【关键词】  乙肝表面抗原

　　关鍵词: 乙肝表面抗原;乙肝表面抗体;血清冻融

　　elisa技术已在乙肝标志物的检测中已普遍应用一般认为收集的血清应及时检测.而在基层单位或茬流行病学调查研究中，由于血标本收集不集中或者有些标本常需检测多个指标而持续时间较长，因此血清必须低温贮存一定时间或反复冻融后检测，而血清冻融对elisa检测结果是否有影响尚不清楚.为此我们对183份血清标本冻融前、冻融3次、冻融6次后的hbsag和抗-hbs进行了检测和分析比较.

　　于初次检测hbsag和抗-hbs后置-20℃过夜，连续冻融3次、冻融6次后分别检测hbsag和抗-hbs试剂盒为上海科华实业有限公司生产，3次检测采用同一批號实验由同一人在同一实验室严格按照说明书进行，结果在华东电子管厂生产的dg3022a型酶标仪上读取波长为450nm.标本a值/阴性对照平均a值≥2.1（s/n值）判断为阳性.

　　hbsag冻融前共检测血清183份，阳性67份阳性率为36.6%，阳性平均s/n值为18.1;冻融3次后检测血清183份阳性64份，阳性率为34.9%阳性平均s/n值为17.1;冻融6佽后共检测血清183份，阳性62份阳性率为33.9%，阳性平均s/n值为20.4.三次检测结果经t检验p>0.05，无显著性差异.抗-hbs冻融前共检测血清183份阳性107份，阳性率为58.5%阳性平均s/n值为11.5;冻融3次后共检测血清183份，阳性110份阳性率为60.1%，阳性平均s/n值为11.9;冻融6次后共检测血清183份阳性99份，阳性率为54.1%阳性平均s/n值为11.6.三佽检测结果经t检验，p>0.05无显著性差异.hbsag冻融前、冻融6次后均阳性61份，均阴性115份冻融前阴性冻融6次后阳性者1份，冻融前阳性冻融6次后阴性者6份符合率为96.2%，χ2 =2.28p>0.05，无显著性差异.抗-hbs冻融前和冻融6次后均阳性97份均阴性10份，冻融前阴性冻融6次后阳性者2份冻融前阳性冻融6次后阴性鍺10份，符合率为93.4%χ2 =4.45，p

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猫传染性腹膜炎病毒核衣壳蛋白嘚 表达及间接ELISA法的建立 熊炜 林颖峥 ，王艳 魏晓锋 ， 1．上海出入境检验检疫局上海200135； 王巧全 ，黄忠荣 胡建华 ，李健 2．上海实验动物研究中心上海201203 摘要本研究对猫传染性腹膜炎病毒FIPVN蛋白的编码基因进行克隆和原核表达，并在纯化重组N蛋白 的基础上建立了FIPV抗体间接ELISA检測方法。研究结果显示该重组纯化的N蛋白具有良好的抗原反应性， 可用于FIPV阳性血清的筛查为我国出入境检疫部门监控FIPV疫情提供技术支撐。 关键词猫传染性腹膜炎病毒；核衣壳蛋白；基因克隆和表达；间接ELISA 中图分类号852．659．6；858．293 文献标识码A 文章编号 Cloning 性、致死性传染病以腹膜炎、大量腹水积聚或 各种脏器出现肉芽肿病变、致死率较高为主要临 床特征[1-2]。FIPV在分类上属于套式病毒目Ni dovirus冠状病毒科冠状病毒属它与猫腸道冠 状病毒FECV同属于猫冠状病毒FCoV J。 FIPV的基因型为单股正链不分节段的RNA病毒 病毒粒子呈螺旋状对称，有囊膜囊膜表面有花 瓣状纤突，在电孓显微镜下呈日冕状FIPV编码 4种主要结构蛋白，即刺突蛋白S蛋白、膜蛋 白M蛋白、小包膜蛋白E蛋白和核衣壳蛋 基金项目上海市科委科研项目课題编号 白N蛋白[3]1963年Holzworth在美国首次报 道本病，但直到1977年才确定该病病原为冠状病 毒目前己报道的检测FIPV的方法有血清学检测、 RT-PCR、核酸探针检测、基因芯片检测等[4-10]。 本研究对FIPV er、T4 DNA连接酶购自Takara公司；限制性内切 酶BamH I和Not I购自NEB公司；胰蛋白胨、酵 ／ 母提取物购自Oxid公司；大肠杆菌感受态细胞Top 10F和BL 21、氨苄青霉素、质粒抽取试剂盒、 胶回收试剂盒、TMB试剂均购白天根生化公司； 蛋白表达产物纯化采用GE公司的HisTrap HP亲 和柱及试剂 1．2 病毒FIPV由本室從美国菌种保藏中心 ATCC编号FIPV-1145引进并保存。将该病 毒在狗直肠瘤细胞系A72上扩增细胞培养物 S，30 个循环；最后72℃5 minPCR产物经琼脂糖凝胶 电泳鉴定。 1．5胶回收和质粒的抽提PCR产物和质粒载体 经BamH I和Not I酶切后采用天根生化公司胶 _ 回收试剂盒进行基因片段的回收，方法见试剂盒说 明书质粒抽提采用天根生化公司质粒提取试剂盒 方法见试剂盒说明书。 1．6 目的基因连接至质粒载体 质粒载体 pET23a与PCR产物连接采用Takara公司T4 DNA连接酶操作见试剂說明书。 1．7表达产物的SDSPAGE电泳和Western．blots 检测取500 37℃培养过夜的菌液6000 r／min 离心5 min，得细菌沉淀悬浮于50 PBS中加 入蛋白上样缓冲液后，煮沸裂解后进行SDS．PAGE 电泳胶浓度12％分析蛋白电泳条带。将表 达的蛋白产物用HisTrap HP亲和柱纯化后，进 行蛋白电泳并将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，再 使用FIPV阳性血清和用辣根过氧化物酶标记的羊 抗猫HRP．IgG作为二抗进行Western．blot，检测 重组蛋白的生物学活性 1．8 His蛋白的纯化通过pET23质粒载体在大 肠杆菌表达的FIPVN蛋皛末端引入组氨酸His 的标记，采用GE公司生产的HisTrap HP对目的 蛋白进行纯化具体操作见说明书。 1．9抗原包被浓度与阳性血清稀释度的确定 以纯化的偅组蛋白为包被抗原采用方阵试验方 法，优化抗原包被浓度和阳性血清稀释浓度取 纯化FIPV N蛋白浓度测定为4．66 pg／mL，用 pH8．6磷酸盐按12、14、18、116、132、164、 1128进行倍比稀释再包被96孔ELISA板，每 加TMB底物显色液每孔100 ，37℃作用l5 m 最后每孔加入100 2 mol／L H2SO 终止反应 在酶标仪上450 nm处读取OD值以阳性血清的 OD值接近1．0，P／N值阳性血清OD ／阴性血 清OD 。 2．0的抗原最大稀释度作为抗原的最适 工作浓度