A14位中的一个或多个位置将含有突变，且在又一种实施方案中，这些位置的天然氨基酸残基可突变为选自Asp、Glu、His、Gln和Arg的氨基酸残基。胰岛素分子的其它突变包括在B28和B29位的突变、在A18位的突变、B30或B1氨基酸残基的缺失以及A21氨基酸残基的突变。在本发明的一种实施方案中，B28位氨基酸残基是Asp且B29位氨基酸残基是Lys。在本发明的另一种实施方案中，B28位氨基酸残基是Asp,B29位氨基酸残基是Pro,且B30位氨基酸残基是Thr。在本发明的又一种实施方案中，A18位的氨基酸是Gln。在本发明的又一种实施方案中，A21位的氨基酸残基是Gly。在本发明的另一种实施方案中，B10位的氨基酸残基是Glu。在本发明的另一种实施方案中，A8位的氨基酸残基是His。在本发明的另一种实施方案中，A14位的氨基酸残基是Glu。在本发明的又一种实施方案中，B10位的氨基酸残基是Glu,A8位的氨基酸残基是His，且A14位的氨基酸残基是Glu。在本发明的又一种实施方案中，B30位的氨基酸残基缺失。在一种实施方案中，人胰岛素前体类似物具有氨基酸序列B(l-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)其中，B(l-30)是人胰岛素B-链或其类似物，A(l-21)是人胰岛素A-链或其类似物，各X和各Y各自独立为Lys或Arg或Ypsl位点，且Z为1至约35个氨基酸残基的肽序列，附带条件是人胰岛素A-和/或B-链中至少一个天然氨基酸残基突变为另一个氨基酸残基。在一种实施方案中，序列X-X和Y-Y均为Lys-Arg。在另一种实施方案中，序列X-X和Y-Y均为Arg-Arg、Lys-Lys或Arg-Lys。在又一种实施方案中，X-X是Lys-Arg且Y-Y是Arg-Arg,或X-X是Arg-Arg且Y-Y是Lys-Arg。在一种实施方案中，Z的大小为2-35、2-34、2-33、2-31、2-30、2-29、2-28、2-27、2-26、2國25、2-24、2-23、2-22、2-21、2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2國13、2-12、2-11、2陽10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3个氨基酸残基。在又一种实施方案中，Z的大小为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3画12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4个氨基酸残基。在本发明的一种实施方案中，Z的大小可以是2、3、4、5、7、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3031、32、33、34和35个氨基酸残基。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-20个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-19个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-18个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-15个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-14个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-13个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-12个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-11个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-10个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-9个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-8个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-7个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-6个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-5个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-4个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基选自Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Phe、Trp、Val、Met和Ala。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Leu。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Ile。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Tyr。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Arg。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Lys。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是His。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Pro。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Phe。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Trp。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数笫二位的氨基酸残基是Met。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Val。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数笫二位的氨基酸残基是Ala。在本发明的一种实施方案中，Z具有序列AspGlyLeuGly(SEQIDNo:7)。其余的Z为任何可编码的氨基酸残基，它们可以相同或不同。然而，在一种实施方案中，Z中对于切割位点Y-Y倒数笫二位的氨基酸残基不是Asp、Glu或Gly。另一方面，本发明涉及编码含有连接肽的人胰岛素类似物前体的DNA序列，所述连接肽被设计为使得能够在真菌细胞内对切割位点进行有效切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。另一方面，本发明涉及含有编码含有连接肽的人胰岛素类似物前体的DNA序列的表达载体，所述连接肽被设计为使得能够在真菌细胞内对切割位点进行有效切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。在又一方面，本发明涉及含有表达载体的转化的真菌细胞，所述表达载体含有编码含有连接肽的人胰岛素类似物前体的DNA序列，所述连接肽被设计为使得能够在真菌细胞内对切割位点进行有效切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。用本发明方法生产的人胰岛素类似物可用于治疗对胰岛素敏感的状态。因此，它们可用于治疗l型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症，例如有些时候可以在严重受伤者和做了重大外科手术的人中看到的。在有利的情况下，胰岛素类似物也可以以与其它类型的胰岛素的混合物使用，例如具有更快开始作用的胰岛素类似物。胰岛素类似物的例子描述于，例如公开号为EP214826、EP375437和EP383472的欧洲专利申请中。另一方面，本发明涉及含有人胰岛素类似物与适宜的药学可接受佐剂和添加剂，比如一种或多种适于稳定、保存或等渗性的试剂组合的药物制剂。附图简述图1显示称作pSA50的酵母质粒例子。该质粒包含表达盒，所述表达盒含有插入到该质粒中哞酒糖酵母TPI基因转录启动子和转录终止子之间的EcoRI-Z6al片段。图2显示实施例3中所述的包含胰岛素前体B(l-30)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q的NcoI-XbalDNA片段(SEQIDN0:8),及其相应氨基酸序列(SEQIDNO.10)。图3显示对起始体积为1.25L的发酵罐的物料添加速率(g物料/分钟)的时间曲线。还显示了作为时间函数的发酵罐中废气中的二氧化碳浓度。以及图4显示在600nm处测量的光密度和计算得到的每升发酵液体培养基胰岛素的浓度的时间曲线(包括desB30胰岛素)。发明详述通过直接向发酵液体培养基中分泌成熟产物来生产胰岛素需要对含有在两个末端都侧接切割位点的连接肽的胰岛素前体进行细胞内加工。这样的连接肽可以是B-KR(W)nKR-A型，其中B是人胰岛素的B-链，且W是长度不同的肽链。高尔基体蛋白酶Kexl和Kex2促成细胞内加工。切割是多步骤过程，其中第一步的Kex2将切割与A-链附着的KR序列并将单链分子转化为双链分子。之后Kex2将切除连接肽W以得到双链中间体胰岛素分子，其中二肽KR仍然与B-链的C-末端氨基酸相连。最后，Kexl将除去最后的KR肽序列，从而得到成熟的双链分子。试验已显示，对A链接点处的切割位点的有效切割对于切割过程的进一步发展是重要的，且本发明的连接肽被设计成能够实现对A-链Kex2的切割位点的有效体内切割，从而导致产生高产量的分泌的双链胰岛素分子而无需额外的体外加工步骤。从酵母中分泌大量活性成熟双链人胰岛素类似物将显著减少为产生纯度足够高以用于药用目的的人胰岛素类似物所必需的下游纯化步骤的数目。因此，在美国专利号4916212中公开的在酵母中制备胰岛素的方法中，胰岛素前体在两个步骤中被转化为人胰岛素，即，转肽作用以将单链胰岛素前体B(1-29)-Alal画Ala隱Lys國A(1-21)转化为人胰岛素酯，以及之后将胰岛素酯水解为人胰岛素。各转化步骤将需要初始分离步骤，以及至少一个随后的纯化步骤。因此需要包括至少一个酶促转化的至少六个额外步骤来生产成熟的双链胰岛素。已熟知的是，没有酶促切割达到100%切割，从而导致未切割杂质或部分切割的杂质，在药物产品的情况下这些杂质必须被有效除去。因此，各切割步骤之后将有至少一个分离或纯化步骤，通常是借助交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等的层析纯化。可商业规模应用的层析柱材料是非常昂贵的，且因此减少这样的层析步骤的数目对于生产经济有显著的影响。此外减少下游转化和纯化步骤将减少工作量和在该过程中所消耗的时间，且因此进一步提高生产经济。在本发明的方法中，其中成熟双链胰岛素类似物可直接以高产量从培养液体培养基中分离出来，需要更少的下游加工步骤来生产纯度足够于药物用途的产品。除了稳定化胰岛素分子中的螺旋结构的修饰外，用本发明的方法生产的胰岛素类似物还可以在A-和或B-链的特定位置进行修饰。因此，B28位的氨基酸残基可以是Asp。在另一组胰岛素类似物中，Bl位的氨基酸残基已缺失。该组胰岛素类似物的具体例子是desBl人胰岛素。在另一组胰岛素类似物中，B30位的氨基酸残基已缺失。在另一组胰岛素类似物中，B28位的氨基酸残基是Lys且B29位的氨基酸残基是Pro。在另一组胰岛素类似物中，A18位的氨基酸残基可以是Gln,且在又一种实施方案中，A21位的氨基酸残基可以是Gly。编码胰岛素前体类似物的DNA序列可以是基因组或cDNA起源的，例如可以是通过制备基因组或cDNA文库以及利用根据标准技术(参见，i^H口,Sambrook,J,Fritsch,EF禾口Maniatis,T,Mo/ecw/orC7om力g.'爿丄aZ)ora/o,少Mz聰a/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,1989)合成的寡核普酸探针杂交筛选编码全部或部分多肽的DNA序列来获得的。编码胰岛素前体的DNA序列也可以用确定的标准方法合成制《寻,侈'H口,Beaucage和Caruthers,7Wra/zet/rawZ^〃era22(-1869所述的亚磷酰胺(phosphoamidite)方法，或由Matthes等人，￡"MSOJow"a/3(—805所述的方法。DNA序列还可以用具体引物通过聚合酶链反应制备，例如US4,683,202或Saiki等人，Sc/e"ce239(—491中所述的。可将DNA序列插入任何可经历重组DNA程序的载体中，且载体的选择通常将依赖于其所将导入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖染色体的复制，例如质粒。作为选择，该载体可以是当其被导入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。载体优选为其中编码胰岛素前体的DNA序列与DNA转录所需的其它部分，比如启动子，可操作地连接的表达载体。该启动子可以是任何在所选的宿主细胞中显示出转录活性的DNA序列，并且可衍生自编码该与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。适于在酵母宿主细胞中使用的启动子的例子包括来自酵母糖酵解基因(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.255(—12080;Alber和Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1(4)或醇脱氢酶基因(Young等人,inGeneticEngineeringofMicroorganismsforChemicals(Hollaender等人，eds.),PlenumPress,NewYork,1982)的启动子、或TPI1(US4,599,311)或ADH2-4c(R画11等人，Nature304(4)启动子。如果必需的话，编码胰岛素前体的DNA序列还可以是与适宜的终止子、多腺苷酸化信号、转录增强子序列和翻译增强子序列可操作地连接的。本发明的重组载体还可含有使载体能够在正被讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。为指导胰岛素进入宿主细胞的分泌途径，可向重组载体提供分泌信号序列(也已知为前导序列、前序列原或前序列)。该分泌信号序列以正确的读框与编码胰岛素前体的DNA序列相连。分泌信号序列通常定位于编码肽的DNA序列的5'。信号肽可以是天然存在的信号肽、或其功能性部分，或者它可以是合成肽。为了在酵母中有效分泌，也可将编码前导肽的序列插入信号序列下游和编码胰岛素前体的DNA序列的上游。被导入DNA序列或重组载体的酵母宿主细胞可以是任何能够表达胰岛素前体的酵母细胞，且包括糖酵母属物种(S"cc/^ram，yc^w/.)或裂殖糖酵母属物种(Sc/nzoyacc/zaram^c^),尤其是菌林啤酒糖酵母或克鲁弗利氏糖酵母(S"cc/"raw;/c^/Ww少veh)。其它的适宜酵母细胞的例子是菌抹克鲁维氏酵母属(《/z^vwomyc^)，比如乳克鲁维氏酵母(I./ac〃力，汉逊氏酵母属(/a朋e"w/a),例如多形汉逊氏酵母(7/./omor;7/2a)或毕赤氏酵母属CPzc/na),例如，巴斯德毕赤氏酵母(尸./"Wo^)(cf.Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132,1986,pp.;US4,882,279)。用异源DNA转化酵母细胞和从其生产异源多肽的方法描述于例如US4,599,311、US4,931,373、US4,870,008、5，037,743和US4,845,075。所转化的细胞通过由选择标记确定的表型来选择，所述表型通常是药物抗性或在无特定营养物(例如亮氨酸)存在下生长的能力。在酵母中使用的优选载体是在US4,931,373中公开的P0T1载体。本发明的方法是所谓的发酵法。该发酵优选在无菌搅拌罐中进行，所述搅拌罐带有添加由空气、氧和氨组成但不限于此的压缩无菌气体的供应线。发酵罐可包含用于监控pH、温度、压力、搅拌速率、溶解氧水平、液体含量、泡沫水平、物料添加速率以及酸和碱添加速率的设备/传感器。温度可以在约25至约35、约26至约31、或约26至约29。C范围内。pH将在约4.0至约6.8或约5.0至约6.5范围内。控制搅拌以确保最小溶解氧浓度为最小5%饱和。此外，发酵罐可装备有监控细胞密度水平、不考虑其物理-化学形式的代谢物和产物浓度的光学设备。利用对气体进入和气体排出发酵罐的气体分析来监控挥发性化合物的形成和消耗。所有监控的变量的信号可用于控制目的，从而允许将这些变量维持在预定范围内或者根据关于时间预定的概况持续变化。作为选择，响应于来自其它监控的变量的信号变化来控制变量。溶材料形式或以包括聚集材料在内的;溶材料形式的细胞内材;牛存^:产物的形成是组成型的或者诱导的，且依赖于或不依赖于微生物生长。发酵过程在工作体积为100mL至200.000L范围内的罐内实施。发酵过程可以作为分批过程、补料分批过程、重复补料分批过程或连续过程操作。发酵过程中所使用的培养细胞的培养基可以是任何适于生长宿主细胞的常规培养基，比如基本培养基或含有适当补料的复合培养基。适宜的培养基可获自商业提供者，或者可以根据已公开的配方(例如，在美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)目录中的)制备。因此该培养基将包含至少一种碳源，一种或几种氮源，包括钾盐、钠盐、镁盐、磷酸盐、硝酸盐和硫酸盐在内的必需的盐，痕量金属，水溶性维生素，加工助剂，包括但不限于蛋白酶抑制剂、稳定剂、配体、消泡剂和诱导物。培养基可包含在包括加热灭菌在内的一些操作条件下在液体培养基中部分沉淀或分散的组分。培养基可通过将几种液体和气溶体混合来制备。这些溶液可以在进入发酵罐之前混合，或者它们可以作为分开的液体流以预定比率供应入发酵罐中。不同的培养基组分液体溶液之间的比率可在发酵过程的不同阶段发生变化，这意味着培养基总组成可以在发酵过程期间变化。适宜的发酵培养基可包含20至60mM的PO^盐，50至70mM的K+，20至35mM的S042-，4至6mM的Na+,6至13mM的Mg2+,0.5至1.5mM的Mn2+,0.02至0.04mM的Cu2+,0.1至0.3mM的Fe2+,0.01至0.05mM的Zn2+,痕量Co、Mo和Ni，作为复合氨基酸源的部分添加，1至40g/L的酵母提取物，选自m-肌醇(100至250mg/L)、泛酸钓(2至20mg/L)、盐酸硫胺素(0.5至20mg/L)、吡。多醇(0.2至20mg/L)、烟酸烟酰胺(2至7mg/L)、生物素(0.03至0.8mg/L)、柠檬酸二氬胆碱(0.1至0.2mg/L)的维生素，比如柠檬酸这样的配体，H20(0.5至7g/L)和作为碳源的葡萄糖(50至200g/L)。以400至1800mM的量持续加入作为气体NH3或液体NH4OH的氮。以自来水作为天然钓和cr源。之后可以通过常规方法从培养基中回收由细胞生产的肽，所述常规方法包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，借助盐(例如硫酸铵)从上清液或者滤液中沉淀蛋白质组分，依赖于正被讨论的蛋白的类型用多种层析法纯化，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。胰岛素或胰岛素类似物从培养液体培养基中分离出来之后可以，例如通过酰化尤其是B29Lys残基的s-氨基基团，转化为酰化形式。对胰岛素的酰化方法是本领域熟知的，且公开于例如，EP专利792,290和894,095以及美国专利号5,693,609、5,646,242、5,922,675、5,750,497和6,011,007。酰化胰岛素的例子为N出"-十四烷酰des(B30)人胰岛素、N孤、石胆酰(lithocholoyl)-丫-谷氨酰des(B30)人胰岛素、NsB29—(Na-(HOOC(CH2)14CO)-Y-Glu)des(B30)人胰岛素或NsB29—(Na-(HOOC(CH2)16CO)-，Glu)des(B30)人胰岛素。"desB30"或"B(l-29)"意指缺乏B30氨基酸残基的天然胰岛素B链，B(l-30)意指人胰岛素的天然B链，且"A(1-21)"意指天然胰岛素A链。A18Q人胰岛素是在人胰岛素A-链A18位为Gln的胰岛素类似物。B10E、A8H、A14E分别是B10位为Glu、A8位为His及A14位为Glu的胰岛素类似物。"B1"、"A1"等分别意指胰岛素B链1位(从N末端开始计数)的氨基酸残基以及胰岛素A链1位(从N末端开始计数)的氨基酸残基。具体位置的氨基酸残基还可用例如，PheW表示，其意指B1位的氨基酸残基为苯丙氨酸残基。"C-肽"意指将胰岛素分子的A-和B-肽链连接在一起的肽序列，包括各末端的切割位点。"连接肽"分别意指与A-和B-链各接点处的两个切割位点之间的肽序列。"成熟人胰岛素类似物"意指具有与天然人胰岛素分子相同结构构象的活性双链胰岛素类似物，例如，在Cys"和CysB7以及Cys扁和CysB19之间带有二硫键，以及在Cys^和CysA"之间带有内部二硫键，但是与相应位置的天然氨基酸残基相比，在A和/或B-链的一个或多个位置带有特定的突变。本文所使用的"胰岛素类似物"意指多肽，其具有形式上可通过缺失和/或取代至少一个存在于天然胰岛素中的氨基酸残基和/或通过添加至少一个氨基酸残基，源自天然存在的胰岛素(例如人胰岛素)结构的分子结构。所添加和/或取代的氨基酸残基可以是可编码氨基酸或其它天然存在的氨基酸残基或纯合成的氨基酸残基。与人胰岛素相比，胰岛素类似物通常将不包含超过约7个突变，更一般不超过5个且甚至更一般最多3个突变。胰岛素类似物可以是这样的，其中B链28位可以从天然的Pro残基修饰为Asp、Lys或Ile。B29位的Lys还可以修饰为Pro。而且，A21位的Asn可修饰为Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val,尤其是Gly、Ala、Ser或Thr，且尤其是Gly。此外，B3位的Asn可修饰为Lys或Asp。胰岛素类似物的其它例子是des(B30)人胰岛素，其中Bl和B2中的一个或者二者均被缺失的胰岛素类似物；其中A-链和/或B-链具有N-末端延伸的胰岛素类似物和其中A-链和/或B-链具有C-末端延伸的胰岛素类似物。其它胰岛素类似物是这样的，其中B26-B30中的一个或多个已被缺失。本文中所使用的"胰岛素衍生物"意指已经过化学修饰的天然存在的胰岛素或胰岛素类似物，例如，通过向胰岛素主链中的一个或多个位置导入侧链，或通过氧化或还原胰岛素中氨基酸残基基团，或将游离氨基基团或羟基基团酰化。"Kex2"意指优先催化在两个碱性残基(赖氨酸或精氨酸)序列后切割的枯草杆菌蛋白酶样内切蛋白酶(Rockwell,NC，Krysan，DJ，Komiyama,T&Fuller,RS2002PrecursorProcessingbyKex2/FurinProteases.Chem.Rev.102:)。"Kexl"意指优先催化去除C-末端赖氨酰和/或精氨酰残基的丝氨酸羧肽酶(ShiltonBH,ThomasDY,CyglerM1997CrystalstructureofKexldeltap,aprohormone-processingcarboxypeptidasefrom5"acc/^o，cescerev^z'ae.Biochemistry36:)。"Ypsl，，意指在缺乏天然前a交配因子(pro-alpha-matingfactor)加工酶Kex2的酵母突变体中部分抑制前a交配因子加工缺陷的天冬氨酰蛋白酶(Egel-Mitani等人，Yeast6，1990，pp.127-137)。"正确加工的"意指在所需切割位点酶切，从而得到具有正确氨基酸残基序列的所需产物。"尸Or，是粟酒裂殖糖酵母丙糖磷酸异构酶基因，且"77V/"是啤酒糖酵母丙糖磷酸异构酶基因。术语"信号肽"被理解为意指在蛋白质前体形式中作为N-末端序列存在的前-肽。信号肽的功能是使异源蛋白能够容易地转运到内质网中。信号肽通常在该加工过程中被切除。信号肽可以是与产生蛋白质的宿主生物异源或同源的。丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是获自米曲霉(J^wg"/MoO^ae)TAKA淀粉酶基因、黑色曲霉(A^erg/〃wmgw)中性淀粉酶基因、米黑根毛霉(i^/zomwcorw/e/^)天冬氨酸蛋白酶基因、柔毛腐质霉(//wm/co/a/cmwgwoM)纤维素酶或脂肪酶基因、或米黑根毛霉脂肪酶或蛋白酶基因、曲霉属物种(Ay/erg/〃wsp.)淀粉酶或葡糖淀粉酶、编码米黑根毛霉脂肪酶或蛋白酶的基因的信号肽编码区。信号肽优选源自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑色曲霉中性a-淀粉酶、黑色曲霉酸稳定淀粉酶或黑色曲霉葡糖淀粉酶的基因。可用于酵母宿主细胞的有用信号肽获自啤酒糖酵母a-因子和啤酒糖酵母转化酶基因。可与本发明的DNA构建体使用的许多信号肽包括酵母天冬氨酸蛋白酶3(Ypsl)信号肽或其任何功能类似物(Egel-Mitani等人(1990)YEAST6:127-137和US5,726,038)和MFa/基因的a-因子信号(Thorner(1981)inTheMolecularBiologyoftheYeastSacc/zfaromvcesStrathern等人，eds.,pp143-180,ColdSpringHarborLaboratory,NY和US4,870,008,小鼠唾液淀粉酶信号肽(参看O.Hagenbuchle等人,Nature289,1981,pp.643-646)、修饰的叛肽酶信号肽(参看L.A.Vails等人，Cell48，1987,pp.887-897)和酵母BAR1信号肽(参看WO87/02670)。术语"前-肽，，意指多肽序列，其功能为允许将所表达的多肽从内质网导向高尔基体并进一步导向分泌小泡以分泌进入培养基(即，多肽穿过细胞壁或至少穿过细胞膜输出到酵母细胞的周质间隙内)。前肽可以是酵母a-因子前肽，参见US4,546,082和4,870,008.作为选择，前肽可以是合成前肽，也就是说自然界中未曾发现的前肽。适宜的合成前肽是US5,395,922、5，795,746、5,162，498、WO89/02463、WO92/11378和WO98/32867中公开的那些。本发明的多核苷酸序列还可以是混合基因组、cDNA和合成来源的。例如，可将编码前导肽的基因组或cDNA序列与编码A和B链的基因组或cDNA序列相连，之后可以才艮据熟知的方法，通过插入用于同源重组的编码所需氨基酸序列的合成寡核苷酸或优选用适宜的寡核香酸通过PCR产生所需序列，对该DNA序列进行位点修饰。本发明包括载体，所迷载体能够在所选择的微生物或宿主细胞中复制的载体，且带有编码本发明的胰岛素前体的多核苷酸序列。该重组载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖染色体的复制,例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含任何确保自我复制的工具。作为选择，该载体可以是当其被导入宿主细胞时整合到基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单个载体或质粒、或者两个或更多个共同包含全部将被导入宿主细胞基因组中的DNA的载体或质粒、或转座子。载体可以是线性或闭环质粒，且优选将包含允许载体稳定整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。在一种实施方案中，重组表达载体能够在酵母中复制。能够使载体在酵母中复制的序列的例子为酵母质粒2nm复制基因REP1-3和复制起点。载体还可包含选择标记，例如，产物补偿宿主细胞缺陷的基因或赋予药物抗性的基因，所述药物例如氨千青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨曱蝶呤。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括am必(乙酰胺酶)、(鸟氨酸氨曱酰基转移酶)、/,G(乳清酸核苷-5，-磷酸脱羧酶)和(邻氨基苯甲酸合酶。用于酵母宿主细胞的合适标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。酵母优选的选择标记是粟酒裂殖糖酵母TPI基因(Russell(1985)Gene40:125-130)。载体中，多核苷酸序列与适宜的启动子序列可操作地连接。该启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂交的启动子，而且可获自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。在丝状真菌宿主细胞中指导转录的适宜启动子的例子是获自米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑色曲霉中性ot-淀粉酶、和黑色曲霉酸稳定a-淀粉酶基因的启动子。在酵母宿主中，有用的启动子是哞酒糖酵母MFal、TPI、ADH或PGK启动子。本发明的多核苷酸构建体通常也与适宜的终止子可操作地连接。酵母中适宜的终止子是TPI终止子(Alber等人，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:419-434)。用于分别连接编码胰岛素前体的DNA序列、启动子以及任选地终止子和/或分泌信号序列，以及把它们插入包含复制所必需信息的适宜载体的方法，是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork,1989)。可以理解，可以通过首先制备包含编码本发明胰岛素前体的完整DNA序列的DNA构建体，和随后将该片段插入适宜的表达载体中，或通过连接前顺序插入包含各元件(比如信号、前肽、经过修饰的C-肽、A和B链)遗传信息的DNA片段，来构建载体。本发明还涉及含有编码本发明胰岛素前体的多核苷酸序列的重组真菌细胞。如前述，将含有这样的多核苷酸序列的栽体导入宿主细胞中，从而该载体作为染色体整合体或作为自我复制的染色体外载体维持。术语"宿主细胞"包含亲本细胞的由于复制过程中发生突变而导致与亲本细胞不相同的任何子代。本发明中所使用的宿主细胞是真菌细胞。本文所使用的"真菌"包括子嚢菌门(爿scowycoto)、4旦子菌门(Sas/Aowyco^r)、壶菌门(C7^f"Womycoto)和4妻合菌门(Zygowycoto)(长口Hawksworth等人,Jz>wwoW/2awt/5&^y、Z)z'c/v'ow(3^yo/77zeFwwgz',8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定义的)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人,1995,同上，第171页所引述的)以及所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995,同上)。在一种实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。本文所使用的"酵母"包括产子嚢酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担孢子(basidiosporogenous)酵母和属于半知菌的酵母(芽孢纲(Blastomycetes))。产子嚢酵母分作蚀精霉科(S戸歸/雄謹c騰)和糖酵母科(S"cc/zaramyc"aceae)。后者包含四个亚科，裂殖糖酵母亚科(Sc/^o^cc/wTOmycoWeae)(*如，粟酒裂殖糖酵母属(Sc/n'zosacc/zaromyc^))、拿逊氏酵母亚禾牛(TW/^isom'o/c/eae)、油月旨酵母亚科(丄—mycoz'(ieae)和糖酵母亚科(Sacc/z"r謹少co油ae)(辨如，毕赤氏酵母属(尸/c/na)、克鲁维氏酵母属(《/t(yvwomyc^)和糖酵母属(5""cc/artwy/ce《))。产4旦孑包子酵母包4舌丄ewcay/o〃'6^'w、纟工冬孑包属(i^^/os;wn力wm)、锁掷酵母属(S/onJ/oZw/w)、线黑粉酵母属(Fz7o^w,Wwm)和线黑粉菌属(F歸認c/幽)。属于半知菌的酵母分作两个科,掷孑包酵母科(iS/wo6o/蘭ycetocefle)(伊/如，5VraZ)o/簡yc^和布氏弹孢酵母属(Sw〃era))和隐球酵母科(07ptococcaceae)(*如，假丝酵母属(Om&^))。由于酵母分类将来可能发生变化，所以为了本发明的目的，酵母应4姿照5Zo/ogy爿c"W""o/(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.，和Davenport,R.R.，eds,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)所述的进行定义。酵母的生物学和酵母遗传学操作是本领域熟知的(参见，辨如，^oc/zem/W^a"c/GewWcso/Teos"Bacil,M.，Horecker,B丄和Stopani，A.O.M.编，笫二版，1987;r/zer^w",Rose,A.H.，和Harrison,J.S.编，第二版，1987;以及T7zeM/ecw/arWo/ogy/7ze7ea>stSacc/zaramycM,Strathern等人编，1981)。酵母宿主细胞可选自假丝酵母属、克鲁维氏酵母属、糖酵母属、裂殖糖酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊氏酵母属、耶罗威亚酵母属()^TOW/")的物种的细胞。在一种实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔斯伯糖酵母(Sacc/zarom少c^ccjrAs"^ge腦's)、啤酒糖酵母(5^cc/7(ar函yc^cereWw'ae)、糖化糖酵母(5^cc/zar麵少cesdz'(^Wcz^)、iSacc/z"r讓Fes(iowgAxs7'/、克鲁弗利氏冲唐酵母(Sacc/^rw^yces^:/wyven')、Sacc/an7附yceswor6e服'A、卵形糖酵母(S"cc/z(3r纖yc^ovz》nm、)、粟酒裂殖糖酵母(Sc/z/zas^cc/^omyces/麵6e)、葡萄汁糖酵母(5V7cc/zor謂ycesmw麵)、克鲁弗利氏毕赤氏酵母(尸纟c/na^^veh)>解脂耶罗威亚酵母(7amw/a/0。/jw7ca)、产朊假丝酵母(OmoWaw"fe)、可可假丝酵母(Ca"c/,Wa)和发酵性丝孢酵母(GeoiWc/zwm/erme"to朋)。其它可用的酵母宿主细胞是乳克鲁维氏酵母(A7w"eramyc^/acto)、脆壁克鲁维氏酵母(^"—veromyces/rag〃/s)、多形汉逊氏酵母(//(mye"w/a/o/，or//za)、巴斯德毕赤氏酵母(尸/c/z/a/^Won^)、解脂耶罗威亚酵母(/—一ca)、粟酒裂殖糖酵母(Sc/n'm^"cc/2(ar謹jA^p謂6e)、f/幼7go、麦芽糖假丝酵母(Ca"力Wam"/to化)、季也蒙氏毕赤氏酵母(尸/c/n'agw/〃ermowc/〃)禾口尸/c/n'"me//zawo//o/(参看Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132,1986,第页；US4,882,279和US4,879,231)。在一种实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。"丝状真菌"包括真菌门(五wmycoto)和卵菌门亚类的所有丝状形式(如Hawksworth等人所定义的，1995,见前述)。丝状真菌的特征在于，由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的营养菌丝体。丝状真菌宿主细胞可选自支顶孢属(Jc"momw附)、曲霉属(^4^erg"/uy)、镰孢属(Fw^nwm)、腐质霉属(//w,mco/a)、毛霉属(Mwco"、毁丝霉属(A^ce/Zop/^/zorat)、《连孑包霉属(iVewros/9on3)、青霉属(尸em'cz〃zwm)、草根霉属(T7^/av^)、弯颈霉属(7W;^oc/a力wm)和木霉属(7Wc/zc^e/7wa)。"可编码氨基酸"或"可编码氨基酸残基"这一表达用于表示可由核苷酸三联体(密码子)编码的氨基酸或氨基酸残基。本发明上下文中，氨基酸三字母或单字母表示法以下表中所示的常规的含义使用。除非明确指明，本文所提到的氨基酸是L-氨基酸。此外，除非另外说明，肽的氨基酸序列的左右末端分别为N-和C-末端。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>发酵意指增殖浸没在液体培养基中的微生物的无菌过程。发酵优选在无菌搅拌罐中进行，所述搅拌罐带有添加由空气、氧和氨组成但不限于此的压缩无菌气体的供应线。发酵罐可包含用于监控pH、温度、压力、搅拌速率、溶解氧水平、液体含量、泡沫水平、物料添加速率以及酸和碱添加速率的设备/传感器。此外，发酵罐可装备有监控细胞密度水平、不考虑其物理-化学形式的代谢物和产物浓度的光学设备。利用对气体进入和气体排出发酵罐的气体分析来监控挥发性化合物的形成和消耗。所有监控的变量的信号可用于控制目的，从而允许将这些变量维持在预定范围内或者根据关于时间预定的概况持续变化。作为选择，响应于来自其它监控的变量的信号变化来控制变量。发酵过程中所生产的所需产物以可溶性细胞外材料存在，或者以可溶材料形式或以包括聚集材料在内的不溶材料形式的细胞内材料存在。产物的形成是组成型的或者诱导的，且依赖于或不依赖于微生物生长。发酵过程在工作体积为100mL至200.000L范围内的罐内实施。发酵过程可以作为分批过程、补料分批过程、重复补料分批过程或连续过程操作。分批过程意指，在将微生物加入罐中之前发酵罐中含有无菌培养基的发酵。在该过程期间，自动或手工加入酸、碱、消泡剂、抑制剂、稳定剂和"i秀导物。酸和石咸以'液体溶'液或气体组分加入。这些《且分可通过一条补料线加入，或者它们可以在分离的线中供应于发酵罐。发酵过程期间，为了分析目的仅取出发酵罐内容物。在发酵过程结尾收获发酵罐中的所有内容物。然而，对于连续分批过程，仅部分收获发酵罐中的内容物，并用新鲜无菌培养基重新填充发酵罐，从而允许发生另一批发酵。补料分批过程是在加入微生物之前仅向发酵罐中填入部分培养基的发酵。将剩余的培养基组分或剩余量的已部分添加的培养基组分作为一次脉沖、作为一系列不连续的脉沖或作为以恒定或可变速率添加的连续流供应给发酵罐。分批过程可以在补料分批过程之前，之后为补料分批操作模式。过程期间加入发酵罐的培养基组分由生长限制组分、微溶组分、挥发性组分或在液体环境中稳定性有限的组分组成但不限于此。微生物的生长速率可通过速率调节来控制，通过此调节来向发酵罐中添加培养基组分。在该过程期间自动或手工加入酸、碱、消泡剂、抑制剂、稳定剂和诱导物。酸和^咸以液体溶液的部分或气体组分加入。补料分批过程期间，所有组分可通过一条补料线加入，或者它们可以在分离的线中供应于发酵罐。补料分批过程期间，为了分析目的仅取出发酵罐内容物。在过程结尾收获发酵罐中的所有内容物。补料分批过程的一种变化方式是重复补料分批过程(Repeated-Fed-batchprocess)。重复补料分批发酵的实施类似于补料分批过程，但是在过程期间一次或几次取出部分发酵罐内容物。部分取出发酵罐内容物后可加入新鲜培养基。新鲜培养基加入后在重新开始补料分批过程操作之前可接着分批过程。新鲜培养基的组成以及补料分批过程期间加入的培养基无需相同。连续过程意指，在加入微生物以及发酵开始之前向罐中加入一些培养基的发酵。连续加入含有生长所必需的所有培养基组分以及抑制剂、诱导物、消泡剂、酸、碱和稳定产物的组分的新鲜培养基。这些组分可以通过一条补料线加入，或者它们可以在分离的供应线中向发酵罐供应，以提高所使用的培养基的稳定性或提高其品质。酸和碱作为液体溶液的部分抑或作为气体组分加入。所有组分作为一系列不连续的脉沖或作为以恒定或可变速率添加的连续流加入发酵罐。为将发酵罐内容物维持在预定范围内，连续收获发酵罐的内容物。微生物的生长可通过向发酵罐中添加培养基的速率以及调节发酵罐内容物来控制。培养基意指包含下述的液体溶液，至少一种碳源，一种或几种氮源，包括钾盐、钠盐、镁盐、磷酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐在内的必需盐，痕量金属，水溶性维生素，加工助剂，包括但不限于蛋白酶抑制剂、稳定剂、配体、消泡剂和诱导物。培养基可包含，在包括加热灭菌在内的一些操作条件下，在液体培养基中部分沉淀或分散的组分。可通过将几种液体和气溶体混合来制备培养基。这些溶液可以在进入发酵罐之前混合，或者它们可以作为分开的液体流以预定比率供应入发酵罐中。不同这^味j培养基总组成可以在发酵i程期间变化。下、丄包含不同培养基组分的浓度范围列表。这些浓度以所加入的培养基组分总量除以发酵罐中初始培养基体积来计算。连续培养的培养基浓度以进入发酵罐中的培养基中的浓度包括在其中。下表是对发酵培养基的一般组分的评论。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>含有本发明胰岛素类似物的药物组合物可用于治疗对胰岛素敏感的状态。因此，它们可用于治疗1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症，例如有些时候可以在严重受伤者和做了重大外科手术的人中看到的。对任何患者的最佳剂量水平将依赖于多种因素，包括所使用的具体胰岛素衍生物的效力、患者年龄、体重、身体活性以及饮食、与其它药物的可能组合以及所治疗的状态的严重程度。推荐由本领域技术人员以类似于已知胰岛素组合物的方式来确定本发明胰岛素衍生物对各单独患者的曰剂量。胰岛素类似物的药物组合物将包含通常的佐剂和添加剂，且优选配制成水溶液。例如，使用氯化钠、乙酸钠或甘油将水性培养基制成等渗的。此外，水性培养基可包含锌离子、緩沖液和防腐剂。可将组合物的pH值调至所需值，且其可为约4至约8.5。在本发明的一种实施方案中，制剂的pH选自2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9和10.0。药物组合物将包含一种或多种适于稳定、保存或等渗性的试剂这样的通常的佐剂，例如，锌离子、酚、甲酚、对羟基苯曱酸酯(parabene)、氯化钠、甘油或甘露糖醇。药物中所使用的緩冲液可选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、和三羟曱基氨基曱烷、,二(羟乙基)甘氨酸、#-[2-羟-1,1-二羟曱基乙基]甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。药学可接受防腐剂可选自酚、邻甲酚、间甲酴、对曱盼、对羟基苯曱酸曱酯、对羟基苯曱酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、节醇、氯代丁醇、和乙基汞硫代水杨酸钠(thiomerosal)、溴硝丙二醇(bron叩ol)、安息香酸、咪唑烷脲(imidurea)、氯己定、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯曱酸乙酯、氯化卡乙氧铵、氯酚醚(3对氯苯氧基丙烷-l,2-二醇)或其混合物。在本发明的又一种实施方案中，防腐剂以0.1mg/ml至20mg/ml的浓度存在。在本发明的又一种实施方案中，防腐剂以O.lmg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的又一种实施方案中，防腐剂以5mg/ml至10mg/ml的浓度存在。在本发明的又一种实施方案中，防腐剂以10mg/ml至20mg/ml的浓度存在。这些具体的防腐剂的每一种构成本发明的一种替代实施方案。药物组合物中的防腐剂的使用是本领域技术人员熟知的。为方便起见，可参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第19版,1995。等渗剂可选自盐(例如，氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如，L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(例如，甘油、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)聚乙二醇(例如，PEG400)或其混合物。可以使用任何糖，比如单糖、二糖或多糖、或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、普鲁分支葡聚糖、糊精、环糊精、可溶淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一种实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇的定义是，具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，且包括例如，甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一种实施方案中，糖醇添加剂是甘露糖醇。上述糖或糖醇可单独或组合使用。对于用量没有固定的限制，只效果产生不利作用。在一种实施方案中，糖或糖醇浓度为约1mg/ml至约150mg/ml。在本发明的又一种实施方案中，等渗剂的存在浓度为1mg/ml至50mg/ml。在本发明的又一种实施方案中，等渗剂的存在浓度为1mg/ml至7mg/ml。在本发明的又一种实施方案中，等渗剂的存在浓度为8mg/ml至24mg/ml。在本发明的又一种实施方案中，等渗剂的存在浓度为25mg/ml至50mg/ml。等渗剂在药物组合物中的使用是本领域技术人员熟知的。为方便起见，可参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。本文中所引述的所有参考文献，包括公开出版物、专利申请和专利，均全文引入本文作为参考，且程度如同各参考文献单独或具体指明引入本文作为参考，且全文引入本文(至法律所允许的最大程度)。本文所使用的所有标题和副标题仅为方便而使用，且不应当理解为以任何方式限制本发明。本文中所提供的任何和所有实施例、或例举式语言(例如，"比如......这样的")的使用仅意欲更好地阐述本发明，且不限制本发明的范围，除非另外声明。本发明说明书中的任何语言均不应当被解释为将任何非请求保持的要素视为对于本发明的实践来说关键的。的专利文献的有效性、可专利性和/或可实施性的任何观点。如适用的法律所允许的，本发明包括对本文所附权利要求书中所述主题的所有改变或等同方案。实施例通用程序所有表达质粒均为C-POT型，类似于EP171,142中所描述的那些。这些是基于2p的表达载体，其特征在于包含粟酒裂殖糖酵母丙糖磷酸异构酶基因(POT)以在啤酒糖酵母中选择和稳定质粒。这些质粒还包含啤酒糖酵母丙糖磷酸异构酶启动子和终止子序列。这些序列类似于质粒pKFN訓3(描述于WO9010075)中的相应序列。通过转化宿主菌株哞酒糖酵母菌株MT663或ME1719制备酵母转化体。酵母菌抹MT663(MATa/MATapep4-3/pep4-3HlS4/his4Atpi::LEU2/Atpi::LEU2Cir')与申请WO关联，保藏于DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen,且所得保藏号为DSM6278。啤酒糖酵母菌抹ME1719(MATa/aleu2/leu2pep4-3/pep4-3Atpi:丄EU2/Atpi::LEU2Aura3/Aum3Aypsl::URA3/Aypsl::ura3Cir十)描述于WO98/01535。MT663或ME1719在YPGaL(1%细菌用酵母提取物，2%细菌用蛋白胨，2%半乳糖，1%乳酸)上生长至600nm处O.D.为0.6。通过离心收获100ml培养物，用10ml水洗涤，再次离心并重悬于10ml含有1.2M山梨糖醇、25mMNa2EDTApH二8.0和6.7mglml二硫苏糖醇(d池iotreitol)的溶液中。30°C下温育该悬浮液15分钟，离心，并将细胞重悬于10ml含有1.2M山梨糖醇、10mMNa2EDTA.0.1M柠檬酸钠、pH05.8和2mgNovozymC3234的溶液中。将悬浮液在30。C下温育30分钟，通过离心收集细胞，在10ml1.2M的山梨糖醇和10mlCAS(1.2M山梨糖醇，10mMCaCl2,10mMTrisHC1(Tris=三(羟曱基(-氨基甲烷)pH:7.5)中洗涤，并重悬于2mlCAS中。为进行转化，将1mlCAS-悬浮的细胞与约0.1mg质粒DNA混合，且在室温下放置15分钟。加入1ml(20%聚乙二醇4000，10mMCaCl2,10mMTrisHC1，pH=7.5),并将混合物在室温下再放置30分钟。离心混合物，将沉淀重悬于0.1mlSOS(1.2M山梨糖醇，33%vlvYPD,6.7mMCaCl2)中并于30。C温育2小时。之后离心悬浮液并将沉淀重悬于0.5ml的1.2M山梨糖醇中。之后，于52。C下加入6ml的上层琼脂(Sherman等人，(1982),MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratory的SC培养基(含有1.2M山梨糖醇加2.5%琼脂))，之后将悬浮液倒入含有相同的琼脂固化的含山梨糖醇培养基平板顶部上。实施例1构建Al8Q-胰岛素的酵母表达系统图1显示名为pSA50的酵母质粒。该质粒含有表达盒，该表达盒包含插入到质粒的哞酒糖酵母TPI基因的转录启动子和转录终止子之间的五coRI—X6al片段。在质粒pSA50中，五coRI-X6al片段编码由MFal*前前导序列原、二元加工内肽酶KEX2的Lys-Arg切割位点、和胰岛素前体B(l-30)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q组成的融合产物。按照下述构建包含编码胰岛素前体B(l-30)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q的序列的DNA片段。将2.5pmol寡核普酸ASA-SCI-2(对应于图2中的序歹'j)和SCI-kex2-3(对应于图2中的序列——反向引物)混合入含有10X高保真緩沖液、2.5mMdNTP、1^1高保真聚合酶和76nlH20的PCR反应物中。一个循环(94。C下30秒，50。C下30秒，72。C下l分钟)后，加入100pmol寡核苷酸ASA-SCI1(对应于图2中的)和ASA誦SCI-7(对应于序列——反向引物)后进行如上的9个循环。所得PCR片段用Roche的PCR纯化试剂盒纯化，用Ncol和Xbal消化，并最终在琼脂糖凝胶上跑电泳并用GFX-PCR凝胶带纯化试剂盒(AmershamBiosciences#27-9602-01)纯化。将片段与来自上述("通用程序")C-POT型表达载体的Ncol-Xbal载体片段相连。使表达质粒在大肠杆菌中增殖，在存在氨千青霉素的条件下生长，并用标准技术分离(Sambrook等人，1989)。利用适宜的限制性核酸酶(例如，EcoRI,M:ol，检查质粒DNA中的插入片段，并通过序列分析显示包含正确胰岛素前体B(l-3O)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q序列(图2)。将质粒pSA50转化入啤酒糖酵母菌抹MT663。通过在YPD(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)琼脂(2%)平板上作为碳源的葡萄糖利用选择携带质粒pSA50的酵母转化体，并将所得菌抹命名为ySA63。实施例2人胰岛素类似物的生产采用与实施例1中所述方法相应的方法制备含编码特定人胰岛素类似物的DNA的质粒。如实施例1所述用质粒转化啤酒糖酵母菌林并分离转化体。所有的胰岛素类似物前体均有C-肽KRDGLGKR(SEQIDN0:9)。将用表达胰岛素类似物的质粒转化的啤酒糖酵母菌抹MT663接种到5ml由以下组成的培养基中5g/L(NH4)2S04、184mg/L(NH4)2HP04、2.88g/LKH2P04、1.42g/LMgS047H20、1.28g/L、K2S04、10.00g/L琥珀酸、10.00g/L水解酪蛋白氨基酸、0.0112g/LFeS047H20、0.0086g/LMnS04H20、0.0014g/LCuS04.5H20、0.00185g/LZnS047H20、0.0129g/LCaC12.2H20、0.071g/L柠檬酸、28.0mg/Lm誦肌醇、14.0mg/L氯化胆碱、2.8mg/L硫胺素、2.8mg/L烟酰胺、2.1mg/LCa-泛酸、0.14mg/L生物素、0.14mg/L叶酸、40g/L葡萄糖。30。C下培养3天。离心后，取出上清液以进行定量HPLC分析，通过该方法测量分泌的胰岛素类似物浓度。通过LC/MS分析确定胰岛素类似物的特性。产量(mg/1)示于下表<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>实施例3补料分批发酵将表达B(l-30)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q的啤酒糖酵母菌抹ySA63接种到由酵母提取物(Difco):20g/L和蛋白胨(Bacto):10g/L和60g/L葡萄糖和0.1mL消泡剂(PEO/PPO嵌段共聚物)组成的培养基中。加热灭菌前将培养基的pH调至6.5-6.6。将葡萄糖分开灭菌，并加入其余无菌组分中。将200mL培养物(于500mL三角瓶中)于30。C下在定轨摇床上及于250rpm温育16-30小时。将50mL摇瓶培养物转移到含有1.2L由下述组成的生长培养基的发酵罐50g/L液体酵母提取物(50%干物质)、3.6g/LKH2P04、2.3g/LK2S04、1.5g/LMgS04'7H20、0.064g/KFeS04.7H20、0.016g/LMnS04.H20、0.011g/LCuS04.5H20、0.016g/LZnS04'7H20、0.8g/L斗宁檬酸、2g/Lm-肌醇、0.2g/L氯化胆碱、0.2g/L盐酸硫胺素、0.1g/L盐酸吡。多醇、0.2g/L烟酰胺、1g/LCa-泛酸、0.005g/L生物素、0.05g/L对氨基苯甲酸、0.66mL/L消泡剂(PEO/PPO嵌段共聚物)和21g/L葡萄糖。除葡萄糖之外的所有组分均加热灭菌。将葡萄糖单独灭菌且加入发酵罐。30。C下培养，其中pH设定点为5.9,且通气速率为lvvm。通过加入NH40H来使培养基pH保持在调定点。对溶解氧与废气组成(氧、二氧化碳和乙醇)共同进行监控。发酵过程从持续23小时的分批生长阶段开始，该过程中发酵消耗葡萄糖，之后在之前形成的乙醇上进行需氧分批生长。随后，当废气中的乙醇水平开始下降时，开始添加由50%(w/w)葡萄糖组成的物料溶液。物料添加速率遵循图3所示的曲线，包括为将废气中的乙醇水平维持在250ppm以下进行人工调节。在该过程期间，通过测量稀释的发酵样品在600nm处的光密度来监控生长。利用HPLC对样品的胰岛素浓度进行定量，所述样品为用酸性乙醇(552g乙醇、340g去离子水和5mL浓疏酸)以1:1体积比稀释并以xg离心的。计算每升发酵液体培养基中的胰岛素浓度时，包括了对由酵母细胞所占的体积的校正，其中假定沉淀中细胞为菱形包装(rhombicpackaging)。所报告的胰岛素浓度包括完整胰岛素和desB30胰岛素。69小时后停止添加葡萄糖溶液，但在收获产物之前再继续发酵4小时。光密度和胰岛素浓度相对时间作图示于图4，其显示37mg/L发酵液体培养基的最终胰岛素浓度。权利要求1.通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞来制备成熟人胰岛素类似物的方法，其中所述前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。2.根据权利要求l的方法，其中所述切割位点是Kex2切割位点。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述连接肽中对于与A-链接近的切割位点倒数第二位的氨基酸残基选自Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Met、Val、Ala和Phe。4.根据权利要求3的方法，其中所述氨基酸残基选自Leu和Ile。5.根据权利要求1-4的方法，其中所述连接肽的大小为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3画16、3-15、3-14、3画13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4个氨基酸残基。6.根据权利要求1的方法，其中所述胰岛素类似物具有在A8、B10、A18和A14位中至少之一的突变。7.根据权利要求6的方法，其中所述突变选自Asp、Glu、His、Gln和Arg。8.根据权利要求6的方法，其中所述胰岛素类似物B10Glu、A8His、A14Glu人胰岛素。9.根据权利要求1-8的方法，其中该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约50mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。10.根据权利要求1-8的方法，其中该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约80mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。11.根据权利要求1-8的方法，其中该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约100mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。12.根据权利要求1-11的方法，其中所述真菌细胞是酵母细胞。13.根据权利要求l的方法，其中所述人胰岛素前体类似物具有氨基酸序列B(l-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)其中B(l-30)是人胰岛素B-链或其类似物，A(1-21)是人胰岛素A-链或其类似物，各X和各Y各自独立为Lys或Arg或Ypsl位点，且Z为1至约35个氨基酸残基的肽序列，附带条件是人胰岛素A-和/或B-链中至少一个天然氨基酸残基突变为另一个氨基酸残基。14.根据权利要求13的方法，其中Z的大小为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3國9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4个氨基酸残基。15.根据权利要求13的方法，其中X-X和Y-Y均为Kex2位点。16.编码具有以下氨基酸序列的胰岛素前体的DNA序列B(l-30)-X曙X-Z-Y-Y-A(l-21)其中，B(l-30)是人胰岛素B-链或其类似物，A(l-21)是人胰岛素A-链或其类似物，各X和各Y各自独立为Lys或Arg或Ypsl位点，且Z为1至约35个氨基酸残基的肽序列，附带条件是人胰岛素A-和/或B-链中至少一个天然氨基酸残基突变为另一个氨基酸残基。17.含有根据权利要求16的DNA序列的表达载体。18.用根据权利要求17的载体转化的酵母细胞。全文摘要本发明涉及通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞来制备人胰岛素类似物的方法，其中所述前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌大量正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。文档编号C07K14/62GKSQ公开日2008年8月13日申请日期2006年8月15日优先权日2005年8月16日发明者A·S·安德森,L·H·克里斯滕森申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司

专利名称：：蛋白质稳定制剂的制作方法
：本发明涉及用于稳定骨形态发生蛋白(BMP's)的制剂和方法，和涉及处理、存储和重构期间的密切相关的生长和分化因子(GDFs)。更特别的，本发明涉及由海藻糖和在冻干、储存和重构期间保护rhGDF-5的其它赋形剂组成的制剂，包括用作赋形剂以递送rhGDF-5的各种底物。此外，本发明包括制备和使用这些制剂以治疗各种肌骨骼缺陷和疾病的方法。
：生物分子具有三维结构或构型，并且其生物学活性和性质依赖于这种结构。这些生物分子的实例包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白质。这些生物分子对生命必不可少，并且代表了各种医学疾病和病症的治疗中的治疗剂和靶体。蛋白质代表了较宽种类的生物分子。不同种类的蛋白质例如酶、生长因子、受体、抗体和信号分子的生物学活性取决于其构型结构。其它种类的蛋白主要为结构性的，例如胶原和软骨，其本身不具有生物学活性。使生物分子暴露于各种环境中，例如pH、温度、溶剂、渗透度等的变化可能不可逆改变或变性生物分子的构型状态，使其生物学无活性。这些生物分子失活中涉及的某些机制包括聚集、氧化、各种类型的键裂解包括水解和脱酰胺，以及各种类型的键形成，包括交联和其它共价键合，例如二硫键的重排。骨形态发生蛋白和密切相关的生长分化因子(单体和二聚形式)属于TGF-P超家族蛋白质。这类蛋白质包括骨形态发生蛋白系中的成员，通过其诱导异位软骨内骨形成的能力而初始确认(参见Cheng等人，"Osteogenicactivityofthefourteentypesofhumanbonemorphogenicproteins"J.BoneJointSurg.Am.85A:3))。部分这些蛋白质具有其它命名(参见Lories等人，CytokineGrowthFactorRev16:287-98(2005))。这类中的所有成员具有共同的结构特征，包括羧基末端的活性区域，以及成熟长度为约97-106个氨基酸。所有成员具有半胱氨酸残基的高保守模式，其产生3个分子内二硫键和一个分子间二硫键。活性形式可为单个家族成员的二硫键连的同二聚体，或为两种不同家族成员的杂二聚体。(参见MassagueAnnu.Rev.CellBiol.6:957(1990);Sampath等人。J.Biol.Chem.265:);Ozkaynak等人。EMBOJ.9:0);Wharton等人，PNAS88:1);Celeste等人，PNAS87:0);Lyons等人，PNAS86:9)，美国专利US5,011,691和美国专利US5,266,683)。已经证实多种糖能够在溶液中稳定生物分子并且对分离细胞和生物分子产生保护。这些化合物在多种物种中作为冷冻保护剂和渗透压调节剂沿用已久。(参见YanceyJ.Exper.Biol.208:5))。在冻干药物蛋白质的发展过程中，糖(糖类和多元醇)通常加入到制剂中以改善蛋白质的稳定性并延长存储期限。关于糖稳定作用的机理，存在两种主要理论1)糖赋形剂用于稀释固态的蛋白，由此降低蛋白质相互作用并防止分子降解，例如聚合，和2)糖赋形剂提供玻璃状基质，由此使得蛋白质流动性和反应性最小化。在这两个机理中，关键的是糖保持在无定形、与蛋白质接触的状态。各种环境因素例如增加的温度和湿度可能诱导糖的结晶。因此，重要的是使得使用的条件和材料最优化以适于考虑使用的具体生物分子和体系。冻干为通常用于保存生物分子的方法。通常认为冻干比冷冻-融化或很大程度上取决于不同的生物分子和不同的条件，并且各方面研究人员已经研究了不同的体系。水溶液的冷冻导致溶液浓度初始增加，并且对不稳定的化合物来说比冷冻本身更具破坏力。可以加入例如糖、蛋白质、聚合物、緩冲剂和表面活性剂的赋形剂以稳定生物分子的活性，然而取决于体系，具有有限和不同程度的成功。Crowe等人描述了通过糖稳定干燥磷脂双层和蛋白质(Biochem.J.242:1-10(1987)),并且在"Thetrehalosemythrevisited:Introductiontoasymposiumonstabilizationofcellsinthedrystate",Cryobiology43,89-105(2001)中公开了海藻糖稳定细胞机制的最新理解。为了维持有活力和有用的冻干的蛋白质，目前认为存在两种单独和不同的需要1)蛋白质在冷冻过程中必须保护，和2)蛋白质必须在随后的干燥和重构期间保护。这些是不同的需要，没有必要通过任何一种赋形剂或条件的设定来满足。不同研究人员已经报道了使用各种赋形剂来保护各种生物分子，例如Gloger等人(Intl.J.Pharm.260:59-68(2003))公开了使用低分子量右旋糖苷稳定蛋白质对aviscumine的冻干保护，并且表明緩冲体系和聚山梨醇酯80单独适于在冷冻期间保护蛋白质，然而在干燥期间需要右旋糖来保护蛋白质；Goodnough等人(Appl.Env.Biol.58(10:2))研究了使用血清蛋白作为稳定剂和各种其它赋形剂在冻千期间A型肉毒毒素的稳定性，并且报道没有赋形剂具有任何有益的作用，然而通过从冻干混合物中除去NaCl并且控制pH，活性毒素的复原显著提高；Costantmo等人(J.Pharm.Sci.87(11):8))描述了各种糖对冻干的重组人生长激素稳定性和结构的影响，并且表明全部测试的赋形剂显著改善了蛋白质的稳定性；Ramos等人(Appl.Envir.Microbiol.63(10):7))表明2-0-卩-甘露糖基甘油酸酯在保护多种从各种来源分离的脱氢酶中有效，并且对于全部研究的酶，2-0-P-甘露糖基甘油酸酯赋予的保护与海藻糖相似或者优于海藻糖，然而在保护由P.furiosis分离的谷氨酸脱氢酶时并不有效；Brus等人(J.Control.Rel.95:119-31(2004))研究了寡聚核苷酸-聚乙烯亚胺(PEI)络合物进行冻干的稳定性，并且报道了这些络合物没有受益于例如蔗糖或海藻糖的糖类的加入，但质体-PEI络合物则的确受益于这些糖类的加入。根据不同方法在各种生物分子上的测定，这些研究人员报道了不同程度的成功。没有研究人员曾经报道对BMP的保护。因此，对于什么是赋形剂的最佳组合以对生物分子的冻干提供保护存在不一致的证据。没有任何一种赋形剂的组合对全部生物分子都是最佳的，相反需要进行有效程度的实验以得到所研究的生物分子的希望的结果。仍然需要药学上可接受的赋形剂的组合以在冻干、储存和使用期间保护BMP。图1表示实施例6所述的rhGDF-5的海藻糖制剂的DSC曲线。所述制剂为冻干海藻糖+GDF-5，其中实施例6-rhGDF-5浓度0.5毫克/瓶，赋形剂浓度50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。其中冻干制剂使用水重构。最终浓度为0.33毫克/毫升蛋白质+3.3%海藻糖。图2表示实施例7所述的rhGDF-5的甘露醇制剂的DSC曲线。所迷制剂为冻干甘露醇糖+rhGDF-5，其中实施例7-rhGDF-5浓度0.5毫克/瓶，甘露醇浓度50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。其中冻干制剂使用水重构。最终浓度为0.33毫克/毫升蛋白质+3,3%甘露醇。图3表示rhGDF-5天然蛋白质的DSC曲线。其中0.01%TFA中GDF-5浓度1.04毫克/毫升，没有赋形剂，相对于0.01%TFA渗析。其中10mM盐酸中3.8毫克/毫升原料GDF-5相对于0.01%TFA渗析。最终蛋白质浓度为1.04毫克/毫升。图4表示实施例6所述的rhGDF-5的海藻糖制剂的偏振光显微图，其表明海藻糖的所需无定形状态。其为冻干制剂实施例6,rhGDF-5浓度0.5毫克/瓶，海藻糖50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。图5表示实施例7所述的rhGDF-5的甘露醇制剂的偏振光显微图，其表明甘露醇的非所需结晶状态。其为冻干制剂实施例7，rhGDF-5浓度0.5毫克/瓶，甘露醇50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。图6表示如实施例12所述在40°C/75%RH下6个月后rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸制剂的rpHPLC曲线。图7表示如实施例12所迷在4(TC/75%RH下6个月后rhGDF-5/海藻糖/HCl制剂的rpHPLC曲线。图8、9和10表示如实施例12所述在5°C、25。C和40。C在不同时间点储存时各种测试緩沖液的蛋白质回收百分率。其中图8表示使用pH为3的不同緩沖液体系冻干的rhGDF-5在5r的稳定性；图9表示使用pH为3的不同緩沖液体系冻干的rhGDF-5在25。C储存后的稳定性；图IO表示使用pH为3的不同緩沖液体系冻干的rhGDF-5在4(TC储存后的稳定性。图11表示如实施例14所迷在pH3的甘氨酸緩沖液中使用5%或10%海藻糖在选定温度冻千的不同浓度rhGDF-5的稳定性。
发明内容本发明一般涉及在各种制剂和组合物中稳定BMP，由此保持生物活性的至少60%并且改善储藏条件要求，例如温度和湿度。本发明包括主要含有海藻糖作为赋形剂的、用于含有BMP的冻干组合物的制剂以及其随后的储存和重构，并且另外含有包括緩沖剂和表面活性剂的其它赋形剂。本发明人已经令人吃惊地发现，海藻糖在冻干期间和冻干之后足以保存BMP的生物学活性并且优于其它赋形剂。在多种其它生物分子的稳定中，若非BMP存在较大差异，对于得到保护的量，在各种糖之间存在很少的差异。这种发现提供了在患者中治疗各种肌骨骼缺陷的组合物，而没有加入赋形剂的不良反应。本发明人还令人吃惊地发现，例如抗坏血酸和谷胱甘肽的抗氧化剂的加入并没有提高使用海藻糖冻干的BMP的稳定性，而是降低了通过海藻糖得到的稳定性。本发明的一个目的是使用足以稳定冻干的BMP的量的海藻糖，由此BMP在再水化作用时保持至少60%的生物学活性，所述再水化的液体产物易于被外科医生处理。本发明另一目的是使用足以稳定冻干的BMP的量的海藻糖、至少一种BMP和其它赋形剂，所述其它赋形剂选自緩沖剂、表面活性剂以及其混合物，由此BMP在再水化作用时保持至少60%的生物学活性，所述再水化的液体产物易于被外科医生处理。本发明另一目的是使用足以稳定冻干的BMP的量的海藻糖、至少一种BMP和粉碎的(morselized)胶原纤维以提供组合物，以及制备含有BMP的冻干的生物相容的可流动材料的方法，该材料稳定并且在再水化作用时保持至少60%的生物学活性，由此所述再水化的产品易于被外科医生处理。本发明另一目的是使用足以稳定冻干的BMP的量的海藻糖、至少一种BMP和生物相容的基质以提供组合物，以及制备含有BMP的冻千的生物相容的基质的方法，该基质稳定并且在再水化作用时保持至少60%的生物学活性，由此所述再水化的产品易于被外科医生处理。示例性的生物相容的基质包括胶原、矿物化胶原、磷酸钙的盐、含有钙的陶瓷、各种来源的骨骼包括自生、外源和异体的骨骼，以及聚合物，包括聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、PLA-PGA共聚物、聚碳酸酯、聚己酸内酯以及其混合物。本发明另一目的是使用足以稳定冻干的BMP的量的海藻糖、至少一种BMP、生物相容的基质和其它赋形剂，所述其它赋形剂选自緩冲剂、表面活性剂以及其混合物，以提供组合物和制备含有BMP的冻干的生物相容的基质的方法，该基质稳定并且在再水化作用时保持至少60%的生物学活性，由此所述再水化的产品易于被外科医生处理。本发明另一目的是使用足以稳定冻干的BMP的量的一种或多种冻干保护剂和至少一种BMP以提供组合物和制备冻干的BMP的方法，其中冻干保护剂选自海藻糖、低分子量右旋糖、环糊精、聚乙二醇、聚乙二醇酯以及其混合物，由此BMP在再水化作用时保持至少60%的生物学活性，所述再水化的产品易于被外科医生处理。本发明另一目的是使用一种或多种冻千保护剂、至少一种BMP和胶原以提供组合物和制备含有BMP的冻千的生物相容的胶原基质的方法，其中冻干保护剂选自海藻糖、低分子量右旋糖、环糊精、聚乙二醇、聚乙二醇酯以及其混合物，该基质稳定并且在再水化作用时保持至少60%的生物学活性，由此所述再水化有展延性的产品易于被外科医生处理。本发明另一目的是使用一种或多种冻千保护剂、至少一种BMP和粉碎化胶原纤维以提供组合物和制备含有BMP的冻干的生物相容的可流动材料的方法，其中冻干保护剂选自海藻糖、低分子量右旋糖、环糊精、聚乙二醇、聚乙二醇酯以及其混合物，该材料稳定并且在再水化作用时保持至少60%的生物学活性，由此所述再水化的产品易于被外科医生处理。本发明的还一目的在于使用由至少一种冻干保护剂和至少一种BMP的冻干混合物组成的组合物治疗患者的方法。通过直接将重构的BMP溶液施加到患者的解剖学区域，例如施加到骨折、骨缝、骨空隙、推间盘、软骨缺陷、腱、韧带等区域，或者将重构的BMP溶液施加到要植入患者的装置，例如人造连接骨(bone-contacting)植入物，如人造髖、膝、肩、推间盘等等，腱锚(tendonanchor)、韦刃带锚(ligamentanchor)、缝合线、卡钉(staple)等等，骨置换罩(bonereplacementcage)、自体骨碎片、同种异体骨碎片、异种骨碎片、去矿质骨碎片等等，这些组合物用于治疗各种肌骨骼缺陷，以促进愈合过程。水溶液或干燥固体形式的BMP不稳定，需要冷藏到-2(TC以下以保持蛋白质的生物活性。由于BMP易于聚集、二硫键重排、脱酰胺和氧化，需要一种制剂来保存和保护冻干的BMP的生物学活性。冻干的BMP产品需要具有改善的稳定性和储存。仍然需要用于使用水溶液重构的冻千的BMP产品，用于注射到例如推间盘、非关节和关节软骨的软组织中以促进这些组织的再生。仍然需要冻千的BMP产品，其以医师使用的合适的BMP浓度提供在可植入生物相容的支架上，由此最小化或消除多种与处置有关的危险，包括污染、不合适的剂量以及泄漏，包括废料，以及引入到不希望的手术位置。需要冻干的BMP产品，其可以在易于施加到手术位置的生物相容的可流动材料中重构。由于BMP的发现，一直在进行大量的研究活动以发现用于治疗各种肌骨骼缺陷和病症的治疗应用中合适的组合物。当前存在含有BMP的以冻干的固体出售的产品，其必须重构为液体并且在使用时由医师施加到要被植入的支架或者外科治疗位置。当前rhBMP-2制剂使用蔗糖NF、甘氨酸USP、L-谷氨酸FCC、氯化钠USP和聚山梨醇酯80NF作为赋形剂，并且可在室温下(15-25°C)储存。当前OP-l制剂单独使用牛胶原，并且必须在2-8。C储存。关于重构BMP稳定性的赋形剂的效力，还没有公开的报道。他人已经试图通过使用甘露醇、蔗糖以及其混合物，通过将BMP包埋在例如PLGA的聚合母体中，通过加入例如蛋氨酸的抗氧化剂，通过加入例如组氨酸、精氨酸、环糊精和牛血清白蛋白的其它赋形剂，和加入例如吐温80的表面活性剂，或者其组合，在冻干期间增强BMP的稳定性。这些努力已经实现了不同程度的有限度的成功。美国专利US5,318,898和5,516,654公开了使用硫酸葡聚糖在培养基中制备BMP的改进方法，然而没有阐述产生益处的机制并且没有公开稳定蛋白质的任何其它有用的赋形剂。Yim等人在美国专利US5,385,887中^Hf了冻干组合物和用于递送BMP的制剂，所述组合物包括BMP、糖、甘氨酸和谷氨酸。虽然Yim等人/>开了通过W-20石威性磷酸酶测试证明的冻干制剂保持了生物学活性，然而其没有公开任一制剂与其它制剂相比显示任何定量益处的对比数据。这些发明人没有讨论或确认海藻糖在BMP的冻干中相对于蔗糖的优越性。本发明提供了组合物以及制备和使用BMP稳定制剂的方法，其可用于冻干、储存和用水溶液重构以由其治疗患者。本发明根据以下说明性实施方案描述如下，并且使用rhGDF-5作为示范性BMP。本领域熟练技术人员将能够理解，本发明可以在多种不同应用和实施方案中实现，'本发明二^面提供了一种组合物，和制备^后用于骨和软骨缺陷的外科治疗中稳定的冻干的BMP的方法。正如此处所预想的那样，这种组合物包括至少一种BMP和足以稳定BMP量的海藻糖。通过将重构的BMP溶液直接施加到患者的解剖区域，例如施加到骨折、骨缝、骨空隙、推间盘、外科用于融合的稚间盘间隙、软骨缺陷、腱、韧带等区域，或者施加到要植入到患者与骨或软骨接触的材料中，例如人造髋、人造膝、人造肩、人造推间盘、腱锚、韧带锚、缝合线、卡钉(staple)、骨罩、自体骨碎片、同种异体骨碎片、异种骨碎片、去矿质骨碎片等等，这些组合物用于治疗各种肌骨骼缺陷。此处使用的术语"形态发生"、"骨骼形态发生"、"骨骼形态发生蛋白质"、"BMP"、"成骨蛋白质"、"成骨因子"、"生长&分化因子"和"GDF"包括rhGDF-5代表的一类蛋白。然而本领域熟练技术人员将能够理解，rhGDF-5仅仅作为能够用作BMP的实际组织形态发生素的典型TGF-p系亚组，并且并不意图限制说明。术语"冷冻保护剂"用来表示能够在冷冻期间稳定生物分子的分子，并且在当前上下文中等同于术语"冻干保护剂"，其指的是能够在冻干期间稳定生物分子的分子。此处使用的术语"粉碎化(morselized)"指的是通过切割、砍碎、切断、研磨、粉碎或者其它降低例如胶原的生物相容基质的量的尺寸、由此单个颗粒或纤维的总尺寸降低的方法得到产品，并且"粉碎化(morselization)"指的是上述方法。此处使用的术语"赋形剂"指的是添加到至少一种BMP中的至少一种其它化合物，其中所述其它化合物选自氨基酸、蛋白质、缓冲剂、表面活性剂以及其混合物。已知rhGDF-5在pH4.5至pH10.5范围的中性pH内具有较差的溶解度。因此难以在此pH范围内配制和制备rhGDF-5产品。因此本发明人设计一种研究以评价rhGDF-5在pH3和pH4緩冲液中的溶解度，选择形成蛋白质制剂的合适的pH范围是关键的。研究结果如实施例11所述。rhGDF-5的溶解度不仅取决于緩冲液的pH,还取决于緩冲溶液的离子强度。在pH为4时，约10毫克/毫升的rhGDF-5溶液在5和10mM石克酸钠缓冲液中混浊，然而在50和100mM石克酸钠緩沖液中rhGDF-5形成更大的颗粒并且最终沉淀出来。在另一研究中(数据没有显示)，当rhGDF-5以3.5毫克/毫升的浓度在pH为3.5和pH为4的5mM硫酸盐緩冲液中配制时，溶液仍然混浊。蛋白质的溶解度通常在过度饱和/沉淀的溶液离心后测量蛋白质浓度确定。然而某些混浊的蛋白质溶液难以离心或过滤。即便是在混浊溶液进行离心或过滤(0.22微米)以除去不溶性颗粒后，由于颗粒如此细小滤液仍然看起来混浊，这通常不成功，并且有时蛋白质常常粘在过滤器表面，因而滤液损失了大部分蛋白质。因此当rhGDF-5以3.5毫克/毫升或10毫克/毫升浓度在pH为3.5或pH为4的緩冲液中配制时难以得到透明溶液。当rhGDF-5以10毫克/毫升浓度在5mM、10mM和25mM磷酸钠溶液中在pH为3.0配制时，蛋白质溶液透明；然而当rhGDF-5以10毫克/毫升在更高离子强度的溶液例如50mM和100mM磷酸钠中配制时，rhGDF-5溶液混浊。因此在一个优选实施方案中，rhGDF-5应当在低离子强度緩冲液中在约3.0的pH配制。在根据本发明的一个实施方案中，组合物可通过冻干至少一种BMP和足以稳定BMP量的海藻糖的混合物制备，对于含有产品的生物相容的基质，海藻糖与BMP的干重比例为每1毫克BMP约1毫克至约500毫克海藻糖，更优选每1毫克BMP约5毫克至约200毫克海藻糖。海藻糖的加入为冻干制剂中的蛋白质提供改善的溶解度和稳定性。冻干根据本领域通常已知的方法进行。在另一实施方案中，根据本发明的组合物可通过冻干至少一种BMP、足以稳定BMP量的海藻糖和緩冲液的含水混合物制备。緩冲剂的加入为冻干制剂中的蛋白质提供改善的溶解度和稳定性。本领域已知的生物相容的緩冲剂包括甘氨酸；乙酸钠、钾或钙盐；柠檬酸钠、钾或钙盐；乳酸钠、钾或钙盐；磷酸钠或钾盐，包括磷酸二氢盐、磷酸氢盐、磷酸盐以及其混合物。緩冲剂另外可以具有加入到组合物中起填充剂作用的甘氨酸。甘氨酸将以每1毫克BMP约0.04毫克至约200毫克甘氨酸的比例加入，更优选以每0.04毫克BMP约1亳克至约80毫克甘氨酸的比例加入。与单独具有海藻糖的组合物相比，缓冲剂和填充剂的加入为蛋白质提供稍微更优越的稳定性，pH控制在约2.0至约5.0pH单位，更优选约2.5至约4.5pH单位。在可供选择的实施方案中，根据本发明的组合物和方法可通过冻干至少一种BMP、足以稳定BMP量的海藻糖、緩冲剂和选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20以及其混合物的表面活性剂的含水混合物制备。表面活性剂将以每1毫克BMP约0.001毫克至约0.2毫克的浓度加入。通过改变溶解度和冻干特性，表面活性剂的加入为蛋白质另外提供稳定性。冻千根据本领域通常已知的方法进行。在本发明另一实施方案中，稳定的冻干BMP的组合物和方法包括至少一种BMP、足以稳定至少一种BMP的量的冻千的海藻糖，以及至少一种其它赋形剂，所述其它赋形剂选自缓冲剂和表面活性剂。与具有海藻糖作为单独的赋形剂的组合物相比，这种缓冲剂和表面活性剂的加入为冻干的BMP提供增加的改善的稳定性。在另一实施方案中，根据本发明的组合物和方法可通过在冻干BMP/胶原混合物之前将至少一种BMP和至少一种赋形剂的溶液沉积在冻干胶原上制备。胶原可任选被交联或矿物化，或者既交联又矿物化，例如通过已争为Healos的材料提供并且公开在美国专利US5,972,385、5,866,165、5,776,193、5,455,231和5,231,169中。该实施方案中提供的组合物特别可用于治疗整形外科领域的医学病症，并且提供柔性可延伸的材料,医师可容易地将其置于手术位置以生成骨、软骨或腱。BMP/胶原混合物可使用水溶液重构，包括无菌水、盐水和骨髓吸出物，并且直接施加在患者的缺陷部位，例如骨折、骨缝隙、骨空隙和通过手术为脊柱融合术准备的推间盘间隙。此外，BMP/胶原混合物可用于填充骨碎片之间的空隙以及在脊柱融合术期间放入推间盘间隙中的植入物中，放入具有损伤或失去的软骨的区域中，例如断裂或损伤的腱、断裂或损伤的韧带、关节软骨中的软骨缺陷，以及关节软骨中的亚软骨缺陷。在另一实施方案中，片艮据本发明的组合物和方法可如下应用通过制备至少一种BMP和至少一种赋形剂的冻干混合物、使用水、盐水或骨髓吸出物重构该冻干BMP混合物，并且在手术移植BMP/胶原混合物之前将该重构的BMP溶液置于冻干胶原之上。"交原可任选纟皮交联或矿物化，或者既交联又矿物化，例如通过已知为Healos⑧的材辟十提供。该实施方案中提供的组合物和方法特别可用于治疗整形外科领域的医学病症，并且提供柔性可延伸的材料，医师可容易地将其置于手术位置以生成骨、软骨或腱。BMP/胶原混合物可直接施加到患者的缺陷部位，例如骨折、骨缝隙、骨空隙和通过手术为脊柱融合术准备的推间盘间隙、填充骨碎片之间的空隙以及在脊柱融合术期间放入推间盘间隙中的植入物中，放入具有损伤或失去的软骨的区域中，例如断裂或损伤的腱、断裂或损伤的韧带、关节软骨中的软骨缺陷，以及关节软骨中的亚软骨缺陷。由于具有BMP作为分离组分和来自胶原材料的容器，该实施方案中提供的组合物和方法由于易于储存和制备也特别有用。在另一实施方案中，根据本发明的组合物和方法可通过在冻干BMP/粉碎化胶原混合物之前将至少一种BMP和至少一种赋形剂的溶液沉积在冻干的粉碎化胶原上制备。粉碎化胶原可任选被交联或矿物化，或者既交联又矿物化。这种粉碎化提供直径约25微米长约110微米的较小胶原纤维，其得到适于注射到手术位置的可流动组合物。这种组合物的重构可使用例如无菌水、盐水或骨髓吸出物的水溶液和胶原凝胶的混合物进行，胶原凝胶控制重构产品的粘度。胶原凝胶含有约0.1%至约30%重量/重量的胶原，更优选约0.3%至约3.0%重量/重量的胶原，胶原凝胶的粘度优选为约10厘泊(cp)至约400厘泊，并且更优选约70厘泊至约100厘泊。胶原凝胶的pH优选约4.0pH单位至约8.0pH单位。这种组合物用于治疗各种肌骨骼疾病，包括但不限于骨折、骨缝隙、骨空隙和通过手术为脊柱融合术准备的推间盘间隙、填充骨碎片之间的空隙以及在脊柱融合术期间;改入稚间盘间隙中的才直入物中，具有损伤或失去的软骨的区域，例如断裂或损伤的腱、断裂或损伤的韧带、关节软骨中的软骨缺陷，以及关节软骨中的亚软骨缺陷。在另一实施方案中，根据本发明的组合物和方法可如下使用，通过制备至少一种BMP和至少一种赋形剂的冻干混合物、使用水或盐水重构该冻干BMP混合物，并将该重构的BMP溶液注入到推间盘。该实施方案中提供的组合物和方法特别用于治疗稚间盘。具体实施方式实施例在以下实施例中，4吏用以下实-验方法为了进行RP-HPLC纯度研究，使用10mM盐酸将重构rhGDF-5试样稀释到0.1毫克/毫升的浓度，并且在5(TC和0.3毫升/分钟的流速在Vydac218TP52柱上进行反相HPLC。rhGDF-5使用0.15%三氟乙酸中的乙腈的梯度洗脱，使用UV在214纳米检测。对于圆二色光谱(CD)研究，圆二色光语在AVIVModel60DS圆二色光谱旋光分光计上进行。使用相应赋形剂的基线空白对照剂的扫描从样品扫描中减去。该扫描使用平均残基分子量(值为l5)归一化并将其插入到方程式中=/[浓度(毫克/毫升)x光程]的值在每个波长计算以得到平均残基椭圆率。最终，次级结构的估算使用程序PROSECv.2.1确定(1987年AVIVAssociates取得版;k)。差示扫描量热(DSC)在MicroCalVP-DSC仪上进行。扫描速率为6(TC/小时。温度范围为5-10(TC。仪器基线扫描(空白对照组数据)从试样热扫描中减去。蛋白质浓度为0.33毫克/毫升。偏振光显微术(PLM)用于结晶度评价。痕量固体试样从处于相对湿度为1%的干空气包中的小瓶中取出。将固体试样分布在玻璃载片上并将一滴二氧化硅油滴加在固体试样上。然后载片使用装有索尼CCD-IRIS/RGB彩色摄像机和偏振光附件的蔡司(zeiss)光学显微镜研究。FlashBusFBG软件用于捕捉图像。原料rhGDF-5在-80。C以10mM盐酸中3.8毫克/毫升的浓度从Bi叩harm得到。在用于制剂之前，冷冻的原料蛋白质在2-8。C解冻整夜。实施例h具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，5毫升/条)和海藻糖50毫克/毫升的Healos⑧条(非无菌)。每个条具有2.5毫克rhGDF-5和250毫克海藻糖。海藻糖溶液的制备25.48克二水合海藻糖仔细称重并转移到无菌聚丙烯瓶中，在室温下向其中加入350毫升纯净水并緩慢搅拌直到得到透明溶液。向该透明溶液中逐滴加入0.1N盐酸以将pH调节为3.9，然后使用纯净水调节体积以得到400毫升最终体积。测量pH并且发现pH为4.2。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并直接使用以稀释蛋白质溶液。使用海藻糖溶液稀释rhGDF-5溶液将22.39毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯〗统中，小心向其中加入海藻糖溶液以将体积调节至150毫升；测量pH并且发现pH为2.5。将溶液在室温下搅拌15分钟。得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多海藻糖溶液以在170毫升得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为2.7;UV读数指示0.499毫克/毫升的蛋白质含量。rhGDF-5/海藻糖溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接施加到Healos⑧条上。使用无菌移液管将2.5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液等同施加在条的两点上，每个条上总共有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。这些条插入在2厘米x2厘米小PETG托盘中，并且将小托盘插入到大PETG托盘中并冻干。每个大托盘容纳24个条。表la:每个条具有海藻糖(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的Healos⑧在25。C的稳定性(实施例1)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表lb:每个条具有海藻糖(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的Healos⑧在2-8。C的稳、定性(实施例1)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例2:具有rhGDF-5(0:5毫克/毫升,5毫升/条)和甘露醇50毫克/毫升的Healos⑧条(非无菌)。每个条具有2.5毫克rhGDF-5和毫克甘露醇。甘露醇溶液的制备23.03克甘露醇仔细称重并转移到无菌聚丙烯瓶中，在室温下向其中加入350毫升纯净水并緩慢搅拌直到得到透明溶液。测量pH并且发现pH为7.2;逐滴加入0.1N盐酸以将pH调解为3.8;然后使用纯净水调节体积以得到400毫升最终体积。测量pH并且发现pH为3.9。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并直接使用以稀释蛋白质溶液。使用甘露醇溶液稀释rhGDF-5溶液将22.37毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯并瓦中，小心向其中加入甘露醇溶液以将体积调节至150毫升。测量pH并且发现pH为2.7。将溶液在室温下搅拌l5分钟。得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多甘露醇溶液以在170毫升得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为2.8;UV读数指示0,493毫克/毫升的蛋白质含量。rhGDF-5/甘露醇溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接施加到Healos⑧条上。使用无菌移液管将2.5毫升rhGDF-5/甘露醇溶液等同施加在条的两点上，每个条上总共有5毫升rhGDF-5/甘露醇溶液。这些条插入在2厘米x5厘米小PETG托盘中，并且将小托盘插入到大PETG托盘中并冻干。每个大托盘容纳24个条。表2a:每个条具有甘露醇(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的Healos⑧在25。C的稳定性(实施例2)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2b:每个条具有甘露醇("0毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的Healos⑧在2-8。C的稳定性(实施例2)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例3:具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，5毫升/条)和海藻糖100毫克/毫升的Healos⑧条(无菌)。每个条具有2.5毫克rhGDF-5和500毫克海藻糖。海藻糖溶液的制备25.49克二水合海藻糖仔细称重并转移到无菌聚丙烯瓶中，在室温下向其中加入190毫升纯净水并緩慢搅拌直到得到透明溶液。测量透明海藻糖溶液的pH并发现pH为6.2。没有向溶液中加入盐酸以调节pH。使用纯净水调节体积以得到200毫升最终体积。测量pH并且发现pH为6.3。将溶液直接用于稀释蛋白质溶液。使用海藻糖溶液稀释rhGDF-5溶液将23.03毫升rhGDF國5溶液小心转入到聚丙烯瓶中，小心向其中加入海藻糖溶液以将体积调节至170毫升；测量pH并且发现pH为3.0。将溶液在室温下搅拌15分钟。得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多海藻糖溶液以在175毫升得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为3.0;UV读数指示0.518毫克/毫升的蛋白质含量。rhGDF-5/海藻糖溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接施加到无菌Healos⑧条上。使用无菌移液管将2.5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液等同施加在条的两点上，每个条上总共有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。这些条置于钢托盘中，并且将其小心包装在无菌双重袋中，并在无菌条件下进行冻干。表3a:每个条具有海藻糖(500毫克)/rhGDF_5(2.5毫克)的Healos在2-8。C的稳定性(实施例3)__<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例4:具有低剂量rhGDF-5(5毫升/条，0.5毫克/毫升)、海藻糖40毫克/毫升和甘氨酸10毫克/毫升的Healos⑧条(无菌)。每个条具有2.5毫克rhGDF-5、220毫克海藻糖和50毫克甘氨酸。海藻糖/甘氨酸溶液的制备17.84克二水合海藻糖和4.03克甘氨酸仔细称重并转移到无菌聚丙烯瓶中，在室温下向其中加入300毫升纯净水并缓慢搅拌直到得到透明溶液。测量pH并发现pH为5.5。没有加入盐酸，使用纯净水将体积调节至350毫升。测量pH并且发现pH为5.5。使用海藻糖/甘氨酸溶液稀释rhGDF-5溶液将39.47毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯瓶中，小心向其中加入海藻糖/甘氨酸溶液以将体积调节至295毫升；测量pH并且发现pH为4.1。将溶液在室温下搅拌15分钟。得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多海藻糖溶液以在300毫升溶液得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为4.1;UV读数指示0.507毫克/毫升的蛋白质含量。溶液通过0.22微米过滤器过滤，并且溶液直接用于施加到无菌Healos⑧条上。使用无菌移液管将2.5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液等同施加在条的两点上，每个条上总共有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。这些条置于钢托盘中，并且将其小心包装在无菌双重袋中，并在无菌条件下进行冻干。表4a:每个条具有海藻糖(200毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)/甘氨酸(50毫克)的Healos⑧在2-8。C的稳定性(实施例4)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表4b:每个条具有海藻糖(200毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)/甘氨酸(50毫克)的Healos⑧在25°C的稳定性(实施例4)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例5:具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，2.5毫克/条)、海藻糖40毫克/毫升、甘氨酸10毫克/毫升和聚山梨醇酯0.1毫克/毫升的Healos条(无菌)。每个条具有2.5毫克rhGDF-5、220毫克海藻糖、50毫克甘氨酸和0.5毫克聚山梨醇酯80。聚山梨醇酯80溶液的制备23.03毫克聚山梨醇酯80称重到50毫升无菌一次性试管中，向其中加入25毫升纯净水并旋转2分钟以得到均匀溶液。海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液的制备10.19克二水合海藻糖和2.303克甘氨酸仔细称重并转移到无菌聚丙烯并瓦中，向其中加入25毫升上面得到的聚山梨醇酯80溶液。将聚山梨醇酯试管用25毫升纯净水清洗2次，并将清洗液转入到海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液。向海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液中另外加入纯净水达到190毫升的总体积。将溶液搅拌2分钟以得到透明溶液。测量溶液的pH并且发现pH为5.6;使用纯净水将体积调节至200毫升。测量pH并且发现pH为5.5。使用海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液稀释rhGDF-5溶液将23.03毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯烧瓶中，小心向其中加入海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液以将体积调节至170毫升；测量pH并且发现pH为4.1。将溶液在室温下搅拌15分钟。得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液以在175毫升溶液得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为4.1;UV读数指示0.510毫克/毫升的蛋白质浓度。通过0.22微米过滤器过滤的溶液直接使用，在无菌条件下在层流罩中施加到无菌Healos⑧条上。使用无菌移液管将2.5毫升rhGDF-S/海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液等同施加在条的两点上，每个条上总共有5毫升rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液。这些条置于钢托盘中，并且将其小心包装在无菌双重袋中，并在无菌条件下进行冻干。表5a:每个条具有海藻糖U00毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)/甘氨酸(50毫克)/聚山梨醇酯80(0.5毫克)的Healos⑧在2-8。C的稳定性(实施例5)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例6:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)的冻干小瓶产品海藻糖溶液的制备无菌聚丙烯瓶加入12.16克二水合海藻糖并安装磁力搅拌棒，在室温下向其中加入190毫升纯净水。将溶液在室温下搅拌直到海藻糖彻底溶解。测量pH并且发现pH为6.5。向透明海藻糖溶液中逐滴加入0.1N盐酸以将pH调节至5.8。将溶液体积用纯净水调节至200毫升；测量pH并且发现pH为5.5。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并直接用于稀释蛋白质溶液。使用海藻糖溶液稀释rhGDF-5溶液将14.47毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯烧瓶中，在旋转烧瓶的同时向其中緩慢加入海藻糖溶液至100毫升的最终体积。溶液在室温下偶尔旋转15分钟；测量pH并且发现pH为3.0。根据UV读数，加入更多海藻糖溶液以在110毫升得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为3.1;UV读数指示0.510毫克/毫升的蛋白质浓度。将溶液通过0.22孩i米过滤器过滤并且直接加入到小并瓦中。填充小瓶1.1毫升rhGDF-5/海藻糖溶液手动加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，并且每个小瓶在进入冻干器前部分用塞子封闭。冻干后将塞子压紧并折边。以白色至灰白色结块(cake)得到产品。表6a:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小并瓦在2-8匸的稳定性(实施侈6)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表6b:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在25r的稳定性(实施例6)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例7:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加甘露醇(50毫克/毫升)的冻干小并瓦产品甘露醇溶液的制备无菌聚丙烯瓶加入11.52克甘露醇并安装磁力搅拌棒，在室温下向其中加入185毫升纯净水。将混合物在室温下搅拌10分钟直到甘露醇彻底溶解。测量pH并且发现pH为6.6。向透明溶液中逐滴加入0.1N盐酸以将pH调节至5.5。将溶液体积用纯净水调节至200毫升；测量pH并且发现pH为5.7。将溶液通过0.22孩么米过滤器过滤并直接用于稀释蛋白质溶液。使用甘露醇溶液稀释rhGDF-5溶液向聚丙烯烧〗f瓦中小心转入14.48毫升rhGDF-5溶液；向其中小心加入甘露醇溶液至100毫升的体积。溶液在室温下旋转15分钟；得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多甘露醇溶液以在110毫升溶液中得到所需蛋白质浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为3.1;UV读数指示0.498毫克/毫升的蛋白质浓度。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接加入到小瓶中。填充小瓶1.1毫升甘露醇/rhGDF-5溶液手动加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，并且每个小瓶在进入冻干器前部分用塞子封闭。冻干后将塞子压紧并折边。以白色至灰白色结块得到产品。表7a:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加甘露醇(50毫克/毫升)小瓶在2-纩C的稳定性(实施例7)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>表7b:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加甘露醇(50毫克/毫升)小瓶在25C的稳定性(实施例7)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>实施例8:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)在pH为3.0的甘氨酸-盐酸緩冲液中的冻干小瓶产品海藻糖溶液的制备无菌聚丙烯瓶加入12.16克二水合海藻糖并安装磁力搅拌棒，在室温下向其中加入200毫升pH为3.0的5mM甘氨酸-盐酸緩冲液。将溶液在室温下搅拌直到海藻糖彻底溶解。海藻糖/甘氨酸溶液的pH为3.1。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并直接用于稀释蛋白质溶液。使用海藻糖溶液稀释rhGDF-5溶液原料rhGDF-5溶液使用分子量为3000的截断薄膜在2-8匸相对于5mM甘氨酸-盐酸緩冲液渗析。渗析后溶液略微浓缩至3.8毫克/毫升。将14.47毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯烧瓶中，在旋转烧瓶的同时向其中緩慢加入海藻糖-甘氨酸溶液至100毫升的最终体积。溶液在室温下偶尔旋转15分钟；测量pH并且发现pH为3.0。根据UV读数，加入更多海藻糖-甘氨酸溶液以在U0毫升溶液中得到所需蛋白质浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为3.0;UV读数指示0.507毫克/毫升的蛋白质浓度。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接加入到小瓶中。填充小瓶1.1毫升rhGDF-5/海藻糖溶液手动加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，并且每个小瓶在进入冻干器前部分用塞子封闭。冻干后将塞子压紧并折边。以白色至灰白色结块得到产品。表8:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在pH为3.0的甘氨酸-盐酸緩冲液中的稳定性(实施例8)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>实施例9:rhGDF-5(0,5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)在pH为3.0的磷酸盐緩冲液中的冻干小瓶产品海藻糖溶液的制备无菌聚丙烯瓶加入12.16克二水合海藻糖并安装磁力搅拌棒，在室温下向其中加入200毫升pH为3.0的5mM磷酸盐緩冲液。将溶液在室温下搅拌直到海藻糖彻底溶解。海藻糖/磷酸盐緩冲液溶液的pH为3.0。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并直接用于稀释蛋白质溶液。使用海藻糖溶液稀释rhGDF-5溶液原料rhGDF-5溶液使用分子量为3000的截断薄膜在2-8°C相对于磷酸盐緩冲液渗析。渗析后溶液略^f敖浓缩至3.8毫克/毫升。将14.47毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯烧瓶中，在旋转烧瓶的同时向其中緩慢加入海藻糖/磷酸盐緩冲液至100毫升的最终体积。溶液在室温下偶尔旋转15分钟；测量pH并且发现pH为3.0。根据UV读数，加入更多海藻糖/磷酸盐緩冲液以在110毫升得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为3.0;UV读数指示0.50毫克/毫升的蛋白质浓度。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接加入到小瓶中。填充小瓶1.1毫升rhGDF-5/海藻糖溶液手动加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，并且每个小瓶在进入冻干器前部分用塞子封闭。冻干后将塞子压紧并折边。以白色至灰白色结块得到产品。表9:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在pH为3.0的磷酸盐緩冲液中的稳定性(实施例9)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>实施例10:具有2.5毫克rhGDF-5和250毫克海藻糖的粉碎化胶原圆柱体海藻糖溶液的制备9.56克二水合海藻糖仔细称重并加入到无菌聚丙烯瓶中，在室温下向其中加入145毫升纯净水并緩慢搅拌直到得到透明溶液。测量该透明溶液的pH并且发现其为5.3。使用纯净水调节体积以得到150毫升的最终体积。测量溶液的pH并且发现其为5.3。该溶液直接用于稀释蛋白质溶液。使用海藻糖溶液稀释rhGDF-5溶液将16.45毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯烧ife中，向其中小心加入海藻糖溶液以将体积调节至120毫升；测量pH并且发现pH为2.9。溶液在室温下搅拌15分钟。得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多海藻糖溶液以在125毫升溶液中得到0.5毫克/毫升的所需蛋白质浓度；测量pH并且发现pH为2.9;UV读数指示0.498毫克/毫升的蛋白质浓度。使用rhGDF-5/海藻糖溶液配制粉碎化胶原圓柱体溶液通过0.22微米过滤器过滤，并直接使用所得溶液分布在预先形成的压紧在Teflon模具中的粉碎化胶原圆柱体上。在冻干之前每个圆柱体配有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。表10:每个圆柱体中具有rhGDF-5(2.5毫克)和海藻糖("0毫克)的粉碎化胶原圆柱体在2-8'C的稳定性(实施例10)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>已经研发了制备具有赋形剂和可溶胶原凝胶的可流动粉碎化胶原/rhGDF-5的不同实例，并且对每个实例评价了其性能、稳定性和是否易于制备。粉碎化胶原实施例1-冻千为干燥形式的粉碎化胶原圆柱体&rhGDF-5-润湿形式的胶原凝胶保持分离-两者分别在2-8X:保持在分开的注射器中-两者在注射前混合。4分碎化胶原实施例2-以湿润形式混合在一起的粉碎化胶原圆柱体&rhGDF-5&胶原凝胶(没有冻干)-全部以湿润形式在2-8°C放在一个注射器中；即可使用粉碎化胶原实施例3-冻干为干燥形式的粉碎化胶原圆柱体&rhGDF-5&胶原凝胶-全部以千燥形式在2-8。C放在一个注射器中-在注射之前用水再水化。粉碎化胶原实施例4-粉碎化胶原圆柱体&胶原凝胶以糊状物在一起-rhGDF-5以千燥形式单独放置-两者在2-8匸分别放在不同注射器中-两者在注射之前混合。粉碎化胶原实施例5-粉碎化胶原圆柱体&胶原凝胶以千燥形式放在一起-rhGDF-5以干燥形式单独;改置-两者在2-8。C分别放在不同注射器中-使用无菌水或骨髓吸出物重构rhGDF-5-在注射之前千燥的粉碎化胶原和胶原与重构的rhGDF-5溶液混合。在有例如甘露醇、蔗糖和海藻糖的几种赋形剂并且存在或不存在緩冲剂和抗氧化剂的条件下，rhGDF-5的稳定性通过以下方法评价RP-HPLC、差示扫描量热(DSC)、圆二色光谱(CD)、偏振光显微术(PLM)以及生物测定。几种含有蔗糖的rhGDF-5冻干制剂在储存期间显示出不希望的黄色和玻璃状结块结构，因而是没有希望的。冻干rhGDF-5制剂的熔融性能使用DSC研究。DSC数据表明海藻糖和甘露醇基制剂显著改善了原料rhGDF-5的热稳定性。图1、2和3表示rhGDF-5的海藻糖制剂和甘露醇制剂的DSC曲线与原料rhGDF-5的DSC曲线的比较。原料rhGDF-5表现两个主要转变一个接近4(TC并且另一个接近85°C。高温转变可能表示蛋白质的热展开。值得注意的是，第一吸热转变的溶解温度(Tm)在赋形剂的存在下增加7-14。C。单独考虑时，该研究表明海藻糖和甘露醇可同样有效地作为稳定剂。海藻糖/rhGDF-5制剂的PLM(偏振光显微术)如图4所示。样品没有显示主要的双折射现象。因此该体系为无定形，其对治疗应用来说理想的。图5表示储存一段时间后甘露醇/rhGDF-5制剂的PLM。在样品中观察到许多晶体，表明甘露醇在储存期间已经结晶。结果表明海藻糖为rhGDF-5更好的冻干保护剂。远UVCD光谱表明海藻糖基制剂具有与天然原料蛋白质可比的次级结构分布。具有各种赋形剂的冻干rhGDF-5通过RP-HPLC的实时稳定性研究清楚地表明，以50毫克/毫升或100毫克/毫升浓度存在海藻糖的rhGDF-5,不管存在还是不存在緩冲剂并且有还是没有聚山梨醇酯，在2-8匸和15-25。C的储存条件下一致产生改善的稳定性，然而甘露醇在类似存储条件下不能提供相同的稳定性水平。冻干结块制剂的实时稳定性研究清楚地表明，由在室温和2-8。C储存条件下，主峰显著降低同时聚集物峰值增加可证明，甘露醇没有稳定蛋白质。由于能够产生免疫反应和副作用，聚集物为蛋白质制剂中最不希望的物质。相比之下，如实时稳定性研究中所证实，特别是在2-8匸的储存条件下通过抑制聚集物的形成和保护主峰，海藻糖很好地稳定了蛋白质。因此在稳定制剂中的rhGDF-5时，海藻糖比甘露醇更好。实时稳定性数据还表明，具有磷酸盐或甘氨酸作为緩冲液以控制pH的rhGDF-5/海藻糖制剂比没有緩冲液的rhGDF-5/海藻糖制剂更好。实时稳定性数据表明，rhGDF-5海藻糖/甘氨酸制剂的理想储存是在2-8°C,并且在25。C储存也合适。除了海藻糖基rhGDF-5制剂有利的生化和生理数据外，这些制剂还在石咸性-畴酸酶生物测定中显示效力。物理化学分析方法、体外测试方法以及实时稳定性数据显示海藻糖在冻干独立产品中，以及用于治疗各种肌骨骼病症的胶原基组合产品中，在稳定rhGDF-5中作为优越赋形剂的前途o实施例11:rhGDF-5在不同离子强度溶液和两种pH緩冲液(pH3和pH4)中的溶解度磷酸钠缓冲剂的不同离子强度的溶液用于该研究。原料蛋白质溶液浓缩至约10毫克/毫升并且使用5、10、25、50和100mM磷酸盐緩冲液在pH3或pH4渗析。渗析后，；险查样品透明度并在UV-Vis分光光度计上分析蛋白质浓度。详细步骤如下所述。緩冲液制备pH为3的100mM磷酸盐緩冲液13.5毫升浓磷酸(14.8M)溶液转入到2000毫升烧杯，向其中加入去离子水以达到1900毫升刻度。将溶液使用氢氧化钠溶液滴定至pH为3并转入2000毫升量筒。加入水补充到2000毫升。然后倒回烧杯并充分混合。pH为3的50mM磷酸盐緩冲液6.76毫升浓磷酸(14.8M)溶液转入到2000毫升烧杯，向其中加入去离子水以达到1900毫升刻度。将溶液使用氢氧化钠溶液滴定至pH为3并转入2000毫升量筒。加入水补充到2000毫升。然后倒回烧杯并充分混合。pH为3的25mM磷酸盐緩冲液3.39毫升浓磷酸(14.8M)溶液转入到2000毫升烧杯，向其中加入去离子水以达到1900毫升刻度。将溶液使用氢氧化钠溶液滴定至pH为3并转入2000毫升量筒。加入水补充到2000毫升。然后倒回烧杯并充分混合。pH为3的10mM-粦酸盐緩冲液1.35毫升浓磷酸(14.8M)溶液转入到2000毫升烧杯，向其中加入去离子水以达到1900毫升刻度。将溶液使用氢氧化钠溶液滴定至pH为3并转入2000毫升量筒。加入水补充到2000毫升。然后倒回烧杯并充分混合。pH为3的5mM磷酸盐緩冲液0.676毫升浓磷酸(14.8M)溶液转入到2000毫升烧杯，向其中加入去离子水以达到1900毫升刻度。将溶液使用氢氧化钠溶液滴定至pH为3并转入2000毫升量筒。加入水补充到2000毫升。然后倒回烧杯并充分混合。样品制备原料蛋白质rhGDF-5(Lot#2142131)在2-8。C解冻。原料蛋白质溶液(24毫升，3.8毫克/毫升)使用离心过滤装置(PallLifeScience,Cat#OD010C37,10KMWCO)浓縮至约6毫升的体积。约0.9毫升浓缩的rhGDF-5溶液转入到各个渗析过滤片(cassette)中(Pierce,Cat#66380)并相对于磷酸盐緩冲液在室温下渗析整夜。浓缩的rhGDF-5溶液小心从渗析过滤片中移出并放入小玻璃管中以#全查溶液透明度。如分析方法部分所述，蛋白质浓度在UV-Vis分光光度计上确定。在pH为4的溶解度通过向pH为3的緩冲液中加入更多的氢氧化钠溶液由pH为3的緩冲液制备pH为4.0的緩冲液。蛋白质溶液相对于pH为4的緩冲液在室温下渗析整夜。分析样品的溶液透明度和蛋白质浓度。分析方法对小玻璃管中的溶液样品检查透明度和颗粒。样品小瓶使用垂直光线对着黑色背景检查。试样的透明度与作为对照的纯净水样品比较。每个溶液样品的pH直接使用校准pH计测量。结果10毫克/毫升rhGDF-5溶液溶解度研究的结果表明，在5、10和25mM较低离子强度的磷酸钠緩冲液中得到透明溶液，显示良好的溶解度，然而在50和100mM较高离子强度的磷酸钠缓冲液中得到混浊溶液，显示较差的溶解度。在pH为4时，5和10mM磷酸钠缓冲液得到混浊溶液，显示较差的溶解度。25、50和lOOmM的磷酸钠緩冲液在离心后得到透明溶液，然而具有接近零的蛋白质回收率，表明蛋白质已经沉淀。因此，接近pH为3的低离子强度緩冲液将优于在较高pH的高离子强度緩冲液。实施例12:rhGDF-5在具有5%海藻糖的各种缓冲液中在不同温度下的稳定性在此研究中，测试了各种緩沖液在保护5%海藻糖溶液中0.7毫克/毫升rhGDF-5在冷冻干燥期间和在5X:储存时的影响。测试的緩冲液为pH为3的5mM甘氨酸-盐酸、pH为3的5mM;寿酸钠、pH为3的5mM斗宁檬酸钠、pH为3的10mM乳酸钠、水中的0.0"/。TFA、1mM盐酸，以及不存在海藻糖的rhGDF-5在1mM盐酸中的对照溶液。緩冲液如下制备pH为3的5mM甘氨酸緩冲液2000毫升烧杯中加入0.75克甘氨酸(分子量75.05克)和1900毫升去离子水；在搅拌下将该溶液使用盐酸溶液滴定至pH为3。加入水补充至2000毫升并充分混合。pH为3的5mM柠檬酸緩冲液2000毫升烧杯中加入2.11克一水合柠檬酸(分子量210.14克)和1900毫升去离子水；将该溶液用氢氧化钠溶液滴定至pH为3。加入水补充至2000毫升并将溶液充分混合。pH为3的5mM磷酸盐緩冲液将0.676毫升磷酸溶液(14.8M)转入到含有1900毫升去离子水的2000毫升烧杯中；将该溶液用氢氧化钠溶液滴定至pH为3。加入水补充至2000毫升并将溶液充分混合。pH为3的10mM乳酸盐緩冲液2000毫升烧杯中加入1.81克乳酸(分子量90.08)和1900毫升去离子水；将所得溶液用氢氧化钠溶液滴定至pH为3。加入水补充至2000毫升并将溶液充分混合。1mM盐酸溶液1毫升2N盐酸溶液转入到含有1900毫升去离子水的2000毫升烧杯中。通过加入更多去离子水将溶液的最终体积调节至2000毫升。0.01yjFA溶液0.2毫升TFA溶液转入到含有1900亳升去离子水的2000毫升烧杯中。通过加入更多去离子水将溶液的最终体积调节至2000毫升并将溶液充分混合。制剂制备原料蛋白质rhGDF-5(Lot#2142131)在2-8。C解冻。原料蛋白质溶液(55毫升，3.8毫克/毫升)使用离心过滤装置(PallLifeScience,Cat#OD010C37,10KMWCO)浓缩至约10毫升的体积。约1.4毫升浓缩的rhGDF-5溶液转入到各个渗析过滤片(cassette)中(Pierce,Cat#66380)过滤片相对于测试緩冲液在2-8。C渗析整夜。rhGDF-5溶液小心/人渗析过滤片中除去并转入到小玻璃并瓦中。溶液的蛋白质浓度使用UV-VlS分光光度计测量。蛋白质以约0.7毫克/毫升和5%(重量/体积)的海藻糖配制在测试緩冲液中，并通过0.22微米过滤器过滤。溶液在冻千之前在2-8i:储存。装填和冻干每个配制溶液以1毫升/瓶装填进3毫升玻璃瓶中(WestPharmaceuticalServices,Cat#)。3皮璃并瓦用塞子(WestPharmaceuticalServices,Cat#)部分封闭并转入冻干器(FTSSystem,LyoStarII)中。热电偶置于空白对照剂瓶中以监测冻干过程。作为对照，还测试了没有海藻糖的另一制剂。将200微升lmM盐酸溶液中浓度为4.5毫克/毫升的rhGDF-5转入到每个玻璃瓶并冻干。分析方法冻干结块的完整性检查冻干样品中冻干结块裂缝、收缩和崩解的每个时间点。重构时间1毫升去离子水加入到每个冻干样品中并轻轻混合。记录重构时间。溶液透明度4见觉外观对小玻璃并瓦中的溶液样品检查透明度和颗粒。样品瓶/使用垂直光线对着黑暗背景检查。将测试样品的透明度与作为对照的纯水样品比较。.pH方法每个溶液样品的pH直接使用校准pH计测量。UV光谱蛋白质浓度使用UV-Vis分光光度计确定。rhGDF-5的浓度使用在280纳米的1.16毫升/毫克*厘米的消光系数计算。HPLC方法非还原(non-reduced)rpHPLC法(TM0051D)用于监测蛋白质的改进类型。测试样品使用50mM乙酸稀释到约0.1毫克rhGDF-5/毫升溶液。稀释样品(每个50毫升)注入到HPLC柱(Vydac218TP52,C18柱)。样品使用水中0.15%(体积/体积)的TFA和乙腈中0.15%(体积/体积)的TFA作为流动相以0.3毫升/分钟洗脱。在214纳米检测到洗脱峰。计算每个峰面积的百分比以监测主峰和较小峰(降解峰)的改变体积排阻色谱(SEC)蛋白质聚集物使用SEC法监测。通常30微升每种测试样品直接注入到SEC柱(TOSOHBioscience,Cat#08540)并且使用水中0.1%(体积/体积)TFA和45%(体积/体积)乙腈以0.5毫升/分钟的速率洗脱。在280纳米监测到蛋白质峰，并且计算聚集物的百分比。凝胶电泳蛋白质聚集物和降解的小块还使用凝胶电泳法监测。通常，约10微克蛋白质被干燥并使用70微升具有或没有10%P-巯基乙醇的SDS-PAGE样品緩冲液(Invitrogen,Cat#LC2676)重构。样品在95°C培养5分钟。约18微升每个样品加载到凝胶(Invitrogen，Cat#NP0341Box)上。凝胶使用流动緩冲液(Invitrogen,Cat#NP0002)在200伏电压流动约35分钟。然后〗疑月史^f吏用Simplybluesolution(Invitrogen,Cat#LC6060)着色并使用去离子水脱色。扫描凝胶并收集图像。生物活性测试仅仅分析6个月稳定的样品(甘氨酸制剂和盐酸制剂)的生物学活性。基于细胞的测试(TM0046)用于测量^5威性磷酸酶活性以确定样品的稳定性。-含水量含水量测试使用卡尔.费歇尔滴定法(KarlFischerTitrationmethod)通过PDD进4亍。结果冻干结块的完整性从时间零点到9-月时间点所有储存条件下的测试样品结块都显示为固体和白色至灰白色。当例如海藻糖或蔗糖的糖类用作填充剂时，通常观察到结块的轻微收缩，或者结块从玻璃瓶的玻璃壁略微分离。所有测试样品没有观察到结块的崩解。结块崩解通常可以改变重构时间并引起蛋白质不稳定。在没有海藻糖的制剂中得到白色、松软和轻质的结块。重构时间在测试时，向每个样品瓶中加入1毫升水。将样品轻轻混合并记录重构时间。结块完全溶解需要约30-40秒。溶液透明度重构的溶液样品在垂直光线下对着黑色背景检查，发现全部试样溶液透明并且无色。.pH使用校准pH计测量重构溶液的pH。在整个研究过程中，全部制剂的pH都没有发生显著变化。含有海藻糖/緩冲剂的制剂样品的pH约为3.0±0.2。没有海藻糖的制剂的pH约为4.0。UV光谱蛋白质浓度在UV-VIS分光光度计上测量。在整个研究中，在含有甘氨酸缓冲液、磷酸盐緩冲液、柠檬酸盐緩冲液、乳酸盐緩冲液或o.oi%TFA的rhGDF-5/海藻糖制剂中，蛋白质浓度没有显著变化。当其在25。C/60。/。和40°C/60%RH储存时，rhGDF-5/海藻糖/盐酸制剂中在280纳米的吸光度增加。蛋白质的浓度在40。C储存的制剂中似乎增加；由时间零点的0.7毫克/毫升的初始蛋白质浓度增加到6-月时间点的1毫克/毫升。这可以暗示海藻糖可能降解成糠醛化合物，其在280纳米具有类似的吸光度。非还原rhHPLC结果非还原rhHPLC法用来监测rhGDF-5的降解物质，其通过蛋氨酸氧化、脱酰胺反应以及其它反应形成。除盐酸制剂和没有海藻糖的制剂外，对于在2-8。C和25t:储存9个月的全部制剂，主峰的百分比没有显著变化。全部制剂在9-月时间点具有小于90%的主峰。然而当制剂在例如4CTC/75%RH的加速卩渚存条件下卩诸存时，^又仅一种制剂(即，rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸)在6-月时间点时具有大于91%的主峰。其它制剂在加速储存条件下不如rhGDF-W海藻糖/甘氨酸制剂稳定。特别地，rhGDF-5/海藻糖/盐酸制剂在6-月时间点仅仅具有66%的主峰。图6和图7表示在4CTC/75%RH储存6个月时rhGDF-S/海藻糖/甘氨酸制剂和rhGDF-5/海藻糖/盐酸制剂的HPLC色谱。图8、9和10表示在5'C、25。C和4(TC储存时各种测试緩冲剂的蛋白质回收百分率。rpHPLC分析结果表明海藻糖和甘氨酸緩沖剂的组合在储存期间为冻干rhGDF-5提供最好的稳定性。此外，由于强酸HC1可能对蛋白质和海藻糖具有一定的去稳定作用，rhGDF-5/海藻糖/盐酸制剂不太稳定。实施例13:rhGDF-5在具有5%海藻糖的pH为3的甘氨酸緩冲剂中在不同温度下的稳定性在此研究中，rhGDF-5以约0.01、0.03、0.1、2.5、4.5和9毫克/毫升与5%(重量/体积)海藻糖和pH为3的5mM甘氨酸-盐酸緩冲液一起配制。配制的溶液用来以1毫升/并瓦添加到3毫升玻璃并瓦中并将玻璃瓶j冻干。冻干的样品瓶在2-8°C、25°C/60%RH和40°C/75%RH储存。在每个指定时间点分析样品的产品稳定性。该研究中使用的方法包括结块外观、重构时间、溶液透明度、pH、rpHPLC(反相高效液相色谱)、UV(紫外光谱)、SEC(体积排阻色谱)和凝胶电泳。在三种储存条件下存储6个月后，在具有低至0.1毫克/毫升至高达9毫克/毫升的蛋白质浓度的制剂中没有观察到显著变化。当蛋白质浓度太低时，例如0.01和0.03毫克/毫升，现有方法不足以检测微小变化。该研究结果表明含有海藻糖和甘氨酸-盐酸并具有不同蛋白质浓度的冻干rhGDF-5制剂在2-8°C、25°C/60%RH至少稳定6个月。在4CTC/75%RH的加速储存条件下在6-月时间点在储存的产品中发现轻微的rpHPLC曲线改变。实施例14:不同浓度的rhGDF-5在具有5%海藻糖的pH为3的甘氨酸缓冲剂中在不同温度下的稳定性在该研究中，rhGDF-5以0.01、0.03、0.1、2.5、4.5和9毫克/毫升的rhGDF-5浓度与5%(重量/体积)海藻糖和pH为3的5mM甘氨酸緩冲液一起配制。此外作为对比，4.5毫克/毫升rhGDF-S与10%(重量/体积)海藻糖和5mM甘氨酸緩沖液(pH为3)—起配制为制剂。然后配制的溶液以1毫升/瓶添加到3毫升玻璃并瓦中并冻干。冻干的样品储存在稳定的容器中。.PH为3的5mM甘氨酸-盐酸緩冲液3x0.75克甘氨酸(分子量75.07克)称重到3x2000毫升的烧杯中，并且向每个烧杯中加入约1900毫升去离子水。溶液使用盐酸滴定至pH为3。向每个烧杯中加入额外的水以达到2000毫升的最终体积并充分混合。制剂制备原料蛋白质rhGDF-5(Lot#2142131)在2-8°。解冻。蛋白质溶液(96毫升，3.8毫克/毫升)使用4离心过滤装置(PallLifeScience,Cat#OD010C37,10KMWCO)浓缩至约24毫升的总合并体积。约3x8毫升浓缩的rhGDF-5溶液转入到3x渗析过滤片(cassette)中(Pierce,Cat#66380),并且过滤片相对于甘氨酸-盐酸缓冲液在2-8X:渗析整夜。rhGDF-5溶液从渗析过滤片中转移到小玻璃瓶中。蛋白质浓度使用UV-Vis分光光度计测量。蛋白质使用5%或10%(重量/体积)的海藻糖和如上所述5mM甘氨酸緩冲液以各种浓度配制。配制的溶液通过0.22微米过滤器过滤，并且在冻干之前在2-8。C储存。填充和冻干每个配制的溶液以1毫升/并瓦添加到3毫升玻璃并瓦(WestPharmaceuticalServices,Cat#)中。塞子(WestPharmaceuticalServices,Cat#)部分》文置在玻璃弁瓦上。样品并瓦转入到冻干器(FTSSystem,LyoStarII)中。热电偶置于空白对照剂弁瓦中以监测冻干过程的温度曲线。使用的分析方法类似于如上所述实施例11和实施例12中的那些。结果冻干结块的完整性从时间零点到6-月时间点，所有储存条件下的测试样品结块都显示为固体和白色。在结块周围观察到轻微的收缩，或者结块从玻璃瓶的玻璃壁略微分离。当例如海藻糖或蔗糖的糖类用作填充剂时这相当普遍。所有测试样品没有观察到崩解的结块。-重构时间在测试时，向每个样品瓶中加入1毫升水。玻璃瓶轻轻混合并记录重构时间。结块溶解需要约30-40秒。溶液透明度当蛋白质溶液使用垂直光线对着黑色背景检查时，全部重构样品透明并且无色。.pH重构溶液用于测量pH。在整个研究过程中，全部制剂的pH都没有发生显著变化。制剂的pH值为3.0-3.3。UV光谱蛋白质浓度使用UV光谱法测量。UV光谱还可提供蛋白质聚集的信息(基线光散射)。对于0.01-0.1毫克/毫升的蛋白质浓度，使用10毫米透明容器。对于2-9毫克/毫升的蛋白质浓度，使用l毫米透明小容器，没有稀释或没有样品破坏。在稳定性研究的整个过程中，在0.1-9毫克/毫升的样品中没有观察到蛋白质浓度的显著变化。对于0.01-0.03毫克/毫升的低浓度样品，由于吸光度太低而没有观察到更多变化。对于未来研究的低浓度样品，应当需要新样品制备方法。非还原rhHPLC结果非还原rhHPLC法用来监测rhGDF-5的降解物质，例如蛋氨酸氧化和脱酰胺。在整个6个月储存期间，在2-8。C、25。C和4(TC储存的全部样品中没有观察到主峰百分比的显著变化。在6个月储存的样品的rhGDF-5的主峰仍然回复为^96%,并且其与从时间零点样品得到的数据是可比的。0.01和0.03毫克/毫升的低浓度样品难以通过HPLC法分析。未来研究应当需要新样品制备。SECSEC用于监测蛋白质聚集。在整个6个月稳定性测试期间，全部样品都没有观察到聚集的显著变化。没有分析0.01和0.03毫克/毫升的低浓度样品。;疑力交电泳蛋白质聚集和分解的物质还使用凝胶电泳监测。在整个6个月稳定性测试期间，全部样品都没有发现显著变化。存储期间没有在任何样品中形成蛋白质的小片段，因为没有在还原SDS-PAGE上发现。含水量样品的含水量低至0.19至0.32%。在蛋白质浓度和含水量之间没有观察到相关性或趋势。通过rpHPLC和SEC色谱证明，所得结果表明冻干的rhGDF-5产品在海藻糖和甘氨酸緩冲剂的存在下在2-8°C、25。C/60。/。RH和40°C/75%RH稳定至少6个月。使用5%(重量/体积)海藻糖/5mM甘氨酸-盐酸緩冲液(pH为3),蛋白质可以在0.1-9毫克/毫升的不同浓度范围配制(冻干之前)并且冻干。当蛋白质以例如0.01毫克/毫升和0.03毫克/毫升的低浓度配制时，现有方法对测定变化具有某些限制。本发明已经根据说明性实施方案进行了说明。由于在不脱离本发明范围的情况下可以对上述制剂作出改变，上述说明或附图中所示的全部物质将作为说明性而非限制性解释。例如本领域熟练技术人员将会认识到，本发明说明性实施方案中的制剂不限于使用BMP,并且可以使用任<可合适的生物体系中的其它生物分子。-还应当理解的是以下权利要求将覆盖本发明此处所述的全部通用和特疋特征，并且本发明范围的全部声明作为语言上的要素将落入其中。。权利要求1.包括至少一种BMP和足以稳定所述BMP的量的海藻糖的组合物。2.权利要求l的组合物，另外包括pH为从约2.5至约3.5的甘氨酸緩冲液。3.权利要求l的组合物，其中所述BMP为rhGDF-5。4.权利要求2的组合物，其中所述BMP为rhGDF-5。5.稳定BMP的方法，包括(a)提供含有至少一种BMP和足以稳定所述BMP的量的海藻糖的组合物，(b)冻干该混合物。6.权利要求5的方法，另外包括加入pH为从约2.5至约3.5的甘氨酸緩冲液。7.权利要求5或权利要求6的方法，其中所述BMP为rhGDF-5。8.植入在哺乳动物中的装置，所述装置包括至少一种冻千BMP,其中BMP已经根据权利要求5的方法冻干。9.权利要求8的装置，另外包括可生物降解的胶原基质。10.权利要求8的装置，其中所述BMP为rhGDF-5。11.植入在哺乳动物中的装置，所述装置包括至少一种冻千BMP,其中BMP已经根据权利要求6的方法冻干。12.权利要求ll的装置，另外包括可生物降解的胶原基质。13.权利要求ll的装置，其中所述BMP为rhGDF-5。全文摘要本发明涉及在各种冻干制剂和组合物中稳定骨形态发生蛋白(BMP′s)。本发明包括主要含有作为赋形剂的海藻糖并且任选含有其它赋形剂的制剂，海藻糖用于冻干组合物以及其随后的储存和重构，其它赋形剂例如缓冲剂和表面活性剂。文档编号A61P43/00GKSQ公开日2009年1月21日申请日期2007年12月14日优先权日2006年12月14日发明者D·苏,R·坎扎达,S·J·萨瓦穆拉,V·R·加里加帕蒂申请人:强生更生医疗有限责任公司