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&&&人脐带源间充质干细胞条件培养液对人肝癌HepG2细胞生长的影响
人脐带源间充质干细胞条件培养液对人肝癌HepG2细胞生长的影响
Effects of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on cell growth of human hepatocellular carcinoma HepG2 cell
目的 探讨人脐带源间充质干细胞(HUC-MSC)条件培养液(CM)对人肝癌HepG2细胞生长的影响.方法 选择2011年2月至2014年1月于中国人民解放军第105医院妇产科分娩的35例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带为研究对象,取其用于分离、培养并扩增HUC-MSC.传代扩增至第3代HUC-MSC融合达80％时,更换培养液,继续培养24 h后收集上清液,即为HUC-MSC-CM备用.将对数生长期的人肝癌HepG2细胞按照随机数字表法随机分成相等的3份,分别于含50％,20％及不含HUC-MSC-CM的培养中培养,并分别纳入高含量组、低含量组和空白对照组.采用倒置显微镜观察人肝癌HepG2细胞生长状态,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和细胞划痕愈合实验分别检测3组人肝癌HepG2细胞增殖和迁移情况,并采用流式细胞术(FCM)法检测各组细胞的细胞周期变化情况.本研究遵循的程序符合中国人民解放军第105医院人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准,脐带获取前,均征得孕妇知情同意,并与之签署临床研究知情同意书.结果 ①所分离的原代HUC-MSC培养至第3代后,细胞形态开始比较均一.②MTT法检测结果显示,人肝癌HepG2细胞培养24,48和72 h时,3组相对吸光度(A)值比较,差异均有统计学意义(F=21.330,6.223,9.345;P=0.004,0.032,0.027),且在这3个时间点,高含量组和低含量组相对A值均显著高于空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05),高含量组相对A值亦显著高于低含量组,差异亦均有统计学意义(P＜0.05).③划痕愈合实验结果显示,3组人肝癌HepG2细胞过河时间比较,差异有统计学意义(F=12.860,P=0.025),且高含量组人肝癌HepG2细胞过河时间短于低含量组和空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05),低浓度组人肝癌HePG2细胞过河时间亦短于对照组,差异亦有统计学意义(P＜0.05).④FCM法检测人肝癌HepG2细胞周期结果显示,3组G0/G1期和S期人肝癌HepG2细胞比例比较,差异均有统计学意义(F=30.600,30.590;P＜0.05).且与空白对照组相比,高含量组和低含量组人肝癌HepG2细胞G0/G1期细胞比例显著降低,S期细胞比例显著增加,差异均有统计学意义(P＜0.01);且高含量组G0/G1期细胞比例比低含量组下降更显著,而S期细胞比例显著增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 HUC-MSC-CM可促进入肝癌HepG2细胞增殖和迁移,并可促进人肝癌HepG2细胞周期G1/S转换.
摘要： 目的 探讨人脐带源间充质干细胞(HUC-MSC)条件培养液(CM)对人肝癌HepG2细胞生长的影响.方法 选择2011年2月至2014年1月于中国人民解放军第105医院妇产科分娩的35例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带为研究对象,取其用于分离、培养并扩增HUC-MSC.传代扩增至第3代HUC-MSC融合达80％时,更换培养液,继续培养24 h后收集上清液,即为HU...&&
Abstract：
Objective To investigate the effect of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (HUC-MSC) condition medium (CM) on cell growth of hepatocellular carcinoma HepG2 cell.Methods From February 2011 to January 2014,a total of 35 cases of full-term pregnancy healthy fetuses' umbilical cords were chose into this study.All the fetuses were delivered through uterine-incision in the 105th Hospital of People's Liberation Army.Mesenchymal stem cells were derived from human umbilical cord and expanded in vitro.When the confluence of the third generation reached 80％,the medium was changed to fresh medium.After 24-hour incubation,the supernatant HUC-MSC-CM was collected.Then the HepG2 cells in logarithmic growth phase were divided into 3 equal groups randomly by random number table method.They were cultured with 5 ％ fetal calf serum high glucose (HG)-DMEM fresh medium alone as the control group,and the experimental group were cultured with 25％ HUC-MSC-CM together with 5％ fetal calf serum HG-DMEM (low concentration group) and 50％ MSC-CM together with 5％ fetal calf serum HG-DMEM (high concentration group),respectively.HepG2 morphology was observed by inverted microscope.The abilities of proliferation were detected by 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) method,and the migration of HepG2 cells in each group were detected by wound healing assay.The cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry (FCM).The study protocol was approved by the Ethical Reviews Board of Investigation in Human Being of the 105th Hospital of People's Liberation Army.Informed consent was obtained from all participants.Results ① The morphology of isolated primary HUC-MSC was uniform when cultured into the third generation.②MTT assay showed that when the HepG2 cells were cultured 24,48 and 72 h,the differences of relative absorbance (A) values in the three groups were statistically significant (F=21.330,6.223,9.345;P=0.004,0.032,0.027).And the relative A values of HepG2 cells in two experimental groups significantly increased than that in control group at these three time points,and the differences were statistically significant (P ＜ 0.05);the relative A values of HepG2 cells in high concentrations group was also significantly higher than in low concentration group,and the difference was also statistically significant (P＜ 0.05).③)Wound healing assay showed that the difference of healing time of HepG2 cell in three groups was statistically significant (F=12.860,P=0.025),and the healing time in high concentration group was shorter than that in the low concentration group and control group,the differences were statistically significant (P＜0.05);the healing time in the low concentration group was shorter than that in the control group,the difference was statistically significant (P ＜ 0.05).④ FCM assay showed that there were significant differences among the percentage of cells in G0/G1 phase and S phase in three groups (F =30.600,30.590;P＜0.05).And compared with control group,the percentage of HepG2 cells in G0/G1 phase of high concentration group and low concentration group were significantly decrease,and the percentage of cells in S phase were higher,all the differences were statistically significant (P＜0.01).The percentage of cells in G0/G1 phase of the high concentration group decreased more significantly than that in low concentration group,while the percentage of cells in S phase increased more significantly,the differences were statistically significant (P ＜ 0.05).Conclusions HUC-MSC-CM could promote the proliferation and migration of HepG2 cells,and it can accelerate cell cycle G1/S phase transition.
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细胞划痕实验中到底要不要用血清培养
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细胞划痕实验中到底要不要用血清培养动物血清在细胞培养中提供细胞增殖所需的生长因子、激素、转移蛋白、贴壁和铺展在培养基质上的因子、蛋白酶抑制剂和其他营养物质。使用血清的优点是血清含有促进细胞增殖和维持的大部分因子，它几乎是通用的生长添加物，适用于动物、人和昆虫细胞等的细胞培养。因而使用血清不需要为每一个细胞系优化培养基，节省了大量时间和精力。在无血清培养基出现之前，血清被广泛用于细胞培养达几十年之久。无血清培养基取代含血清的培养基已成为未来细胞培养的趋势。然而无血清培养基也存在着一些劣势。无血清培养基目前价格偏高，另外，一般无血清培养基通用性不高，不同类型的细胞株或细胞系可能需要不同的添加成分。处于发育的不同分化阶段的细胞(例如干细胞与定向前体细胞相比)需要不同的配方，对生长因子和细胞因子的选择尤为重要。细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。而且在去除血清的同时，也去除了一些血清蛋白具有的保护、解毒作用，因此对试剂、水的纯度和仪器清洁度的要求更高。
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细胞划痕实验
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细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。材料：
6孔板、marker笔、直尺、20微升枪头（灭菌）、无血清培养基、PBS准备：
所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）流程：
1、先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。
2、在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。
3、第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不要倾斜。
4、用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。
5、放入37℃5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24小时取样，拍照。
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为什么要加入无血清培养基啊？这样的话细胞会不会生长非常慢？
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swucxy 为什么要加入无血清培养基啊？这样的话细胞会不会生长非常慢？用无血清培养基培养就是要排除血清对细胞增殖的影响，更直观的反应细胞迁移的情况，而且血清中的某些因子有可能会对加药组的某些药物产生影响，无血清培养基固然会对细胞生长不利,但是短时间影响不大呢 后期有其他的实验问题都是可以私信的哦
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细胞培养常识（一）
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1.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO?除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，1）可以放入含有10-15ml新鲜培养基之培养瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO，2）直接离心后，丢上清，将细胞悬浮，补足培养基后培养。如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。2.可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。因为PH和培养基的基础成分不同。3.可否使用与原先培养条件不同之血清种类?不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。最好一批实验用同一批次的血清。 详见网址：
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