多发性骨髓瘤的治疗方案出现血象很低是什么情况？
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时间：2018-08-08 05:17
荧光原位杂交技术检测多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞白血病分子遗传学异常及其临床意义
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荧光原位杂交技术检测多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞白血病分子遗传学异常及其临床意义
分 类 号 学校代码 10487学号 D 密级博士学位论文荧光原位杂交技术检测多发性骨髓瘤和慢 性淋巴细胞白血病分子遗传学异常 及其临床意义学 位 申 请 人 ： 陈蕾 学 科 专 业 ： 内科学（血液病） 指 导 教 师 ： 胡豫教授 答 辩 日 期 ： 2012 年 5 月 A dissertation submitted to Huazhong University of Science and Technology for the Degree of Doctor of MedicineClinical significance of genetic abnormalities detected by interphase fluorescence in situ hybridization in multiple myeloma and chronic lymphocyte leukemiaD.Candidate Major Supervisor: Chen Lei : Hematology : Prof. Hu YuHuazhong University of Science & Technology Wuhan 430074, P. R. ChinaMay 2012 独创性声明本人郑重声明， 本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名： 日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□ ，在_____年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密□。 （请在以上方框内打“√” ）学位论文作者签名： 日期： 年 月 日指导教师签名： 日期： 年 月 日 目录主要缩略词表…………………………................………………………………………………………..1 前言……………………………………………………………………................………………………..2 中文摘要.…………………………………...............……………………………………………………. 5 Abstract…………………………………………………………………………………………...............8 第一部分 FISH 检测多发性骨髓瘤分子遗传学异常及其临床意义.....................................................12 材料和方法……………………………….............................................................…..………………… 12 结果…………….........................................................................………………………...………………20 讨论…………………….........................................................................……………...…………………31 参考文献……….................................................................……………………...………………………34 第二部分 cIg FISH 与 FISH 检测多发性骨髓瘤方法学比较................................................................37 材料和方法………………………………................................................................……………………37 结果…………….........................................................................……………………...…………………44 讨论…………………….........................................................................………………...………………46 参考文献……….................................................................……………………………...………………47 第三部分 FISH 检测慢性淋巴细胞白血病分子遗传学异常及其临床意义.........................................49 材料和方法……………………………….............................................................……….......…………49 结果…………….........................................................................………………………………...………54 讨论…………………….........................................................................…………………………...……59 参考文献……….................................................................…………………………………………...…60 结论…………………………………………….. …….............................................................................63 综述……………………………………………………............................................................................65 参考文献……………………………………………………....................................................................70 致谢……………………………………………….……...........................................................................75 附录： 攻读学位期间已发表的论文..........................................................................................................77 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文英文缩略词表英文缩写 MM CLL FISH cIg FISH PFS OS MGUS 英文全称 Multiple myeloma Chronic lymphocyte leukemia Fluorescence in situ hybridization Cytoplasmic immunoglobulin light chain FISH Progression-free survival Overall survival Monoclonal significance SMM sCR CR VGPR PR SD ORR RB1 IGH IGL CCND1 FGFR3 MAF ATM Smoldering multiple myeloma Stringent complete response Complete response Very good partial response Partial response Stable disease Overall response rate Retinoblastoma 1 Immunoglobulin heavy chain Immunoglobulin light chain Cyclin D1 Fibroblast growth factor receptor 3 Musculoaponeurotic fibrosarcoma The mutated form of the ataxia-telangiectasia gene Nuclear factor κ B 4',6-diamidino-2-phenylindole 冒烟型多发性骨髓瘤 严格完全缓解 完全缓解 非常好的部分缓解 部分缓解 疾病稳定 总缓解率 遗传性视网膜母细胞瘤致癌因子 免疫球蛋白重链基因 免疫球蛋白轻链基因 周期蛋白 D1 成纤维细胞成长因子受体 3 肌腱膜纤维肉瘤癌基因 共济失调性毛细血管扩张症基因突 变形式 NF-κ B DAPI 核因子κ B 4,6-二脒基-2-苯基吲哚 gammopathy of undetermined 中文名称 多发性骨髓瘤 慢性淋巴细胞白血病 荧光原位杂交 胞质轻链免疫荧光原位杂交 无进展生存期 总生存期 意义未明单克隆免疫球蛋白血症1 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文荧光原位杂交技术检测多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞 白血病分子遗传学异常及其临床意义博士研究生：陈蕾 导师：胡豫教授 华中科技大学附属协和医院血液病研究所前言多发性骨髓瘤（MM）是分化终末期的 B 细胞（浆细胞）异常增殖，从而产生大 量单克隆免疫球蛋白的恶性疾病。其临床症状包括浆细胞瘤性包块导致的压迫，骨髓 造血微环境的改变从而使得造血功能下降血细胞减少，骨质破坏，蛋白沉积导致器官 功能损失，免疫抑制导致感染等。 MM 的单克隆浆细胞中存在多种复杂的染色体异常， 且染色体异常在浆细胞的克 隆增殖过程中发生较早， 参与疾病的发生发展。多数 B 细胞肿瘤中可发现免疫球蛋白 重链基因 IGH 易位和轻链基因 IGL 的易位。 研究发现 IGH 易位存在于近 50%的 MGUS 或 SMM 中， 髓内 MM 中可发现 55~70%存在 IGH 易位， 原发性浆细胞白血病中 80%， 人类骨髓瘤细胞系中 90%。由此可见，IGH 易位或许是 MM 发病中的早期遗传异常 事件，且与疾病的进展有关。大多数 IGH 易位见于以下位点，影响定位于附近的基 因表达：11q13(CCND1)，4p16(FGFR3 和 MMSET)，16q23(c-MAF)，6p21(CCND3)， 20q11(MAFB)， 这些基因表达的改变， 对于 MM 患者的治疗以及预后均有不同程度的 影响。IGL 染色体的改变较为罕见，研究资料较少。MM 患者中有 30~50%存在 13q 染色体缺失 （del13q） 对于接受常规化疗或者行自体干细胞移植术前的大剂量化疗的 ， 患者，del13q 是不良预后因素之一。1q21 染色体扩增(amp1q21)，见于约 40%的 MM 患者，存在 amp1q21 的患者预后较差，生存期较短，易复发。约 10%MM 患者可发 现 17p13 染色体缺失 （del17p13） 此类患者病情进展快， ， 生存期短， 对治疗反应较差， 髓外病变、 高钙血症及浆细胞瘤的发生率较高， del17p13 被认为是 MM 高危因素之一。2 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文大量临床研究证实，MM 患者染色体异常在疾病发生发展过程中起着举足轻重的作 用，对于指导治疗、判断预后均有重要的临床意义。 MM 主要在老年人群中发病，近年来，MM 有发病低龄化和发病率增高的趋势。 迄今为止， MM 仍然是个不可治愈的疾病。 治疗的主要目标是延长无进展生存期 （PFS） 和总生存期（OS） 。马法兰联合地塞米松做为初治 MM 患者的一线治疗方案已有 40 余年，可获得中位生存期 29 至 37 个月。近十余年，临床医生更倾向于对低于 65 岁 患者进行自体造血干细胞移植治疗， 但高龄患者以及有严重临床并发症的患者并无法 耐受。因 MM 本身是老年人疾病，患者的中位年龄在 60 岁左右，这意味着在初治期 近半数的患者无法选择大剂量化疗。因此，选择安全有效的治疗方法，对这部分患者 群来说尤为重要。 硼替佐米，是一种硼酸二肽，是首次应用于人类疾病治疗的蛋白酶体抑制剂。可 通过干扰细胞信号通路而中断细胞周期，介导凋亡，抑制血管新生。其主要作用即抑 制 NF-κ B，从而干扰 NF-κ B 介导的细胞存活、肿瘤生长以及血管新生。在 MM 的 治疗中显示出其巨大的优势。 多项临床试验证实了硼替佐米以及硼替佐米联合应用其 他药物对于初治及复发的 MM 患者，均有较好的疗效。 在适合使用大剂量化疗和自体移植的 MM 患者中，若能够达到完全缓解（CR） 或至少接近完全缓解（VGPR） ，可获得较长的 PFS 和 OS。在不适合做自体移植的 MM 患者，如高龄患者中，使用传统化疗方法很难获得 CR，随着近年来新药的研发， 沙利度胺和硼替佐米的临床应用，大大提高了此类患者的 CR 以及 VGPR 率。 慢性淋巴细胞白血病（CLL）是单克隆 CD5+ B 细胞在外周血、骨髓以及淋巴组 织中恶性增殖的疾病。发病人群多为老年人，其发病中位年龄为 70 岁，发病率随着 年龄增高而增多，男性患者多见。在西方国家，CLL 是发病率最高的血液系统恶性疾 病。CLL 的中位生存期近 10 年，个体的预后存在很大的差异。随着诊断水平的进步， 多数 CLL 病人可以在疾病早期获得诊断，但是病情进程却呈现出很大的不同，部分 病人进展迅速，而部分病人病情可稳定 10 年以上，期间并不需要特殊治疗。因此， 在病情早期，进行准备的预后判断，选择合适的治疗方式尤为重要。 Rai 和 Binet 分期对 CLL 预后的判断曾起着举足轻重的作用，但是无法区分相同3 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文分期病人中预后的不同。多数的病人就诊于疾病的早期阶段，因此，临床医生只能通 过实验室的多项检测来推测患者的病程进展。CD38 表达和 ZAP-70 表达同样是较经 典的评估 CLL 的预后因素。除此之外，免疫球蛋白重链基因可变区的突变（IGHV） 同样是重要的预后因素之一。 最近研究表明细胞遗传学异常对了解疾病进展和评估疾 病预后有重要的临床意义。在 CLL 中，预后好的相关因素包括 IGHV 存在突变、低 CD38 表达、低 ZAP-70 表达以及不存在 17p 和 11q 缺失。 由于 MM 细胞和 CLL 细胞均为为分化终末期 B 细胞，增殖活性较低，分裂相不 易获得，大多处于分裂间期。常规 G 显带分析仅可以发现 30%的患者存在染色体异 常。而部分染色体改变，如 t(4;14)(p16.3;q32)，存在于 15~20%的 MM 患者中，在常 规核型分析中是无法识别的；t(14;16)(q32;q23)如果不借助其他特殊技术，则在 G 显 带分析中很难分辨出。 荧光原位杂交（FISH）技术，可对间期细胞进行染色体定位分析，检出率高，灵 敏度高，操作简单，不仅可用来检测三倍体或单倍体改变，也可检测染色体区段的缺 失或扩增，亦可检测染色体的异常易位。在中期分裂相不易获得的 MM 和 CLL 中具 有更突出的优势，可检测到与预后密切相关的累及基因位点的微缺失，异常克隆检出 率可显著提高，并且 FISH 检测还可以相对定量恶性克隆细胞的比例。随着 FISH 技 术的广泛应用，对 MM 和 CLL 的分子遗传学研究踏上了一个新台阶，检出率的提高 以及对更多复杂染色体异常的确认，不仅为发病机制的研究提供了更多的依据，也为 更好的开展临床诊治提供了支持。 由于部分 MM 患者骨髓浆细胞比例并不高，在 FISH 检测中，阳性率的检出依赖 于骨髓穿刺术所获得的良好的浆细胞比例，为了更准确的得知 MM 染色体的异常率， FISH 检测最好在克隆性浆细胞上进行。对于浆细胞的识别，目前主要有两种方式： CD138+磁珠分选和胞质轻链免疫荧光原位杂交法（cIg FISH） 。对于骨髓浆细胞比例 较低的患者，通过这两种浆细胞识别方法进行 FISH 检测具有重要的临床意义。 本研究 FISH 检测分析了大量临床 MM 与 CLL 患者标本，比较国人染色体异常 与国外文献报告的异同，并初步分析了染色体异常的临床意义。4 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文中文摘要第一部分 FISH 检测多发性骨髓瘤分子遗传学异常及其临床意义目的：了解中国人群 MM 患者的分子细胞遗传学异常情况，并探讨其临床意义。 方法：间期 FISH 技术检测 166 例初治多发性骨髓瘤患者的骨髓标本，汇总临床 资料，分析染色体异常与临床特征、治疗反应以及预后的关系。 结果：经 FISH 检测，88.0%（146/166）的 MM 患者存在不同程度的染色体异常， IGH 易位，即 t(14q32)，其异常率为 58.4%。其中 t(11;14)为 25.9%，t(4;14)为 17.5%， t(14;16)为 7.2%， 其他未确定的易位 7.8%。 del13q14， RB1 探针检出的异常率为 55.4%， D13S319 检出率为 53.6%。amp1q21 为 49.4%，del17p13 为 25.3%。其分子遗传学异 常与患者就诊时多项临床指标关系密切。使用硼替佐米化疗方案可改善患者的，尤其 存在 del13q14 患者的 CR+VGPR 率（p=0.004） 。染色体异常与患者的无进展生存期 （PFS）有关，最显著的为 del17p13 患者中位 PFS 为 4.9 月，无 del17p13 患者的中位 PFS 为 8.9 月（p&0.001） 。amp1q21 患者的中位 PFS 为 5.9 月（vs 8.8 月，p=0.002） 。 t(14;16)患者中位 PFS 为 3.0 月（vs 7.1 月，p=0.006） 。del13q14 的患者中位 PFS 为 6.7 月 （vs 8.6 月， p=0.043） del13q14 患者中合并 del17p13 的中位 PFS 较短 。 （4.6 月 vs 8.0 月，p=0.002） 。而在无 del17p13 的患者中，del13q14 患者与无 del13q14 患者的 PFS 无明显差异。 结论：中国人群 MM 患者的 del17p13 发生率较高，其余分子细胞遗传学异常率 与西方国家人群类似。MM 患者的染色体异常与临床特征、治疗反应和预后都有着密 切的联系。 关键词：多发性骨髓瘤，荧光原位杂交技术，细胞遗传学，预后5 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第二部分 cIg FISH 与 FISH 检测多发性骨髓瘤方法学比较目的：探讨 cIg FISH 与 FISH 对多发性骨髓瘤染色体异常检出率的差异。 方法：cIg FISH 与 FISH 同时检测同一 MM 患者的骨髓样本，比较其检出率的差 异，共比较 55 例 MM 患者的检出结果。 结果：55 名 MM 患者中，cIg FISH 检出 del13q14 阳性率为 58.2%(32/55)，常规 FISH 检出率为 41.8%(23/55)。 amp1q21 的 cIg FISH 检出阳性率为 52.7%(29/55)，常规 FISH 检出率为 40.0%(22/55)。在浆细胞&30%的患者中，del13q14 的 cIg FISH 检出率 为 51.9%(14/27)，常规 FISH 检出率为 22.2%(6/27)，差异有统计学意义（p=0.024） 。 amp1q21 的 cIg FISH 检出率为 55.6%(15/27)，常规 FISH 检出率为 29.6%(8/27) （p=0.054） 。在浆细胞&30%的患者中，cIg FISH 与 FISH 检测的阳性率并没有明显的 差异。 结论：在浆细胞低于 30%的 MM 患者中，使用 cIg FISH 检测染色体异常可明显 提高检出率。 关键词：多发性骨髓瘤，荧光原位杂交技术，胞质轻链免疫荧光原位杂交6 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第三部分 FISH 检测慢性淋巴细胞白血病分子遗传学异常及其临床意义目的：了解中国人群 CLL 患者的分子细胞遗传学异常情况，并探讨其临床意义。 方法：间期 FISH 技术检测 94 例 CLL 患者的外周血标本，汇总临床资料，分析 染色体异常与临床特征的关系。 结果：经 FISH 检测，81.9%（77/94）的患者存在不同程度的染色体异常。其中 35 名患者存在 2 种以上的染色体异常。最常见的染色体异常为 del13q14，阳性率为 55.3%（52/94） 。其次为+12，阳性率为 25.5%（24/94） 。del11q22 见于 19.1%（18/94） 的患者。del17p13 阳性率为 17.0%（16/94） 。Del11q22 和/或 del17p13 的患者分期多为 Rai 3 期和 4 期，以及 Binet C 期。del11q22 与 Rai 分期具有明显相关性（r=0.223， p=0.030） 。del17p13 与 Rai 分期（r=0.310，p=0.003）及 Binet 分期（r=0.229，p=0.032） 均呈明显相关。且 del11q22 细胞比例与 Binet 分期（p=0.001）有密切的相关性。 结论：中国人群 CLL 患者的分子细胞遗传学异常率与西方文献报道类似。CLL 染色体异常与临床分期等临床特征有密切的联系。 关键词：慢性淋巴细胞白血病，荧光原位杂交技术，细胞遗传学7 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文AbstractPart I Clinical significance of cytogenetic abnormalities detected by interphase fluorescence in situ hybridization in newly diagnosed multiple myeloma patientsObject: To investigate the clinical significance of the chromosomal changes in Chinese MM patients. Method: Interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) on bone marrow (BM) cells was performed in 166 enrolled MM patients. Relationships between chromosomal abnormalities and clinical features, response to therapies and prognosis were analyzed. Results: As a result of FISH, 88.0% (146/166) patients had chromosome changes. The incidences of each probe were IGH 58.4%, t(11;14) 25.9%, t(4;14) 17.5%, t(14;16) 7.2%, undetermined t(14q32) 7.8%. RB1 55.4%, D13S319 53.6%, amp1q21 49.4%, and del17p13 25.3%. Each cytogenetic abnormality was significantly correlated to clinical features. Treatments with bortezomib gave patients a notably higher CR+VGPR rates, especially for patients with del13q14 (p=0.004). The media PFS of patients with del17p13 was 4.9 months (vs 8.9 m, p&0.001). The media PFS of patients with amp1q21 was 5.9 m (vs 8.8m, p=0.002). And t(14;16) was 3.0 m (vs 7.1 m, p=0.006), del13q14 was 6.7 m (vs 8.6 m, p=0.043). Among patients with del13q14, the ones with del17p13 had a shorter median PFS(4.6m vs 8.0m, p=0.002). And among patients without del17p13, there's no significant difference of PFS between patients with and without del13q14. Conclusion: Chinese MM patients had a higher del17p13 rate compared with people in western countries. The other prevalence of chromosomal abnormalities of MM patients was similar in Chinese and other people. Cytogenetic changes were associated with patients'8 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文responses to therapies and prognosis. Key words: multiple myeloma, fluorescence in situ hybridization, cytogenetic, prognosis9 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文Part II Comparison of cytoplasmic immunoglobulin light chain FISH and normal FISH on detecting cytogenetic abnormalities in multiple myeloma patientsObject: To compare the positive rates of cytogenetic changes detected by cIg FISH and normal FISH in myeloma patients. Method: To perform cIg FISH and FISH on same patient's sample and compare the positive rates. 55 myeloma patients were analyzed in all. Results: As a result of cIg FISH, 58.2%(32/55) patients had del13q14 compared with 41.8%(23/55) by normal FISH. And 52.7%(29/55) patients had amp1q21 by cIg FISH compared with 41.8%(23/55). Among the patients with plasma cells&30%, cIg FISH found 51.9%(14/27) del13q14 patients compared with 22.2%(6/27) by normal FISH (p=0.024). And 55.6%(15/27) amp1q21 patients compared with 29.6%(8/27) (p=0.054). But in patients with plasma cells&30%, the positive rates showed no significant difference between cIg FISH and normal FISH. Conclusion: Among the patients with plasma cells&30%, cIg FISH improved the detection rate of cytogenetic abnormalities significantly. Key words: multiple myeloma, fluorescence in situ hybridization, cytoplasmic immunoglobulin light chain FISH10 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文Part III Clinical significance of cytogenetic abnormalities detected by interphase fluorescence in situ hybridization in chronic lymphocyte leukemia patientsObject: To investigate the clinical significance of the chromosomal changes in Chinese CLL patients. Method: Interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) on peripheral blood cells was performed in 94 CLL patients. Relationships between chromosomal abnormalities and clinical features was analyzed. Results: As a result of interphase FISH, 81.9%(77/94) patients had chromosome changes. 35 patients had more than one abnormalities. The most frequent change was del13q14, the incidence of that was 55.3%(52/94). The next was trisomy 12, which was observed in 25.5%(24/94) patients. The incidence of del11q22 was 19.1%(18/94), del17p13 was 17.0%(16/94). Most del11q22 or/and del17p13 patients were in Rai stage 3 and 4, and in Binet stage C. Del17p13 had a significant relationship with Rai stage(r=0.310，p=0.003) and Binet stage(r=0.229，p=0.032). The percentage of del11q22 cells was significantly correlated to Binet (p=0.001) stage systems. Conclusion: The prevalence of chromosomal abnormalities of CLL patients was similar compared to literatures. Cytogenetic changes were associated with patients' clinic stages. Key words: chronic lymphocyte leukemia, fluorescence in situ hybridization, cytogenetic11 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第一部分 FISH 检测多发性骨髓瘤分子细胞遗传学异常 及其临床意义多发性骨髓瘤（MM）是单克隆浆细胞的异常增殖性疾病。MM 患者的临床进程 呈现出很大的差异。大量遗传学的研究证明 MM 与其他血液系统恶性疾病一样，其 单克隆浆细胞存在多种复杂的染色体异常，对 MM 的诊治具有重要临床意义。1-4 传 统的染色体检查方法是 G 显带细胞遗传学技术，需细胞培养、染色体制备，且染色体 分析需要有较好质量的中期分裂相。MM 的中期分裂相不易获得，异常克隆检出率较5-7 低， 对疾病的预后提示作用小。 间期荧光原位杂交 （Fluorescence in situ hybridization,FISH）技术不需要中期分裂相，可分析大量间期细胞，且具有操作相对简单、敏感性 和特异性高的优点，FISH 不仅能够检测染色体的异常扩增与缺失，同样能检出染色 体的平衡易位，大大提高了 MM 染色体异常的检出率。材料和方法一、实验试剂 1、肝素钠（Heparin Sodium）抗凝剂，2ml：12500 单位，购自南京新百药业公司。 2、MM FISH 检测试剂盒（MM FISH test kit，货号 F01003-02） ，购自北京金菩嘉医 疗科技有限公司。包括杂交缓冲液，DAPI 及以下探针：探针名称 RB1 D13S319 1q21 P53 IGH 检测位点 13q14 13q14.3 1q21 17p13 14q323、IGH/CCND1 FISH 检测试剂盒（Vysis LSI IGH/CCND1 Dual Color Dual Fusion12 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文Probes kit，货号 05J69-001） ，购自美国雅培公司。 包括：a. IGH/CCND1 双色融合探针 b. 杂交缓冲液 4、IGH/FGFR3 FISH 检测试剂盒（Vysis LSI IGH/FGFR3 Dual Color Dual Fusion Probes Kit，货号 05J74-001） ，购自美国雅培公司。 包括：a. IGH/FGFR3 双色融合探针 b. 杂交缓冲液 5、IGH/MAF FISH 检测试剂盒（Vysis LSI IGH/MAF Dual Color Dual Fusion Probes kit，货号 05J84-004） ，购自美国雅培公司。 包括：a. IGH/MAF 双色融合探针 b. 杂交缓冲液 6、4-壬基苯基-聚乙二醇， （Nonidet P-40，NP-40，octylphenoxypolyethoxyethanol） ， 购自 Sigma 公司。 7、1:15000 胃蛋白酶，购自武汉天傲公司 8、无水乙醇，甲醇，冰醋酸，氯化钾，氯化钠，柠檬酸钠（国产分析纯） 。二、主要实验仪器 1、电子天平，美国 Mettler Toledo 公司 2、恒温水浴箱，上海新苗有限公司 3、电热恒温培养箱，上海新苗有限公司 4、水平离心机，湖南赛特湘仪公司 5、BX51 荧光显微镜，日本 Olympus 公司 6、ProgResMFcool 显微镜分析仪 7、净水机，美的公司 8、0.5-1000μ l 移液器，德国 Eppendoff 公司 9、-20 度及 4 度冰箱，容声电器有限公司13 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文三、主要实验试剂的配制 1、标准柠檬酸盐贮存液：20×SSC 氯化钠 柠檬酸钠 去离子水 88g 44g 400ml充分溶解，用盐酸调节 pH 值至 5.3，去离子水定容至 500ml。 2、标准柠檬酸盐工作液：2×SSC 20×SSC（pH5.3） 100ml 去离子水 800ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0±0.2，去离子水定容至 1L。 3、各浓度乙醇溶液：70％乙醇：将 700ml 无水乙醇，用去离子水稀释至 1L；85％ 乙醇：将 850ml 无水乙醇，用去离子水稀释至 1L。 4、0.1%NP-40/2×SSC 洗涤溶液 20×SSC（pH5.3） 40ml NP-40 去离子水 0.4ml 300ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0±0.2，去离子水定容至 400ml。 5、0.3％NP-40/0.4×SSC 洗涤溶液 20×SSC（pH5.3） 20ml NP-40 去离子水 3ml 950ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0-7.5，去离子水定容至 1L。 6、氯化钾低渗液（0.075 M KCl） KCl 去离子水 2.795g 300ml充分混匀，用去离子水定容至 500ml。 7、固定液： （甲醇：冰乙酸体积比 3：1）14 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文量取 30ml 甲醇和 10ml 冰乙酸，充分混匀，使用前新鲜配制。 8、胃蛋白酶工作液： 1:15000 胃蛋白酶 10M HCL 去离子水 50μ l 50μ l 50ml四、实验方法与步骤 1、病例收集及分类：从 2008 年 3 月至 2011 年 12 月，在协和医院、解放军 301 医院、 武汉市第一医院以及宜昌市中心医院，共有 166 名初治 MM 患者纳入研究。在 获得患者知情同意之后，取骨髓进行 FISH 检测。 2、标本采集。采新鲜骨髓液 3ml，0.3ml 肝素抗凝。 3、收集细胞：将骨髓液移至 15ml 离心管，1300rpm/min，5min；弃上清，吸管混匀 后缓缓加入 37℃ 预热的 0.075mol/L KCL 溶液至 8ml 进行低渗处理，继续用吸管 混匀后置 37℃ 水浴箱 30min，中间吹打混匀 1~2 次；加入 1ml 3:1 甲醇:冰醋酸固 定液进行预固定，吸管充分混匀；1300rpm/min 离心 5min，弃上清，缓缓加入 3:1 甲醇/冰醋酸固定液至 8ml，混匀，室温下静置 10min 进行固定；1300rpm/min 离 心 5min，去上清，缓缓加入 3:1 甲醇/冰醋酸固定液至 8ml，混匀，室温下静置 10min，1300rpm/min 离心 5min，弃上清，充分混匀后，再加入固定液至 2ml， 置-20℃ 冰箱冷藏，可随时取出供 FISH 检验。 4、FISH 玻片制片：取出细胞悬液，1300rpm/min 离心 5 分钟，去上清，按细胞数量 加入适量固定液，用吸管将细胞悬液轻轻吹打混匀后吸取少量，滴至干净的载玻 片上，自然晾干。 5、老化：室温放置过夜或 56℃ 烤片至少 60 分钟，室温干燥保存。剩余标本置于-20℃ 冰箱备用。 6、将玻片置于 37℃ 2× SSC 溶液中浸泡 30 分钟。 7、消化：将玻片置于 37℃胃蛋白酶工作液中 10~15 分钟，直至滴片区域变透明。 8、室温下将玻片依次置于 70%乙醇、85％乙醇和 100％乙醇中各 3 分钟脱水。自然15 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文干燥玻片。 9、探针配制：所用探针 RB1、D13S315、1q21、p53、IGH（北京金菩嘉医疗科技有 限公司） ，分别检测 13q14、13q14.3、1q21、17p13、t(14q32)位点的异常。探针 IGH/CCND1、 IGH/FGFR3、 IGH/MAF(Vysis，美国雅培公司)检测 t(11;14)、 t(4;14) 和 t(14;16)。 室温下将如下液体加入到微量离心管中。 杂交缓冲液 7μl + 去离子水 1μl + 探针 2μl = 10μl 离心 3 秒，将探针混合液充分混匀。将 10?l 探针混合物滴加于玻片杂交区域， 立即加盖盖玻片，用 rubber cement 封片。共变性：76℃ ，5 分钟；杂交：置于预 热的 42℃ 湿盒中，16 小时。 10、洗涤：洗涤前将 0.3%NP-40/2× SSC 溶液置于 73℃ 水浴箱中至少 30 分钟。轻轻移 去盖玻片，将玻片迅速置于 0.3% NP-40/0.4× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 2 分 钟；取出玻片，将玻片浸入室温 0.1% NP-40/2× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 2 分钟；将玻片浸入 70％乙醇溶液中 3 分钟。 11、样本复染：暗处自然干燥玻片。将 10?l DAPI 复染剂滴加于杂交区域位置，立即 盖上盖玻片。暗处放置 10-20 分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察 玻片。 12、样本 FISH 结果观察：首先在 10 倍物镜下，在 FISH 标本玻片上找到杂交细胞区 域；然后在 40 倍物镜下扫描整个区域，观察信号的质量，满意的标本应是 75% 以上的细胞核中都有杂交信号； 100 倍物镜下观察细胞核的结果并进行信号计 在 数和比值计算。计数 200 个细胞，计算异常信号细胞所占的百分率。结果分析时 随机计数样本细胞。计数的细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞。细胞核轮 廓不清或有重叠的不计数。杂交不均匀的区域不计数。 13、建立阈值：健康人群 20 例设为对照组。每份样本分析 200 个细胞，计算异常信 号的细胞数、百分比的平均值及标准差，异常阈值定义为平均值+3 倍标准差。 异常阈值=平均值（M）+3× 标准差（SD） 。 14、根据阈值判断结果：每例样本随机记数 200 个细胞，如果显示异常信号细胞比例16 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文的检测值大于异常阈值，判定为阳性结果；如果显示异常信号细胞比例的检测值 小于异常阈值，判定为阴性结果。 15、统计学分析：采用 SPSS 17.0 软件进行统计学处理。染色体异常与临床特征的组 间相关性比较采用皮尔森相关系数分析，治疗效果的比较使用卡方检验。PFS 的 分析运用 Kaplan and Meier 评估，并用 Log-rank 检验比较各染色体异常组的生存 率。P 值小于 0.05 时认为有统计学意义（双尾） 。附 1、MM 的诊断标准如下： 主要标准： ① 组织活检证明有浆细胞瘤或骨髓涂片检查：浆细胞&30%，常伴有形态改变。 ② 单克隆免疫球蛋白（M 蛋白） ：IgG&35g/L，IgA&20g/L，IgM&15g/L，IgD&2g/L， IgE&2g/L，尿中单克隆 K 或 λ 轻链&1g/24 小时，并排除淀粉样变。 次要标准： ① 骨髓检查：浆细胞 10%～30%。 ② 单克隆免疫球蛋白或其片段的存在，但低于上述标准。 ③ 线检查有溶骨性损害和（或）广泛骨质疏松。 X ④ 正常免疫球蛋白量降低：IgM&0.5g/L, IgA&1.0g/L, IgG&6.0g/L。 凡满足下列任一条件者可诊断为 MM： 主要标准第 1 项+第 2 项；或第 1 项主要标准+次要标准② ③ ④ 中之一；或第 2 项 主要标准+次要标准① ③ ④ 中之一；或次要标准① ② +次要标准 ③ ④ 中之一。 2、分期按照国际分期体系（ISS） ，标准见表 1：表 1：ISS 分期 分期 I ISS 分期标准 β2-MG＜3.5mg/L， 白蛋白≥35g/L； II III 不符合 I 和 III 期的所有患者 β2-MG≥5.5mg/L。17 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文3、 治疗效果的评价根据国际骨髓瘤工作组的标准， 分为完全缓解 （CR） 接近完 全 ， 缓解（VGPR） ，部分缓解（PR）和病情持续（SD） 。标准见表 2：表 2：国际骨髓瘤工作组疗效标准 分类 sCR 标准 完全缓解，并符合 游离轻链比例正常 免疫组化或免疫荧光证实骨髓中无单克隆浆细胞CR血清及尿中免疫固定电泳检测阴性 软组织未见浆细胞瘤 骨髓浆细胞≤5%VGPR免疫固定电泳可检出血清及尿中 M 蛋白，但常规电泳无法检出 血清中 M 蛋白减少 90%及以上，加上尿中 M 蛋白＜100mg/24hPR血清 M 蛋白减少≥50% 24 小时尿 M 蛋白减少≥90%或＜200mg/24h 若血清和尿 M 蛋白无法检测，可以游离轻链水平下降≥50%计 若血清、尿 M 蛋白及血游离轻链均无法检测，可以骨髓浆细胞 比例下降≥50%计， 同时骨髓浆细胞基础值须≥30%且组织浆细胞 瘤大小减少≥50%SD不符合 CR, VGPR, PR 及疾病进展标准4、 疗效的分析根据总缓解率 （ORR, overall response rate） 其定义为 CR+VGPR+PR。 ， 无进展生存期（PFS, progression free survival）起点为初次治疗时，终点为病情发 生进展或任何原因所致的死亡。疾病进展的评价依据国际骨髓瘤工作组标准，见18 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文表 3：表 3：国际骨髓瘤工作组疾病进展及复发标准 分类 疾病进展 （用于计算 PFS 的终点） 标准 至少符合以下标准之一： 与基础值相比升高≥25% 血清 M 蛋白水平升高的绝对值必须达到 0.5g/dL 24 小时尿 M 蛋白增长绝对值必须≥200mg/24h 如果血清和尿 M 蛋白无法检出，轻链增长绝对值&l0mg/dL 骨髓浆细胞比例的绝对值至少达到 10% 出现新的溶骨性病变或者软组织浆细胞瘤或现存骨病变或者软组 织浆细胞瘤增大 排除其他原因引起的高钙血症加重(校正血钙&l1.5mg/dL，或者 2.65mmol/L临床复发至少符合下述条件之一： 出现新的溶骨性病变或者软组织浆细胞瘤 现存骨病变或者软组织浆细胞瘤增大&50%（至少 1cm） 高钙血症（ l1.5mg/dL，或者 2.65mmol/L） 血红蛋白下降≥2g/dL（1.25mmol/L） 血肌酐上升≥2mg/dL（177?mmol/L）完全缓解后复发至少符合下述条件之一： 免疫固定或者常规电泳检查血或尿 M 蛋白再次出现 骨髓浆细胞比例≥5% 疾病进展的任何指征之一19 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文结果患者资料 共 166 名患者纳入调查，其中男性患者 99 名，女性 67 名。中位年龄为 56 岁（年 龄区间：34 岁至 78 岁） 。诊断时，90 名患者处于 ISS 分期的 III 期，占 54.2%。患者 详细资料及临床特征详见表 4。表 4：患者基本资料 临床特征 性别 男 女 中位年龄 (年龄区间) &56 岁 ISS 分期 I II III M 蛋白免疫分型 IgG IgA IgD 轻链型 不分泌型 骨髓浆细胞比例 &30% 血红蛋白&90g/L 血小板&100G/L 溶骨性破坏 66 39 19 36 6 82 103 39 157 39.8 23.5 11.4 21.7 3.6 49.4 62.0 23.5 94.6 22 54 90 13.3 32.5 54.2 99 67 56 (34-78 ) 85 51.2 59.6 40.4 病例数目 百分比%20 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文分析临床资料显示多个临床特征之间有着密切的联系。患者的 ISS 分期与骨髓浆 细胞比例呈显著正相关（r=0.306，p=0.001） ，与患者血红蛋白水平呈显著负相关 （r=0.531，p＜0.001） ，与患者血小板水平呈显著负相关（r=0.238，p=0.013） ，与血 肌酐水平正相关（r=0.488，p＜0.001） ，与血尿酸水平正相关（r=0.332，p=0.003） ， 与血钙水平正相关（r=0.195，p=0.048） 。可见 ISS 分期方式虽然简单直接，但与各个 临床特征，包括血象、骨髓象、以及肾功能均有紧密的联系，是种经典、易临床推行 的分期方法。FISH 检测结果以及与临床特点的关系 间期 FISH 检测的结果显示，88.0%（146/166）的病人存在不同程度的染色体异 常。最常见的染色体异常为 IGH 易位，即 t(14q32)，其异常率为 58.4%（97/166） 。其 中 t(11;14)为 25.9%（43/166） ，t(4;14)为 17.5%（29/166） ，t(14;16)为 7.2%（12/166） ， 其他未能确定的 14q32 易位占 7.8%（13/166） 。其次最常见的染色体异常为 13q14 缺 失（del13q14） ，RB1 探针检测出的异常率为 55.4%（92/166） ，D13S319 检测出的异 常率为 53.6% （89/166） 探针 RB1 的检出敏感性高于 D13S319。 ， 1q21 扩增 （amp1q21） 率为 49.4%（82/166） 。17p13 缺失（del17p13）见于 25.3%（42/166）的患者。 （图 1）图 1A：左图为 IGH 易位患者，右图为正常对照21 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 1B：此图显示的为 t(4;14)的患者，左上 t(11;14)为阴性，右上 t(14;16)显示为阴性，下方两 张图显示的为 t(4;14)阳性，红绿信号融合成黄色。22 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 1C：左图为 del13q14 的患者，右图为正常对照图 1D：左图为 amp1q21 患者，右图为正常对照23 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 1E：左图为 del17p13 患者，右图为正常对照在研究中， 我们发现各个染色体异常与患者的某些临床指标及临床症状有密切的 联系，也许与该染色体区段的缺失或扩增，影响定位在该区段的基因表达，从而影响 下游蛋白水平，最终与疾病的发生发展有关。 分析表明，amp1q21 阳性率与 ISS 分期密切相关（r=0.311，p=0.001） ，与骨髓浆 细胞比例（r=0.216，p=0.011） ，与血红蛋白水平（r=0.532，p＜0.001） ，与血小板水 平 （r=0.363， p＜0.001） 与血白蛋白水平 ， （r=0.300， p=0.002） 与血肌酐水平 ， （r=0.234， p=0.032） ，与尿酸水平（r=0.312，p=0.005）均密切相关，且与 t(14;16)易位显著相关 （r=0.265，p=0.009） 。 del13q14 与血清 M 蛋白水平（r=0.180，p=0.021） ，与骨髓浆细胞比例（r=0.357， p＜0.001） ，与血白蛋白水平（r=0.200，p=0.039）密切相关。 del17p13 与 ISS 分期（r=0.214，p=0.019） ，与白细胞减少（r=0.226，p=0.012） ， 与血 LDH（r=0.472，p＜0.001）显著相关。 IGH 易位与溶骨性破坏累计部位（r=0.226，p=0.013） ，与血清 M 蛋白水平 （r=0.215， p=0.005）与骨髓浆细胞比例 ， （r=0.237， p=0.005）与血白蛋白水平 ， （r=0.195，24 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文p=0.044） ，与血尿酸水平（r=0.281，p=0.012）均呈密切相关。其中 t(4;14)与 t(14;16) 均与 ISS 分期显著相关（r=0.239，p=0.039；r=0.245，p=0.034） 。染色体异常与治疗效果的关系 为了了解不同染色体异常的患者使用不同的化疗方案， 所显示出的不同的治疗反 应，我们观察了在医院规范进行 3 疗程化疗的 99 名患者。按照不同的化疗方法，将 患者分成两组进行分析，一组使用包含硼替佐米的化疗方案，共 55 人，其中使用硼 替佐米（1.3mg/m2 ，第 1，4，8，11 天）加地塞米松（20 mg，第 1，2，4，5，8，9， 11，12 天）方案的 37 人，使用硼替佐米联合地塞米松及阿霉素（10mg，第 1-4 天） 方案的 11 人，使用硼替佐米联合地塞米松及沙利度胺的 7 人。另一组为使用不包含 硼替佐米方案的患者，共 44 人。其中使用 VAD 方案（长春新碱，阿霉素，地塞米松） 化疗的 23 人，使用 VADT（VAD 加沙利度胺）的 4 人，使用 MP 方案（马法兰，强 的松）5 人，MPT 方案（马法兰，强的松，沙利度胺）5 人，M2 方案（马法兰，环 磷酰胺，卡莫司汀，长春新碱，强的松）1 人，COMPT 方案（环磷酰胺，长春新碱， 马法兰，强的松，沙利度胺）1 人，交叉使用以上化疗方案的 5 人。99 名初治患者中， 11.1%（11/99）名患者获得 CR，10.1%（10/99）患者获得 VGPR，48.5%（48/99）获 得 PR，30.3%（30/99）名患者为 SD。疗效分析结果详见下表。表 5：总 99 人 缓解率（%） 非万珂化疗方案 (44 人) 含万珂化疗方案 （55 人） p CR 4.5%(2) 16.4%(9) 0.063 VGPR 4.5%(2) 14.5%(8) 0.101 C+V 9.1%(4) 30.9%(17) 0.008 PR 47.7%(21) 49.1%(27) 0.893 ORR 56.8%(25) 80.0%(44) 0.013 SD 43.2%(19) 20.0%(11) 0.013表 6：无染色体异常者 11 人 缓解率（%） CR VGPR 0 0 C+V 0 37.5%(3) PR 100%(3) 62.5%(5) ORR 100% 100% SD 0 0 非万珂化疗方案(3 人) 0 含万珂化疗方案 人） 37.5%(3) （825 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文表 7：有染色体异常者 88 人 缓解率（%） 非 万珂化疗 方案 (41 人) 含 万珂化疗 方案 （47 人） P CR 4.9%(2) 12.8%(6) 0.199 VGPR 4.9%(2) 17.0%(8) 0.073 C+V 9.8%(4) 29.8%(14) 0.020 PR 43.9%(18) 46.8%(22) 0.785 ORR 53.7%(22) 76.6%(36) 0.024 SD 46.3%(19) 23.4%(11) 0.024表 8：13q14 缺失 56 人 缓解率（%） 非 万 珂 化 疗 方案 （25 人） 含 万 珂 化 疗 方案 （31 人） P CR 4.0%(1) 12.9%(4) 0.245 VGPR 0 22.6%(7) 0.011 C+V 4.0%(1) 35.5%(11) 0.004 PR 48.0%(12) 35.5%(11) 0.344 ORR 52.0%(13) 71.0%(22) 0.145 SD 48.0%(12) 29.0%(9) 0.145表 9：1q21 扩增 50 人 缓解率（%） 非 万珂化疗 方案 （29 人） 含 万珂化疗 方案 （21 人） P CR 3.4%(1) 14.3(3) 0.163 VGPR 0 4.8%(1) C+V 3.4%(1) 19.0%(4) 0.070 PR 44.8%(13) 47.6%(10) 0.845 ORR 48.3%(14) 66.7%(14) 0.196 SD 51.7%(15) 33.3%(7) 0.196表 10：17p13 缺失 25 人 缓解率（%） 非 万珂化疗 方案 （13 人） 含 万珂化疗 方案 （12 人） p 表 11：IGH 易位 56 人 缓解率（%） 非 万珂化疗 方案 （28 人） 含 万珂化疗 方案 （28 人） P CR 7.1%(2) 3.6%(1) 0.553 VGPR 7.1%(2) 14.3%(4) 0.388 C+V 14.3%(4) 17.9%(5) 0.71626CR 0 8.3%(1) -VGPR 0 8.3%(1) -C+V 0 16.6%(2) -PR 38.5%(5) 50.0%(6) 0.561ORR 38.5%(5) 66.7%(8) 0.158SD 61.5%(8) 33.3%(4) 0.158PR 39.3%(11) 53.6%(15) 0.284ORR 53.6%(15) 71.4%(20) 0.168SD 46.4%(13) 28.6%(8) 0.168 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文表 12：t(11;14)易位 25 人 缓解率（%） 非 万珂化疗 方案 （12 人） 含 万珂化疗 方案 （13 人） P CR 16.7%(2) 7.7%(1) 0.490 VGPR 16.7%(2) 30.8%(4) 0.409 C+V 33.3%(4) 38.5%(5) 0.790 PR 41.7%(5) 53.8%(7) 0.543 ORR 75.0%(9) 92.3%(12) 0.238 SD 25.0%(3) 7.7%(1) 0.238表 13：存在 13q14 缺失但无 17p13 缺失者 41 人 缓解率（%） 非万珂化疗方案 （19 人） 含万珂化疗方案 （22 人） P CR 5.3%(1) 18.2%(4) 0.207 VGPR 0 31.8%(7) 0.007 C+V 5.3%(1) 50.0%(11) 0.002 PR 52.6%(10) 27.3%(6) 0.097 ORR 57.9%(11) 77.3%(17) 0.184 SD 42.1%(8) 22.7%(5) 0.184有临床研究证实，获得更高的 CR 率以及至少达到 VGPR，可以延长患者的 PFS 和 OS。8 和传统化疗方法相比，硼替佐米具有明显的优势。在纳入研究的 99 名患者 中，使用硼替佐米化疗组，比起非硼替佐米化疗方案组，获得了更高的 CR+VGPR 率 （30.9% vs 9.1%, p=0.008）以及更高的 ORR 率（80.0% vs 56.8%, p=0.013） 。在存在 染色体异常的 88 名患者中，使用硼替佐米化疗组，比非硼替佐米化疗组，也获得了 更高的 CR+VGPR 率（29.8% vs 9.8%, p=0.020）以及 ORR 率（76.6% vs 53.7%, p=0.024） 。存在 13q14 缺失的患者中，使用硼替佐米治疗亦可获得较高的 CR+VGPR 率（35.5% vs 4.0%, p=0.004） 。但是在存在 1q21 扩增，17p13 缺失以及 IGH 易位的患 者，使用两种方式化疗并没有显示出明显的差异。 （表 5~表 13）染色体异常与无进展生存期的关系 存在染色体异常的患者，其中位无进展生存期（PFS）与不存在染色体异常的患 者有明显的差异。具体来说，存在 amp1q21 的患者，其中位无进展生存期为 5.9 月， 而无 amp1q21 患者的中位 PFS 为 8.8 月 （5.9 月 vs 8.8 月， p=0.002， 见图 2A）del13q14 。 的患者，中位无进展生存期为 6.7 月，无 del13q14 患者的中位 PFS 为 8.6 月， （6.727 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文月 vs 8.6 月，p=0.043，见图 2B） 。存在 del17p13 的患者，其中位无进展生存期为 4.9 月（4.9 月 vs 8.9 月，p&0.001，见图 2C） 。存在 IGH 易位即 t(14q32)的患者，其中位 无进展生存期为 6.8 月（6.8 月 vs 9.0 月，p=0.049，见图 2D） 。存在 t(14;16)的患者， 其中位无进展生存期为 3.0 月（3.0 月 vs 7.9 月，p=0.006，见图 2E） 。 del13q14 患者中，合并 amp1q21 与未合并 amp1q21 的患者比较，其中位 PFS 无 显著差异（p=0.388） ；而合并 del17p13 的患者，其中位 PFS 显著短于不合并 del17p13 的患者（4.6 月 vs 8.0 月，p=0.002，图 2F） 。同时，在无 del17p13 的患者中，del13q14 患者的中位 PFS 比起无 del13q14 的患者， 并无显著性的差异 （8.0 月 vs 9.8 月， p=0.153） 。 此外，del13q14 合并 t(14;16)的患者，其中位 PFS 明显短于不合并 t(14;16)的患者（2.8 月 vs 7.2 月，p=0.001） 。amp1q21 患者，合并 del17p13 与未合并 del17p13 患者的中位 PFS，无明显差异（p=0.104） 。且 amp1q21 合并 t(14;16)的患者，其中位 PFS 亦明显 减少（3.0 月 vs 6.3 月，p=0.010） 。图 2A：Kaplan-Meier 曲线图：amp1q21 对患者 PFS 的影响，黑色线 代表无 amp1q21 患者组，灰色线代表 amp1q21 患者组（p=0.002）28 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 2B：Kaplan-Meier 曲线图：del13q14 对患者 PFS 的影响，黑色线 代表无 del13q14 患者组，灰色线代表 del13q14 患者组（p=0.043）图 2C：Kaplan-Meier 曲线图：del17p13 对患者 PFS 的影响，黑色线 代表无 del17p13 患者组，灰色线代表 del17p13 患者组（p&0.001）29 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 2D：Kaplan-Meier 曲线图：t(14q32)对患者 PFS 的影响，黑色线 代表无 t(14q32)患者组，灰色线代表 t(14q32)患者组（p=0.049）图 2E：Kaplan-Meier 曲线图：t(14;16)对患者 PFS 的影响，黑色线 代表无 t(14;16)患者组，灰色线代表 t(14;16)患者组（p=0.006）30 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 2F：Kaplan-Meier 曲线图：del17p13 对 del13q14 患者 PFS 的影响，黑色线 代表合并 del17p13 患者组，灰色线代表不合并 del17p13 患者组（p=0.002）研究亦证实，在治疗时获得 CR 及 VGPR，可显著延长患者的中位 PFS，其中位 值为 10.4 个月。PR 患者的中位 PFS 为 6.7 个月，SD 患者的中位 PFS 仅为 5.0 个月 （p=0.015，见图 3） 。此外，患者的 PFS 还与初治时的临床特征有密切的关系。如就 诊时的骨髓浆细胞比例（p=0.044） ，β2 微球蛋白的水平（p=0.007）等。讨论多发性骨髓瘤是处于分化终末期的 B 细胞形成的克隆性浆细胞肿瘤。 在其克隆性 浆细胞中，存在多种复杂的染色体异常。MM 是一种不可治愈的疾病，现代分子诊断 技术的发展，使人们了解到染色体异常在 MM 患者中发生率很高而且发生在疾病早 期阶段，参与疾病的发生发展。1-4 因此，能够在疾病诊断初期，了解 MM 患者的染 色体异常差异，评价患者的预后，选择不同的化疗方案，进行个性化的治疗，对于医31 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 3：Kaplan-Meier 曲线图：缓解率对患者 PFS 的影响，右侧黑色线代表 CR+VGPR 患 者组，中间曲线为 PR 患者组，左侧灰色曲线为 SD 患者组（p=0.015）学研究者来说，仍然是个需要探索的话题。 在欧美国家，MM 是发病率较高的血液恶性疾病之一，亚洲国家的 MM 发病率 则较低。本研究在纳入了在国内多家医院就诊 166 名初治的 MM 患者，对其染色体 异常进行了标准化 FISH 检测，FISH 检测出接近 90%的 MM 患者存在不同程度的染 色体异常， 阳性率的检出大大高于常规的 G 显带分析。 各染色体异常阳性率如下， IGH 易位 58.4%（97/166） 。其中 t(11;14)为 25.9%（43/166） ，t(4;14)为 17.5%（29/166） ， t(14;16)为 7.2%（12/166） ，其他未确定的 14q32 易位占 7.8%（13/166） 。del13q14， RB1 探针检测出的阳性率为 55.4%（92/166） ，D13S319 检测出的阳性率为 53.6% （89/166） 。amp1q21 为 49.4%（82/166） 。del17p13 为 25.3%（42/166） 。与韩国、台 湾等亚洲其他地区 MM 染色体异常率接近，9,10 中国 MM 患者的 del17p13 阳性率高 于西方文献报道的阳性率（25.3% vs 10%） ，是否 del17p13 的阳性率存在种族差异， 还是由于样本误差、检测误差等原因引起，还需要多中心大样本的实验进行证实。其32 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文余染色体异常率与西方国家人群均较一致。11 在对 MM 患者的治疗方面，前期文献证实获得 CR，或者至少达到 VGPR，可以8,12-14 显著延长患者的 PFS 及 OS。 本实验中我们比较了包含硼替佐米的化疗方案与其他传统化疗方案的疗效，结果提示对初治的 MM 患者使用硼替佐米化疗，可获得更 高的 CR+VGPR 率（30.9% vs 9.1%, p=0.008）以及更高的 ORR 率（80.0% vs 56.8%, p=0.013） 。本研究亦证实，治疗效果达到 CR，以及至少达到 VGPR，可显著延长患 者的中位 PFS，为 10.4 个月。患者的中位 PFS 为 6.7 个月，SD 患者的中位 PFS 仅为 5.0 个月（p=0.015） 。对于具体存在各种染色体异常的患者来说，硼替佐米的治疗， 与其他化疗方案相比，并不是处处显示出其优势。15-17 在对 del13q14 患者的治疗中， 硼替佐米化疗方案组的 CR+VGPR 率为 35.5%，显著高于非硼替佐米化疗组 4.0% （p=0.004） 。但对于其他染色体异常的患者，如 del17p13，amp1q21，以及 t(14q32) 等，硼替佐米化疗方案组，并没有获得更高的 CR+VGPR 率及 ORR 率，与非硼替佐 米化疗组没有明显的差异。 同样，染色体异常与患者的无进展生存期亦有密切的关系。18,19 关系较显著的为 del17p13，存在该染色体异常的患者，其中位 PFS 为 4.9 月，无 del17p13 患者的中位 PFS 为 8.9 月（4.9 月 vs 8.9 月，p&0.001） 。同样，amp1q21 患者的中位 PFS 为 5.9 月 （vs 8.8 月， p=0.002） t(14;16)易位的患者， 。 其中位 PFS 为 3.0 月 （vs 7.1 月， p=0.006） 。 另外，del13q14 的患者与无 del13q14 患者相比，其中位 PFS 也有一定的差异（6.7 月 vs 8.6 月，p=0.043） 。在 del13q14 患者群中，是否合并 amp1q21 对中位 PFS 并无明显 的影响。但合并 del17p13 与未合并 del17p13 的患者，其中位 PFS 有显著的差异（4.6 月 vs 8.0 月， p=0.002） 排除去 del17p13 的患者， 。 再将余下患者按照是否存在 del13q14 分成两组，分析比较中位 PFS，发现无显著性的差异（8.0 月 vs 9.8 月，p=0.153） 。 amp1q21 患者，合并 del17p13 与未合并 del17p13 患者的中位 PFS，无明显差异（4.5 月 vs 6.7 月，p=0.104） 。amp1q21 合并 t(14;16)的患者，其中位 PFS 亦明显减少（3.0 月 vs 6.3 月，p=0.010） 。由于病例数量的限制，本研究未能把存在 del13q14 患者中的 amp1q21 阳性的患者排除掉再行分析，因此，对于 del13q14 是否能够做为 MM 患者 独立的预后因素，仍然需要进一步的研究证实。33 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文本研究从立项至今，对患者的中位随访时间为 16.4 个月，根据 MM 患者的病情 进展情况，并不足以获得患者的总生存期（OS）数据，因此对染色体异常与预后的 研究采用患者的 PFS 数据来分析，是本实验的局限之一。PFS 比起 OS，具有独特的 优势，主要表现在其收集数据时间快，易于研究，而且可随时根据 PFS 的数据调整临 床化疗方案。尽管获得更长的 PFS 与 OS，均为治疗 MM 的重要目标，但是现有的研 究证实，PFS 并不能完全取代 OS 的地位。Ludwig 等研究证实，对老年 MM 患者进 行沙利度胺以及干扰素维持治疗，其 PFS 显著高于对照组（27.7 月 vs13.2 月， p=0.0068） ；但是两组的 OS 并没有显著的差异（52.6 月 vs 51.4 月，p=0.081） 20 PFS 。 是个短期预后指标，容易受到治疗疗程、治疗药物、患者身体状况、并发症等等其他 因素的影响，因此 PFS 作为预后的评价尚有一定的局限性，在 MM 的预后研究中， OS 仍然是不可或缺的研究指标。 本研究收集了大量 MM 患者的临床标本，进行间期 FISH 检测，了解中国人群中 MM 患者的染色体异常发生率，并将临床资料汇总，对 MM 患者的染色体异常情况 与临床特征， 包括治疗效果与预后进行了研究分析。 证实了中国人群 del17p13 发生率 略高，其余染色体异常的发生率与其他亚洲人群以及欧美人群比较，并没有显著的差 异。MM 患者的染色体异常与其就诊时各项临床特征都有明显的关联，且与患者化疗 的疗效有关。无染色体异常的患者，可获得更高的临床缓解率。硼替佐米能够改善染 色体异常患者的缓解率，尤其对 del13q14 的患者，能显著提高其 CR+VGPR 率。在 MM 初次化疗中如果能够获得更高的 CR+VGPR，对于提高 PFS、改善预后有积极的 作用。本研究亦证实了，染色体异常 del17p13、amp1q21、t(14;16)、del13q14，是 MM 患者的不良预后因素，可以作为在疾病早期对 MM 患者的预后进行推断的指标。参考文献1、Dewald GW, Kyle RA, Hicks GA, et al: The clinical significance of cytogenetic studies in 100 patients with multiple myeloma, plasma cell leukemia, or amyloidosis. Blood, 0-390. 2、Zandecki M, Lai JL, Facon T. Multiple myeloma: almost all patients are cytogenetically34 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文abnormal. Br J Haematol, 7-227. 3、Tabernero D, San Miguel JF, Garcia-Sanz M, et al: Incidence of chromosome numerical changes in multiple myeloma: fluorescence in situ hybridization analysis using 15 chromosome-specific probes. Am J Pathol, : 153-161. 4、Depil S, Leleu X, Micol JB, et al: Abnormal cytogenetics and significant bone marrow plasmacytosis are predictive of early progression and short survival in patients with low tumor mass asymptomatic multiple myeloma. Leuk Lymphoma, 81-2484. 5、 Lai JL, Zandecki M, Mary JY, et al: Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood, 90-2497. 6、 Debes-Marun C, Dewald G, Bryant S, et al: Chromosome abnormalities clustering and its implications for pathogenesis and prognosis in myeloma. Leukemia, 7-436. 7、 Smadja NV, Fruchart C, Isnard F, et al: Chromosomal analysis in multiple myeloma: cytogenetic evidence of two different diseases. Leukemia, 0-969. 8、Jean-Luc Harousseau, Herve Avet-Loiseau, Michel Attal et al: Achievement of at least very good partial response is a simple and robust prognostic factor in patients with multiple myeloma treated with high-dose therapy: long-term analysis of the IFM 99-02 and 99-04 trials. J Clin Oncol, 20-5726. 9、Bang SM, Kim YR, Cho HI, et al: Identification of 13q deletion, trisomy 1q, and IgH rearrangement as the most frequent chromosomal changes found in Korean patients with multiple myeloma. Cancer Genet Cytogenet.
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Haematologica. 2010; 95 : 1548-5436 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第二部分 cIg FISH 与 FISH 检测多发性骨髓瘤方法学比较MM 染色体异常对疾病进程、治疗反应、预后的重要意义已毋庸置疑。FISH 技 术可检测大量间期细胞，能够对染色体扩增、缺失、易位等等进行良好的识别，且具 有检测速度快、敏感性高等优势。FISH 检测 MM 染色体异常已经越来越多应用于临 床，但是 FISH 阳性率的检出依赖于骨髓穿刺术所获得的良好的浆细胞比例，为了更 准确的得知 MM 染色体异常的发生率，FISH 检测最好在克隆性浆细胞上进行。胞质 轻链免疫荧光原位杂交法（cIg FISH）是浆细胞确认方法之一。对于骨髓浆细胞比例 较低的患者，在 FISH 检测中同时识别浆细胞，分析浆细胞上的染色体异常，对此类 患者的染色体异常分析具有尤为突出的意义。材料和方法一、实验试剂 1、 AMCA 抗人 Lambda 轻链抗体 （AMCA Anti-human Lambda Chain， 货号 CI-3070） 购自美国 Vector 公司 2、AMCA 抗人 Kappa 轻链抗体（AMCA Anti-human Kappa Chain，货号 CI-3060） 购自美国 Vector 公司 3、MM FISH 检测试剂盒（MM FISH test kit，货号 F01003-02） ，购自北京金菩嘉医 疗科技有限公司。包括杂交缓冲液，DAPI 及以下探针：探针名称 RB1 1q21 检测位点 13q14 1q214、RPMI-1640 培养基，购自 Gibco 公司 5、4-壬基苯基-聚乙二醇， （Nonidet P-40，NP-40，octylphenoxypolyethoxyethanol） ， 购自 Sigma 公司。 6、1:15000 胃蛋白酶，购自武汉天傲公司37 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文7、无水乙醇，甲醇，冰醋酸，氯化钾，氯化钠，柠檬酸钠（国产分析纯） 。二、主要实验仪器 1、电子天平，美国 Mettler Toledo 公司 2、恒温水浴箱，上海新苗有限公司 3、电热恒温培养箱，上海新苗有限公司 4、水平离心机，湖南赛特湘仪公司 5、BX51 荧光显微镜，日本 Olympus 公司 6、ProgResMFcool 显微镜分析仪 7、净水机，美的公司 8、0.5-1000μ l 移液器，德国 Eppendoff 公司 9、-20 度及 4 度冰箱，容声电器有限公司三、主要实验试剂的配制 1、标准柠檬酸盐储存液：20×SSC 氯化钠 柠檬酸钠 去离子水 88g 44g 400ml充分溶解，用盐酸调节 pH 值至 5.3，去离子水定容至 500ml。 2、标准柠檬酸盐工作液：2×SSC 20×SSC（pH5.3） 100ml 去离子水 800ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0±0.2，去离子水定容至 1L。 3、各浓度乙醇溶液：70％乙醇：将 700ml 无水乙醇，用去离子水稀释至 1L；85％ 乙醇：将 850ml 无水乙醇，用去离子水稀释至 1L。 4、固定液： （甲醇：冰乙酸体积比 3：1） 量取 30ml 甲醇和 10ml 冰乙酸，充分混匀，使用前新鲜配制。38 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文5、0.1%NP-40/2×SSC 溶液 20×SSC（pH5.3） 40ml NP-40 去离子水 0.4ml 300ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0±0.2，去离子水定容至 400ml。 6、0.3％NP-40/0.4×SSC 溶液 20×SSC（pH5.3） 20ml NP-40 去离子水 3ml 950ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0-7.5，去离子水定容至 1L。 7、氯化钾低渗溶液（0.075 M KCl） KCl 去离子水 2.795g 300ml充分混匀，用去离子水定容至 500ml。 8、胃蛋白酶工作液： 1:15000 胃蛋白酶 10M HCL 去离子水 50μ l 50μ l 50ml四、实验方法与步骤 （一）病例收集：本院及宜昌中心医院 55 名 MM 患者，待患者知情同意后，采集新 鲜骨髓液及骨髓涂片标本。 （二）cIg FISH 操作步骤 1、骨髓涂片制备：取新鲜骨髓液 0.1ml 进行骨髓涂片，涂片时推片与载玻片呈 30° 角，轻压推片下缘散开，使骨髓展开并充满整个推片的宽度。良好的骨髓涂片厚 薄适宜，头、体、尾分明。 2、低渗：将玻片浸入 37℃ 预热的 0.075mol/L KCL 溶液进行低渗处理。39 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文3、 固定： 将玻片浸入甲醇 20 分钟， 取出玻片，浸入乙酸 5 分钟。 取出玻片， 浸入 70% 乙醇 3 分钟，室温下自然干燥。 4、消化：将玻片浸入 37℃ 预热的胃蛋白酶工作液中 20~30 分钟，直至涂片区域变透 明。 5、梯度脱水：将玻片置于 37℃ SSC 溶液中浸泡 30 分钟。室温下将玻片依次置于 2× 70%乙醇、85％乙醇和 100％乙醇中各 3 分钟脱水。自然干燥玻片。 6、所用探针 RB1、1q21（北京金菩嘉医疗科技有限公司） ，分别检测 13q14、1q21 位 点的异常。 室温下将如下液体加入到微量离心管中。 杂交缓冲液 7μl + 去离子水 1μl + 探针 2μl = 10μl 离心 1-3 秒，使探针混合液充分混匀。将 10?l 探针混合物滴加于玻片杂交区域， 立即加盖盖玻片，用 rubber cement 封片。共变性：76℃ ，5 分钟；杂交：置于预 热 42℃ 的湿盒，16 小时。 7、洗涤：将 0.3%NP-40/2× SSC 置于 73℃ 水浴箱中至少 30 分钟。轻轻移去盖玻片， 迅速将玻片置于 0.3% NP-40/0.4× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 2 分钟；取出玻 片，室温下将玻片浸入 0.1% NP-40/2× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 2 分钟；室 温下将玻片置于 70％乙醇中 3 分钟。 8、AMCA 复染：取 AMCA 抗人 Lambda7.5μl + RPIMμl = 15μl 加入微量离心 管中；将 15?l AMCA 混合液滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置 30 分钟。 9、洗涤：除去盖玻片，室温下将玻片置于 0.1% NP-40/2× SSC 中，振荡 1-3 秒，漂洗 1 分钟；室温下将玻片置于 70％乙醇中 3 分钟。暗处自然干燥玻片。 10、AMCA 再次复染：取 AMCA 抗人 Kappa 7.5μl + RPIMμl = 15μl 加入微量 离心管中；将 15?l AMCA 混合液滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处 放置 30 分钟。 11、样本 FISH 结果观察：首先在 10 倍物镜下，于 FISH 标本玻片上找到杂交区域； 然后在 40 倍物镜下扫描整个区域，观察信号的质量，满意的标本应是 75%以上40 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文细胞核中都有杂交信号； 100 倍物镜下观察细胞核的信号结果并进行信号分类 在 计数和比值计算。计数 100 个浆细胞，计算异常细胞所占的百分率。计数细胞必 须是各通道信号均清晰可辨的细胞。轮廓不清或重叠的不计数。杂交不均匀的区 域不计数。 12、建立阈值：健康人群 10 例设为对照组，制备玻片及进行 FISH 实验。每份样本 分析 100 个细胞，计算出显示异常信号的细胞数、百分比的平均值及标准差，异 常阈值定义为平均值+3 倍标准差。异常阈值=平均值（M）+3× 标准差（SD） 。 13、根据阈值判断结果：每例样本随机记数 100 个浆细胞，如果显示异常信号细胞比 例的检测值大于异常阈值， 判定为阳性结果； 如果显示异常信号细胞比例的检测 值小于异常阈值，判定为阴性结果。若细胞数太少或浆细胞比例太低，最少可计 数 20 个浆细胞，其中 15 个及以上细胞显示异常信号，可判定为阳性结果。 （三） FISH 操作步骤 1、标本采集。采新鲜骨髓液 3ml，0.3ml 肝素抗凝。 2、收集细胞：将骨髓液移至 15ml 离心管，1300rpm/min，5min；弃上清，吸管混匀 后缓缓加入 37℃ 预热的 0.075mol/L KCL 溶液至 8ml 进行低渗处理，继续用吸管 混匀后置 37℃ 水浴箱 30min，中间吹打混匀 1~2 次；加入 1ml 3:1 甲醇:冰醋酸固 定液进行预固定，吸管充分混匀；1300rpm/min 离心 5min，弃上清，缓缓加入 3:1 甲醇/冰醋酸固定液至 8ml，混匀，室温下静置 10min 进行固定；1300rpm/min 离 心 5min，去上清，缓缓加入 3:1 甲醇/冰醋酸固定液至 8ml，混匀，室温下静置 10min，1300rpm/min 离心 5min，弃上清，充分混匀后，再加入固定液至 2ml， 置-20℃ 冰箱冷藏，可随时取出供 FISH 检验。 3、FISH 玻片制片：取出细胞悬液，1300rpm/min 离心 5 分钟，去上清，按细胞数量 加入适量固定液，用吸管将细胞悬液轻轻吹打混匀后吸取少量，滴至干净的载玻 片上，自然晾干。 4、老化：室温放置过夜或 56℃ 烤片至少 60 分钟。玻片放入片盒中，室温干燥保存。 剩余标本置于-20℃ 冰箱备用。 5、将玻片置于 37℃ 2× SSC 溶液中浸泡 30 分钟。41 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文6、将玻片置于 37℃胃蛋白酶工作液中 10~15 分钟，直至滴片区域变透明。 7、室温下将玻片依次置于 70%乙醇、85％乙醇和 100％乙醇中各 3 分钟脱水。自然 干燥玻片。 8、 探针配制。 所用探针 RB1、 （北京金菩嘉医疗科技有限公司） 分别检测 13q14、 1q21 ， 1q21 位点的异常。 室温下将如下液体加入到微量离心管中。 杂交缓冲液 7μl + 去离子水 1μl + 探针 2μl = 10μl 离心 3 秒，使探针混合液充分混匀。将 10?l 探针混合物滴加于玻片杂交区域， 立即加盖盖玻片，用 rubber cement 封片。变性：76℃ ，5 分钟；杂交：置于 42℃ 预热的湿盒，16 小时。 9、洗涤程序：洗涤前将 0.3%NP-40/2× SSC 置于 73℃ 水浴箱中至少 30 分钟。轻轻移 去盖玻片，迅速将玻片置于 0.3% NP-40/0.4× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 2 分 钟；取出玻片，室温下将玻片浸入 0.1% NP-40/2× SSC 中，振荡 3 秒，漂洗 2 分 钟；室温下将玻片置于 70％乙醇中 3 分钟。 10、样本复染：暗处自然干燥玻片。将 10?l DAPI 复染剂滴加于杂交区域位置，立即 加上盖玻片。暗处放置 10-20 分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察 玻片。 11、样本 FISH 结果观察：首先在 10 倍物镜下，于 FISH 标本玻片上找到杂交区域； 然后在 40 倍物镜下扫描整个区域，观察信号的质量，满意的标本应是 75%以上 细胞核中都有杂交信号； 100 倍物镜下观察细胞核的信号结果并进行信号分类 在 计数和比值计算。计数 200 个细胞，计算异常信号细胞所占的百分率。结果分析 时随机计数骨髓样本细胞。计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞。细胞 核轮廓不清或有重叠的不计数。杂交不均匀的区域不计数。 12、建立阈值：健康人群 20 例设为对照组，制备玻片及进行 FISH 实验。每份样本 分析 200 个细胞，计算出显示异常信号的细胞数，百分比的平均值及标准差，异 常阈值定义为平均值+3 倍标准差。异常阈值=平均值（M）+3× 标准差（SD） 。 13、根据阈值判断结果：每例样本随机记数 200 个细胞，如果显示异常信号细胞比例42 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文的检测值大于异常阈值， 判定为阳性结果； 如果显示异常信号细胞比例的检测值 小于异常阈值，判定为阴性结果。 （三）统计学分析：采用 SPSS 17.0 软件进行统计学处理。检测阳性率的差异性比较 使用卡方检验。P 值小于 0.05 时认为有统计学意义。43 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文结果患者基本信息 本研究共采集 55 例 MM 患者骨髓标本，包括初治及经治病人。其中男性患者 35 名，女性患者 20 名，患者中位年龄为 57 岁。其浆细胞比例分布见表 1：表 1：患者浆细胞比例分布 临床特征 性别 男 女 骨髓浆细胞比例 &10% 10~30% 30~50% &50% 4 23 15 13 7.3 41.8 27.3 23.6 35 20 63.6 36.4 病例数目 百分比%cIg FISH 与 FISH 阳性检出率的比较 55 名 MM 患者中，cIg FISH 检出 del13q14 阳性率为 58.2%(32/55)，常规 FISH 检 出率为 41.8%(23/55)。在浆细胞比例&10%的患者中，cIg FISH 检出率为 50%(2/4)，常 规 FISH 未检出异常。 在浆细胞比例&30%的患者中， FISH 检出率为 51.9%(14/27)， cIg 常规 FISH 检出率为 22.2%(6/27)， 差异有统计学意义 （p=0.024）在浆细胞比例 30~50% 。 的患者中，cIg FISH 检出率与常规 FISH 检出率无统计学差异。而在浆细胞比例&50% 的患者中，两者的检出率相同。 （见图 1、表 2、表 3）表 2：55 名 MM 患者阳性率的检出 cIg FISH del13q14 amp1q21 58.2%(32/55) 52.7%(29/55) FISH 41.8%(23/55) 40.0%(22/55) 差异比较 p=0.086 p=0.18144 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文表 3：del13q14 检出率的比较 浆细胞比例 &10% &30% 30~50% &50% cIg FISH 50%(2/4) 51.9%(14/27) 60.0%(9/15) 69.2%(9/13) FISH 0 22.2%(6/27) 53.3%(8/15) 69.2%(9/13) 差异比较 p=0.024 P=0.713 -在 amp1q21 的检测中，cIg FISH 检出阳性率为 52.7%(29/55)，常规 FISH 检出率 为 40.0%(22/55)。在浆细胞比例&10%的患者中，cIg FISH 检出率为 75%(3/4)，常规 FISH 检出 1 例异常。在浆细胞比例&30%的患者中，cIg FISH 检出率为 55.6%(15/27)， 常规 FISH 检出率为 29.6%(8/27)（p=0.054） 。在浆细胞比例&30%的患者中，cIg FISH 检出率与常规 FISH 检出率相同。 （见图 1、表 2、表 4）表 4：amp1q21 检出率的比较 浆细胞比例 &10% &30% 30~50% &50% cIg FISH 75%(3/4) 55.6%(15/27) 53.3%(8/15) 46.2%(6/13) FISH 25%(1/4) 29.6%(8/27) 53.3%(8/15) 46.2%(6/13) 差异比较 p=0.054 -图 1：左图为 cIg FISH 检测 1q21 扩增，右图为 cIg FISH 检测 13q14 缺失。45 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文讨论多发性骨髓瘤（MM）是单克隆浆细胞的异常增殖性疾病。MM 患者的临床进程 呈现出很大的差异。大量遗传学的研究证明 MM 与其他血液系统恶性疾病一样，其 单克隆浆细胞存在多种复杂的染色体异常，对 MM 的诊治具有重要临床意义。1-4 现 代遗传学检测技术的发展大大提高了 MM 染色体异常的检出率，不仅为我们更深入 的了解 MM 的发病机理提供了更多的依据；同时也为临床对 MM 疾病的诊治提供了 支持。 MM 遗传学异常的研究经历了多个阶段： 对 从传统的 G 显带核型分析， FISH 到 检测、比较基因组杂交（CGH） 、单核苷酸多态性分析（SNP）等等。FISH 检测不仅 能够分析染色体的扩增和缺失，还能够检测出染色体的平衡易位，其针对性强，灵敏 度高，且操作简便、检测周期短，得以在临床上广泛推广。 FISH 检测中对阳性率的评价，通常是计数 100 个以上细胞，得出异常信号的细 胞比例，再同阈值比较判断阳性。对于骨髓浆细胞比例较低的 MM 患者，骨髓中大 量的非浆细胞有核细胞，包括中性粒细胞、淋巴细胞、晚幼红细胞等等，并不存在染 色体异常，若计数骨髓中的所有有核细胞，会大大降低异常信号细胞的比例，从而导 致假阴性的产生。因此，对浆细胞提纯或者确认，来单独计数浆细胞上染色体的异常 情况，对此类患者来说，可大大提高染色体异常的检出率。5 对浆细胞的确认，主要 有两种方法：CD138 磁珠分选和胞质轻链染色。本研究选取 cIg FISH 检测方法，通 过对浆细胞胞质中的免疫球蛋白轻链进行荧光染色， 从而识别浆细胞。 本研究证实了， 在浆细胞&30%的患者中，del13q14 的 cIg FISH 检出率为 51.9%(14/27)，常规 FISH 检 出率为 22.2%(6/27)，差异有统计学意义（p=0.024） 。amp1q21 的 cIg FISH 检出率为 55.6%(15/27)，常规 FISH 检出率为 29.6%(8/27)（p=0.054） 。后者并没有显示出明显 的统计学差异，相信与样本量不够大有关，虽然如此，亦体现出 cIg FISH 较高的检出 率。在浆细胞&30%的患者中，cIg FISH 与 FISH 检测的阳性率并没有明显的差异。 CD138 磁珠分选同样可以获得更高的染色体异常检出率。6,7 但磁珠分选并不能 区分正常浆细胞和克隆性浆细胞， 而对于某些表面不表达 CD138 的 MM 细胞亚群 （如 凋亡细胞） ，CD138 磁珠分选法亦无法识别。8 而且 CD138 分选需要对骨髓液中的浆 细胞进行富集，因此需要采集大量的骨髓液，这在实际临床操作中常常难以完成。cIg46 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文FISH 仅在骨髓涂片上完成，对骨髓液采集量要求不高，在临床工作中可操作性较强。 但 cIg FISH 也具有其局限性，尚没有文献报道 cIg FISH 对于不分泌型 MM 的浆细胞 确认，而且骨髓涂片中其他细胞含量高，处理步骤复杂，对于涂片质量不高、细胞重 叠的涂片无法进行检测。9 尽管两种浆细胞确认方式各有其优势劣势，但其检测出的 阳性率，并没有显著的差异。将两种方法结合使用，将会优劣互补。国外已有实验室 开展两种浆细胞确认方式同时进行，对 MM 的染色体异常检测，取得了满意的效果。参考文献1、Dewald G.W., Kyle R. 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[Epub ahead of print] 6、Avet-Loiseau H, Facon T, Grosbois B, et al: Oncogenesis of multiple myeloma: 14q32 and 13q chromosomal abnormalities are not randomly distributed, but correlate with47 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文natural history, immunological features, and clinical presentation. Blood. ): 、安刚, 李承文, 李倩等：免疫磁珠分选对荧光原位杂交检测多发性骨髓瘤细胞遗传 学异常的影响。中国实验血液学杂志，2011 ; 19( 1): 54- 58。 8、Jourdan M, Ferlin M, Legouffe E, et al: The myeloma cell antigen syndecan-1 is lost by apoptotic myeloma cells. Br J Haematol, : 637-646. 9、 Ahmann GJ, Jalal SM, Juneau AL, et al: A novel three-color, clone-specific fluorescence in situ hybridization procedure for monoclonal gammopathies. Cancer Genet Cytogenet, : 7-11.48 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第三部分 FISH 检测慢性淋巴细胞白血病分子遗传学 异常及其临床意义B 细胞慢性淋巴细胞白血病（B-CLL）是西方国家最多见的成年人血液恶性增殖 性疾病。在东方国家发病率较低。B-CLL 的病程呈现出多样性和复杂性，部分病人在 诊断初期即出现明显的临床症状，病情进展迅速；而部分患者在诊断后多年并无明显 的临床症状。因此，临床医生需要在疾病早期对病程进行合理推断，从而选择正确的 治疗策略。CLL 的预后因素主要有临床分期、分子细胞遗传学异常、免疫球蛋白重链 可变区基因突变、CD38 和 ZAP-70 的表达等。1-3 采用间期 FISH 技术，可发现 80% 的 CLL 患者存在染色体异常，其中常见的包括 del13q14、+12、del11q22、del17p13、 t(14q32)等。4-6 FISH 不仅可以帮助判断预后，还可以协助进行鉴别诊断。如套细胞淋 巴瘤（MCL）早期临床症状、细胞学特点与 CLL 类似，但 95%以上的 MCL 具有 IGH/CCND1 阳性的遗传学特点，故可以从而鉴别。7 本实验研究了 94 例在本院就诊 的 CLL 患者的染色体异常情况，并初步分析 CLL 患者染色体异常的临床意义。材料和方法一、实验试剂 1、肝素钠（Heparin Sodium）抗凝剂，2ml：12500 单位，购自南京新百有限公司。 2、4-壬基苯基-聚乙二醇， （Nonidet P-40，NP-40，octylphenoxypolyethoxyethanol） ， 购自 Sigma 公司。 3、IGH/CCND1 FISH 检测试剂盒（Vysis IGH/CCND1 Dual Color Dual Fusion Probes kit，货号 05J69-001） ，购自美国雅培公司。 包括：a. IGH/CCND1 双色融合探针 b. 杂交缓冲液 4、CLL FISH 检测试剂盒（货号 F01004-02） ，购自北京金菩嘉医疗科技有限公司。包 括杂交缓冲液，DAPI 及以下探针：49 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文探针名称 RB1 D13S25 ATM P53 CSP12 检测位点 13q14 13q14.3 11q22.3 17p13 12p11.1-q11.15、无水乙醇，甲醇，冰醋酸，氯化钾，氯化钠，柠檬酸钠（国产分析纯） 。二、主要实验仪器 1、电子天平，美国 Mettler Toledo 公司 2、恒温水浴箱，上海新苗有限公司 3、电热恒温培养箱，上海新苗有限公司 4、水平离心机，湖南赛特湘仪公司 5、BX51 荧光显微镜，日本 Olympus 公司 6、ProgResMFcool 显微镜分析仪 7、净水机，美的公司 8、0.5-1000μ l 移液器，德国 Eppendoff 公司 9、-20 度及 4 度冰箱，容声电器有限公司三、主要实验试剂的配制 1、标准柠檬酸盐储存液：20×SSC 氯化钠 柠檬酸钠 去离子水 88g 44g 400ml充分溶解，盐酸调节 pH 值至 5.3，去离子水定容至 500ml。 2、标准柠檬酸盐工作液：2×SSC50 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文20×SSC（pH5.3） 100ml 去离子水 800ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0±0.2，去离子水定容至 1L。 3、各浓度乙醇溶液：70％乙醇：700ml 无水乙醇，用去离子水稀释至 1L；85％乙 醇：850ml 无水乙醇，用去离子水稀释至 1L。 4、固定液： （甲醇：冰乙酸体积比 3：1） 量取 30ml 甲醇和 10ml 冰乙酸，充分混匀，使用前新鲜配制。 5、0.1%NP-40/2×SSC 溶液 20×SSC（pH5.3） 40ml NP-40 去离子水 0.4ml 300ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0±0.2，去离子水定容至 400ml。 6、0.3％NP-40/0.4×SSC 溶液 20×SSC（pH5.3） 20ml NP-40 去离子水 3ml 950ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0-7.5，去离子水定容至 1L。 7、低渗溶液（0.075 M KCl） KCl 去离子水 2.795g 300ml充分混匀，用去离子水定容至 500ml。四、实验方法与步骤 1、病例收集及分类：从 2008 年 3 月至 2011 年 12 月，在本院共有 94 名 CLL 患者纳 入研究。在获得患者知情同意之后，取外周血进行 FISH 检测。 2、标本采集。采新鲜外周血 2ml，0.3ml 肝素抗凝。 3、收集细胞：将血液移至尖底离心管，1300rpm/min，5min；弃上清，吸管混匀后缓51 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文缓加入 37℃ 预热的 0.075mol/L KCL 溶液至 8ml 进行低渗处理，继续用吸管混匀 后置 37℃ 水浴箱 15min，中间吹打混匀 1~2 次；加入 1ml 3:1 甲醇:冰醋酸固定液 进行预固定，吸管充分混匀；1300rpm/min 离心 5min，弃上清，缓缓加入 3:1 甲 醇/冰醋酸固定液至 8ml，混匀，室温下静置 10min 进行固定；1300rpm/min 离心 5min， 去上清， 缓缓加入 3:1 甲醇/冰醋酸固定液至 8ml， 混匀， 室温下静置 10min， 1300rpm/min 离心 5min，弃上清，充分混匀后，再加入固定液至 2ml，置-20℃ 冰 箱冷藏，可随时取出供 FISH 检验。 4、FISH 玻片制片：取出细胞悬液，1300rpm/min 离心 5 分钟，去上清，按细胞数量 加入适量固定液，用吸管将细胞悬液轻轻吹打混匀后吸取少量，滴至干净的载玻 片上，自然晾干。 5、老化：室温放置过夜或 56℃ 烤片至少 60 分钟。玻片放入片盒中，室温干燥保存。 剩余标本置于-20℃ 冰箱备用。 6、将玻片置于 37℃ 2× SSC 溶液中浸泡 30 分钟。室温下将玻片依次置于 70%乙醇、 85％乙醇和 100％乙醇中各 3 分钟脱水。自然干燥玻片。 7、探针配制。所用探针 RB1、D13S25、ATM、p53、CSP12（北京金菩嘉医疗科技有 限公司） ，分别检测 13q14、13q14.3、11q22、17p13、12 号染色体着丝粒位点的 异常。探针 IGH/CCND1(Vysis，美国雅培公司)检测 t(11;14)。 室温下将如下液体加入到微量离心管中。 杂交缓冲液 7μl + 去离子水 1μl + 探针 2μl = 10μl 离心 3 秒，使探针混合液充分混匀后。将 10?l 探针混合物滴加于玻片杂交区域， 立即加盖盖玻片，用 rubber cement 封片。共变性：76℃ 分钟，杂交：置于 42℃ ，5 预热的湿盒，16 小时。 8、洗涤程序：洗涤前将 0.3%NP-40/2× SSC 置于 73℃ 水浴箱中至少 30 分钟。轻轻移 去盖玻片，迅速将玻片浸入 0.3% NP-40/0.4× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 2 分 钟；室温下将玻片浸入 0.1% NP-40/2× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 1 分钟；室 温下将玻片置于 70％乙醇溶液中 3 分钟。 9、样本复染：暗处自然干燥玻片。将 10?l DAPI 复染剂滴加于杂交区域位置，立即52 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文加上盖玻片}
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荧光原位杂交技术检测多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞白血病分子遗传学异常及其临床意义
分 类 号 学校代码 10487学号 D 密级博士学位论文荧光原位杂交技术检测多发性骨髓瘤和慢 性淋巴细胞白血病分子遗传学异常 及其临床意义学 位 申 请 人 ： 陈蕾 学 科 专 业 ： 内科学（血液病） 指 导 教 师 ： 胡豫教授 答 辩 日 期 ： 2012 年 5 月 A dissertation submitted to Huazhong University of Science and Technology for the Degree of Doctor of MedicineClinical significance of genetic abnormalities detected by interphase fluorescence in situ hybridization in multiple myeloma and chronic lymphocyte leukemiaD.Candidate Major Supervisor: Chen Lei : Hematology : Prof. Hu YuHuazhong University of Science & Technology Wuhan 430074, P. R. ChinaMay 2012 独创性声明本人郑重声明， 本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名： 日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□ ，在_____年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密□。 （请在以上方框内打“√” ）学位论文作者签名： 日期： 年 月 日指导教师签名： 日期： 年 月 日 目录主要缩略词表…………………………................………………………………………………………..1 前言……………………………………………………………………................………………………..2 中文摘要.…………………………………...............……………………………………………………. 5 Abstract…………………………………………………………………………………………...............8 第一部分 FISH 检测多发性骨髓瘤分子遗传学异常及其临床意义.....................................................12 材料和方法……………………………….............................................................…..………………… 12 结果…………….........................................................................………………………...………………20 讨论…………………….........................................................................……………...…………………31 参考文献……….................................................................……………………...………………………34 第二部分 cIg FISH 与 FISH 检测多发性骨髓瘤方法学比较................................................................37 材料和方法………………………………................................................................……………………37 结果…………….........................................................................……………………...…………………44 讨论…………………….........................................................................………………...………………46 参考文献……….................................................................……………………………...………………47 第三部分 FISH 检测慢性淋巴细胞白血病分子遗传学异常及其临床意义.........................................49 材料和方法……………………………….............................................................……….......…………49 结果…………….........................................................................………………………………...………54 讨论…………………….........................................................................…………………………...……59 参考文献……….................................................................…………………………………………...…60 结论…………………………………………….. …….............................................................................63 综述……………………………………………………............................................................................65 参考文献……………………………………………………....................................................................70 致谢……………………………………………….……...........................................................................75 附录： 攻读学位期间已发表的论文..........................................................................................................77 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文英文缩略词表英文缩写 MM CLL FISH cIg FISH PFS OS MGUS 英文全称 Multiple myeloma Chronic lymphocyte leukemia Fluorescence in situ hybridization Cytoplasmic immunoglobulin light chain FISH Progression-free survival Overall survival Monoclonal significance SMM sCR CR VGPR PR SD ORR RB1 IGH IGL CCND1 FGFR3 MAF ATM Smoldering multiple myeloma Stringent complete response Complete response Very good partial response Partial response Stable disease Overall response rate Retinoblastoma 1 Immunoglobulin heavy chain Immunoglobulin light chain Cyclin D1 Fibroblast growth factor receptor 3 Musculoaponeurotic fibrosarcoma The mutated form of the ataxia-telangiectasia gene Nuclear factor κ B 4',6-diamidino-2-phenylindole 冒烟型多发性骨髓瘤 严格完全缓解 完全缓解 非常好的部分缓解 部分缓解 疾病稳定 总缓解率 遗传性视网膜母细胞瘤致癌因子 免疫球蛋白重链基因 免疫球蛋白轻链基因 周期蛋白 D1 成纤维细胞成长因子受体 3 肌腱膜纤维肉瘤癌基因 共济失调性毛细血管扩张症基因突 变形式 NF-κ B DAPI 核因子κ B 4,6-二脒基-2-苯基吲哚 gammopathy of undetermined 中文名称 多发性骨髓瘤 慢性淋巴细胞白血病 荧光原位杂交 胞质轻链免疫荧光原位杂交 无进展生存期 总生存期 意义未明单克隆免疫球蛋白血症1 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文荧光原位杂交技术检测多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞 白血病分子遗传学异常及其临床意义博士研究生：陈蕾 导师：胡豫教授 华中科技大学附属协和医院血液病研究所前言多发性骨髓瘤（MM）是分化终末期的 B 细胞（浆细胞）异常增殖，从而产生大 量单克隆免疫球蛋白的恶性疾病。其临床症状包括浆细胞瘤性包块导致的压迫，骨髓 造血微环境的改变从而使得造血功能下降血细胞减少，骨质破坏，蛋白沉积导致器官 功能损失，免疫抑制导致感染等。 MM 的单克隆浆细胞中存在多种复杂的染色体异常， 且染色体异常在浆细胞的克 隆增殖过程中发生较早， 参与疾病的发生发展。多数 B 细胞肿瘤中可发现免疫球蛋白 重链基因 IGH 易位和轻链基因 IGL 的易位。 研究发现 IGH 易位存在于近 50%的 MGUS 或 SMM 中， 髓内 MM 中可发现 55~70%存在 IGH 易位， 原发性浆细胞白血病中 80%， 人类骨髓瘤细胞系中 90%。由此可见，IGH 易位或许是 MM 发病中的早期遗传异常 事件，且与疾病的进展有关。大多数 IGH 易位见于以下位点，影响定位于附近的基 因表达：11q13(CCND1)，4p16(FGFR3 和 MMSET)，16q23(c-MAF)，6p21(CCND3)， 20q11(MAFB)， 这些基因表达的改变， 对于 MM 患者的治疗以及预后均有不同程度的 影响。IGL 染色体的改变较为罕见，研究资料较少。MM 患者中有 30~50%存在 13q 染色体缺失 （del13q） 对于接受常规化疗或者行自体干细胞移植术前的大剂量化疗的 ， 患者，del13q 是不良预后因素之一。1q21 染色体扩增(amp1q21)，见于约 40%的 MM 患者，存在 amp1q21 的患者预后较差，生存期较短，易复发。约 10%MM 患者可发 现 17p13 染色体缺失 （del17p13） 此类患者病情进展快， ， 生存期短， 对治疗反应较差， 髓外病变、 高钙血症及浆细胞瘤的发生率较高， del17p13 被认为是 MM 高危因素之一。2 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文大量临床研究证实，MM 患者染色体异常在疾病发生发展过程中起着举足轻重的作 用，对于指导治疗、判断预后均有重要的临床意义。 MM 主要在老年人群中发病，近年来，MM 有发病低龄化和发病率增高的趋势。 迄今为止， MM 仍然是个不可治愈的疾病。 治疗的主要目标是延长无进展生存期 （PFS） 和总生存期（OS） 。马法兰联合地塞米松做为初治 MM 患者的一线治疗方案已有 40 余年，可获得中位生存期 29 至 37 个月。近十余年，临床医生更倾向于对低于 65 岁 患者进行自体造血干细胞移植治疗， 但高龄患者以及有严重临床并发症的患者并无法 耐受。因 MM 本身是老年人疾病，患者的中位年龄在 60 岁左右，这意味着在初治期 近半数的患者无法选择大剂量化疗。因此，选择安全有效的治疗方法，对这部分患者 群来说尤为重要。 硼替佐米，是一种硼酸二肽，是首次应用于人类疾病治疗的蛋白酶体抑制剂。可 通过干扰细胞信号通路而中断细胞周期，介导凋亡，抑制血管新生。其主要作用即抑 制 NF-κ B，从而干扰 NF-κ B 介导的细胞存活、肿瘤生长以及血管新生。在 MM 的 治疗中显示出其巨大的优势。 多项临床试验证实了硼替佐米以及硼替佐米联合应用其 他药物对于初治及复发的 MM 患者，均有较好的疗效。 在适合使用大剂量化疗和自体移植的 MM 患者中，若能够达到完全缓解（CR） 或至少接近完全缓解（VGPR） ，可获得较长的 PFS 和 OS。在不适合做自体移植的 MM 患者，如高龄患者中，使用传统化疗方法很难获得 CR，随着近年来新药的研发， 沙利度胺和硼替佐米的临床应用，大大提高了此类患者的 CR 以及 VGPR 率。 慢性淋巴细胞白血病（CLL）是单克隆 CD5+ B 细胞在外周血、骨髓以及淋巴组 织中恶性增殖的疾病。发病人群多为老年人，其发病中位年龄为 70 岁，发病率随着 年龄增高而增多，男性患者多见。在西方国家，CLL 是发病率最高的血液系统恶性疾 病。CLL 的中位生存期近 10 年，个体的预后存在很大的差异。随着诊断水平的进步， 多数 CLL 病人可以在疾病早期获得诊断，但是病情进程却呈现出很大的不同，部分 病人进展迅速，而部分病人病情可稳定 10 年以上，期间并不需要特殊治疗。因此， 在病情早期，进行准备的预后判断，选择合适的治疗方式尤为重要。 Rai 和 Binet 分期对 CLL 预后的判断曾起着举足轻重的作用，但是无法区分相同3 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文分期病人中预后的不同。多数的病人就诊于疾病的早期阶段，因此，临床医生只能通 过实验室的多项检测来推测患者的病程进展。CD38 表达和 ZAP-70 表达同样是较经 典的评估 CLL 的预后因素。除此之外，免疫球蛋白重链基因可变区的突变（IGHV） 同样是重要的预后因素之一。 最近研究表明细胞遗传学异常对了解疾病进展和评估疾 病预后有重要的临床意义。在 CLL 中，预后好的相关因素包括 IGHV 存在突变、低 CD38 表达、低 ZAP-70 表达以及不存在 17p 和 11q 缺失。 由于 MM 细胞和 CLL 细胞均为为分化终末期 B 细胞，增殖活性较低，分裂相不 易获得，大多处于分裂间期。常规 G 显带分析仅可以发现 30%的患者存在染色体异 常。而部分染色体改变，如 t(4;14)(p16.3;q32)，存在于 15~20%的 MM 患者中，在常 规核型分析中是无法识别的；t(14;16)(q32;q23)如果不借助其他特殊技术，则在 G 显 带分析中很难分辨出。 荧光原位杂交（FISH）技术，可对间期细胞进行染色体定位分析，检出率高，灵 敏度高，操作简单，不仅可用来检测三倍体或单倍体改变，也可检测染色体区段的缺 失或扩增，亦可检测染色体的异常易位。在中期分裂相不易获得的 MM 和 CLL 中具 有更突出的优势，可检测到与预后密切相关的累及基因位点的微缺失，异常克隆检出 率可显著提高，并且 FISH 检测还可以相对定量恶性克隆细胞的比例。随着 FISH 技 术的广泛应用，对 MM 和 CLL 的分子遗传学研究踏上了一个新台阶，检出率的提高 以及对更多复杂染色体异常的确认，不仅为发病机制的研究提供了更多的依据，也为 更好的开展临床诊治提供了支持。 由于部分 MM 患者骨髓浆细胞比例并不高，在 FISH 检测中，阳性率的检出依赖 于骨髓穿刺术所获得的良好的浆细胞比例，为了更准确的得知 MM 染色体的异常率， FISH 检测最好在克隆性浆细胞上进行。对于浆细胞的识别，目前主要有两种方式： CD138+磁珠分选和胞质轻链免疫荧光原位杂交法（cIg FISH） 。对于骨髓浆细胞比例 较低的患者，通过这两种浆细胞识别方法进行 FISH 检测具有重要的临床意义。 本研究 FISH 检测分析了大量临床 MM 与 CLL 患者标本，比较国人染色体异常 与国外文献报告的异同，并初步分析了染色体异常的临床意义。4 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文中文摘要第一部分 FISH 检测多发性骨髓瘤分子遗传学异常及其临床意义目的：了解中国人群 MM 患者的分子细胞遗传学异常情况，并探讨其临床意义。 方法：间期 FISH 技术检测 166 例初治多发性骨髓瘤患者的骨髓标本，汇总临床 资料，分析染色体异常与临床特征、治疗反应以及预后的关系。 结果：经 FISH 检测，88.0%（146/166）的 MM 患者存在不同程度的染色体异常， IGH 易位，即 t(14q32)，其异常率为 58.4%。其中 t(11;14)为 25.9%，t(4;14)为 17.5%， t(14;16)为 7.2%， 其他未确定的易位 7.8%。 del13q14， RB1 探针检出的异常率为 55.4%， D13S319 检出率为 53.6%。amp1q21 为 49.4%，del17p13 为 25.3%。其分子遗传学异 常与患者就诊时多项临床指标关系密切。使用硼替佐米化疗方案可改善患者的，尤其 存在 del13q14 患者的 CR+VGPR 率（p=0.004） 。染色体异常与患者的无进展生存期 （PFS）有关，最显著的为 del17p13 患者中位 PFS 为 4.9 月，无 del17p13 患者的中位 PFS 为 8.9 月（p&0.001） 。amp1q21 患者的中位 PFS 为 5.9 月（vs 8.8 月，p=0.002） 。 t(14;16)患者中位 PFS 为 3.0 月（vs 7.1 月，p=0.006） 。del13q14 的患者中位 PFS 为 6.7 月 （vs 8.6 月， p=0.043） del13q14 患者中合并 del17p13 的中位 PFS 较短 。 （4.6 月 vs 8.0 月，p=0.002） 。而在无 del17p13 的患者中，del13q14 患者与无 del13q14 患者的 PFS 无明显差异。 结论：中国人群 MM 患者的 del17p13 发生率较高，其余分子细胞遗传学异常率 与西方国家人群类似。MM 患者的染色体异常与临床特征、治疗反应和预后都有着密 切的联系。 关键词：多发性骨髓瘤，荧光原位杂交技术，细胞遗传学，预后5 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第二部分 cIg FISH 与 FISH 检测多发性骨髓瘤方法学比较目的：探讨 cIg FISH 与 FISH 对多发性骨髓瘤染色体异常检出率的差异。 方法：cIg FISH 与 FISH 同时检测同一 MM 患者的骨髓样本，比较其检出率的差 异，共比较 55 例 MM 患者的检出结果。 结果：55 名 MM 患者中，cIg FISH 检出 del13q14 阳性率为 58.2%(32/55)，常规 FISH 检出率为 41.8%(23/55)。 amp1q21 的 cIg FISH 检出阳性率为 52.7%(29/55)，常规 FISH 检出率为 40.0%(22/55)。在浆细胞&30%的患者中，del13q14 的 cIg FISH 检出率 为 51.9%(14/27)，常规 FISH 检出率为 22.2%(6/27)，差异有统计学意义（p=0.024） 。 amp1q21 的 cIg FISH 检出率为 55.6%(15/27)，常规 FISH 检出率为 29.6%(8/27) （p=0.054） 。在浆细胞&30%的患者中，cIg FISH 与 FISH 检测的阳性率并没有明显的 差异。 结论：在浆细胞低于 30%的 MM 患者中，使用 cIg FISH 检测染色体异常可明显 提高检出率。 关键词：多发性骨髓瘤，荧光原位杂交技术，胞质轻链免疫荧光原位杂交6 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第三部分 FISH 检测慢性淋巴细胞白血病分子遗传学异常及其临床意义目的：了解中国人群 CLL 患者的分子细胞遗传学异常情况，并探讨其临床意义。 方法：间期 FISH 技术检测 94 例 CLL 患者的外周血标本，汇总临床资料，分析 染色体异常与临床特征的关系。 结果：经 FISH 检测，81.9%（77/94）的患者存在不同程度的染色体异常。其中 35 名患者存在 2 种以上的染色体异常。最常见的染色体异常为 del13q14，阳性率为 55.3%（52/94） 。其次为+12，阳性率为 25.5%（24/94） 。del11q22 见于 19.1%（18/94） 的患者。del17p13 阳性率为 17.0%（16/94） 。Del11q22 和/或 del17p13 的患者分期多为 Rai 3 期和 4 期，以及 Binet C 期。del11q22 与 Rai 分期具有明显相关性（r=0.223， p=0.030） 。del17p13 与 Rai 分期（r=0.310，p=0.003）及 Binet 分期（r=0.229，p=0.032） 均呈明显相关。且 del11q22 细胞比例与 Binet 分期（p=0.001）有密切的相关性。 结论：中国人群 CLL 患者的分子细胞遗传学异常率与西方文献报道类似。CLL 染色体异常与临床分期等临床特征有密切的联系。 关键词：慢性淋巴细胞白血病，荧光原位杂交技术，细胞遗传学7 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文AbstractPart I Clinical significance of cytogenetic abnormalities detected by interphase fluorescence in situ hybridization in newly diagnosed multiple myeloma patientsObject: To investigate the clinical significance of the chromosomal changes in Chinese MM patients. Method: Interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) on bone marrow (BM) cells was performed in 166 enrolled MM patients. Relationships between chromosomal abnormalities and clinical features, response to therapies and prognosis were analyzed. Results: As a result of FISH, 88.0% (146/166) patients had chromosome changes. The incidences of each probe were IGH 58.4%, t(11;14) 25.9%, t(4;14) 17.5%, t(14;16) 7.2%, undetermined t(14q32) 7.8%. RB1 55.4%, D13S319 53.6%, amp1q21 49.4%, and del17p13 25.3%. Each cytogenetic abnormality was significantly correlated to clinical features. Treatments with bortezomib gave patients a notably higher CR+VGPR rates, especially for patients with del13q14 (p=0.004). The media PFS of patients with del17p13 was 4.9 months (vs 8.9 m, p&0.001). The media PFS of patients with amp1q21 was 5.9 m (vs 8.8m, p=0.002). And t(14;16) was 3.0 m (vs 7.1 m, p=0.006), del13q14 was 6.7 m (vs 8.6 m, p=0.043). Among patients with del13q14, the ones with del17p13 had a shorter median PFS(4.6m vs 8.0m, p=0.002). And among patients without del17p13, there's no significant difference of PFS between patients with and without del13q14. Conclusion: Chinese MM patients had a higher del17p13 rate compared with people in western countries. The other prevalence of chromosomal abnormalities of MM patients was similar in Chinese and other people. Cytogenetic changes were associated with patients'8 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文responses to therapies and prognosis. Key words: multiple myeloma, fluorescence in situ hybridization, cytogenetic, prognosis9 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文Part II Comparison of cytoplasmic immunoglobulin light chain FISH and normal FISH on detecting cytogenetic abnormalities in multiple myeloma patientsObject: To compare the positive rates of cytogenetic changes detected by cIg FISH and normal FISH in myeloma patients. Method: To perform cIg FISH and FISH on same patient's sample and compare the positive rates. 55 myeloma patients were analyzed in all. Results: As a result of cIg FISH, 58.2%(32/55) patients had del13q14 compared with 41.8%(23/55) by normal FISH. And 52.7%(29/55) patients had amp1q21 by cIg FISH compared with 41.8%(23/55). Among the patients with plasma cells&30%, cIg FISH found 51.9%(14/27) del13q14 patients compared with 22.2%(6/27) by normal FISH (p=0.024). And 55.6%(15/27) amp1q21 patients compared with 29.6%(8/27) (p=0.054). But in patients with plasma cells&30%, the positive rates showed no significant difference between cIg FISH and normal FISH. Conclusion: Among the patients with plasma cells&30%, cIg FISH improved the detection rate of cytogenetic abnormalities significantly. Key words: multiple myeloma, fluorescence in situ hybridization, cytoplasmic immunoglobulin light chain FISH10 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文Part III Clinical significance of cytogenetic abnormalities detected by interphase fluorescence in situ hybridization in chronic lymphocyte leukemia patientsObject: To investigate the clinical significance of the chromosomal changes in Chinese CLL patients. Method: Interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) on peripheral blood cells was performed in 94 CLL patients. Relationships between chromosomal abnormalities and clinical features was analyzed. Results: As a result of interphase FISH, 81.9%(77/94) patients had chromosome changes. 35 patients had more than one abnormalities. The most frequent change was del13q14, the incidence of that was 55.3%(52/94). The next was trisomy 12, which was observed in 25.5%(24/94) patients. The incidence of del11q22 was 19.1%(18/94), del17p13 was 17.0%(16/94). Most del11q22 or/and del17p13 patients were in Rai stage 3 and 4, and in Binet stage C. Del17p13 had a significant relationship with Rai stage(r=0.310，p=0.003) and Binet stage(r=0.229，p=0.032). The percentage of del11q22 cells was significantly correlated to Binet (p=0.001) stage systems. Conclusion: The prevalence of chromosomal abnormalities of CLL patients was similar compared to literatures. Cytogenetic changes were associated with patients' clinic stages. Key words: chronic lymphocyte leukemia, fluorescence in situ hybridization, cytogenetic11 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第一部分 FISH 检测多发性骨髓瘤分子细胞遗传学异常 及其临床意义多发性骨髓瘤（MM）是单克隆浆细胞的异常增殖性疾病。MM 患者的临床进程 呈现出很大的差异。大量遗传学的研究证明 MM 与其他血液系统恶性疾病一样，其 单克隆浆细胞存在多种复杂的染色体异常，对 MM 的诊治具有重要临床意义。1-4 传 统的染色体检查方法是 G 显带细胞遗传学技术，需细胞培养、染色体制备，且染色体 分析需要有较好质量的中期分裂相。MM 的中期分裂相不易获得，异常克隆检出率较5-7 低， 对疾病的预后提示作用小。 间期荧光原位杂交 （Fluorescence in situ hybridization,FISH）技术不需要中期分裂相，可分析大量间期细胞，且具有操作相对简单、敏感性 和特异性高的优点，FISH 不仅能够检测染色体的异常扩增与缺失，同样能检出染色 体的平衡易位，大大提高了 MM 染色体异常的检出率。材料和方法一、实验试剂 1、肝素钠（Heparin Sodium）抗凝剂，2ml：12500 单位，购自南京新百药业公司。 2、MM FISH 检测试剂盒（MM FISH test kit，货号 F01003-02） ，购自北京金菩嘉医 疗科技有限公司。包括杂交缓冲液，DAPI 及以下探针：探针名称 RB1 D13S319 1q21 P53 IGH 检测位点 13q14 13q14.3 1q21 17p13 14q323、IGH/CCND1 FISH 检测试剂盒（Vysis LSI IGH/CCND1 Dual Color Dual Fusion12 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文Probes kit，货号 05J69-001） ，购自美国雅培公司。 包括：a. IGH/CCND1 双色融合探针 b. 杂交缓冲液 4、IGH/FGFR3 FISH 检测试剂盒（Vysis LSI IGH/FGFR3 Dual Color Dual Fusion Probes Kit，货号 05J74-001） ，购自美国雅培公司。 包括：a. IGH/FGFR3 双色融合探针 b. 杂交缓冲液 5、IGH/MAF FISH 检测试剂盒（Vysis LSI IGH/MAF Dual Color Dual Fusion Probes kit，货号 05J84-004） ，购自美国雅培公司。 包括：a. IGH/MAF 双色融合探针 b. 杂交缓冲液 6、4-壬基苯基-聚乙二醇， （Nonidet P-40，NP-40，octylphenoxypolyethoxyethanol） ， 购自 Sigma 公司。 7、1:15000 胃蛋白酶，购自武汉天傲公司 8、无水乙醇，甲醇，冰醋酸，氯化钾，氯化钠，柠檬酸钠（国产分析纯） 。二、主要实验仪器 1、电子天平，美国 Mettler Toledo 公司 2、恒温水浴箱，上海新苗有限公司 3、电热恒温培养箱，上海新苗有限公司 4、水平离心机，湖南赛特湘仪公司 5、BX51 荧光显微镜，日本 Olympus 公司 6、ProgResMFcool 显微镜分析仪 7、净水机，美的公司 8、0.5-1000μ l 移液器，德国 Eppendoff 公司 9、-20 度及 4 度冰箱，容声电器有限公司13 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文三、主要实验试剂的配制 1、标准柠檬酸盐贮存液：20×SSC 氯化钠 柠檬酸钠 去离子水 88g 44g 400ml充分溶解，用盐酸调节 pH 值至 5.3，去离子水定容至 500ml。 2、标准柠檬酸盐工作液：2×SSC 20×SSC（pH5.3） 100ml 去离子水 800ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0±0.2，去离子水定容至 1L。 3、各浓度乙醇溶液：70％乙醇：将 700ml 无水乙醇，用去离子水稀释至 1L；85％ 乙醇：将 850ml 无水乙醇，用去离子水稀释至 1L。 4、0.1%NP-40/2×SSC 洗涤溶液 20×SSC（pH5.3） 40ml NP-40 去离子水 0.4ml 300ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0±0.2，去离子水定容至 400ml。 5、0.3％NP-40/0.4×SSC 洗涤溶液 20×SSC（pH5.3） 20ml NP-40 去离子水 3ml 950ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0-7.5，去离子水定容至 1L。 6、氯化钾低渗液（0.075 M KCl） KCl 去离子水 2.795g 300ml充分混匀，用去离子水定容至 500ml。 7、固定液： （甲醇：冰乙酸体积比 3：1）14 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文量取 30ml 甲醇和 10ml 冰乙酸，充分混匀，使用前新鲜配制。 8、胃蛋白酶工作液： 1:15000 胃蛋白酶 10M HCL 去离子水 50μ l 50μ l 50ml四、实验方法与步骤 1、病例收集及分类：从 2008 年 3 月至 2011 年 12 月，在协和医院、解放军 301 医院、 武汉市第一医院以及宜昌市中心医院，共有 166 名初治 MM 患者纳入研究。在 获得患者知情同意之后，取骨髓进行 FISH 检测。 2、标本采集。采新鲜骨髓液 3ml，0.3ml 肝素抗凝。 3、收集细胞：将骨髓液移至 15ml 离心管，1300rpm/min，5min；弃上清，吸管混匀 后缓缓加入 37℃ 预热的 0.075mol/L KCL 溶液至 8ml 进行低渗处理，继续用吸管 混匀后置 37℃ 水浴箱 30min，中间吹打混匀 1~2 次；加入 1ml 3:1 甲醇:冰醋酸固 定液进行预固定，吸管充分混匀；1300rpm/min 离心 5min，弃上清，缓缓加入 3:1 甲醇/冰醋酸固定液至 8ml，混匀，室温下静置 10min 进行固定；1300rpm/min 离 心 5min，去上清，缓缓加入 3:1 甲醇/冰醋酸固定液至 8ml，混匀，室温下静置 10min，1300rpm/min 离心 5min，弃上清，充分混匀后，再加入固定液至 2ml， 置-20℃ 冰箱冷藏，可随时取出供 FISH 检验。 4、FISH 玻片制片：取出细胞悬液，1300rpm/min 离心 5 分钟，去上清，按细胞数量 加入适量固定液，用吸管将细胞悬液轻轻吹打混匀后吸取少量，滴至干净的载玻 片上，自然晾干。 5、老化：室温放置过夜或 56℃ 烤片至少 60 分钟，室温干燥保存。剩余标本置于-20℃ 冰箱备用。 6、将玻片置于 37℃ 2× SSC 溶液中浸泡 30 分钟。 7、消化：将玻片置于 37℃胃蛋白酶工作液中 10~15 分钟，直至滴片区域变透明。 8、室温下将玻片依次置于 70%乙醇、85％乙醇和 100％乙醇中各 3 分钟脱水。自然15 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文干燥玻片。 9、探针配制：所用探针 RB1、D13S315、1q21、p53、IGH（北京金菩嘉医疗科技有 限公司） ，分别检测 13q14、13q14.3、1q21、17p13、t(14q32)位点的异常。探针 IGH/CCND1、 IGH/FGFR3、 IGH/MAF(Vysis，美国雅培公司)检测 t(11;14)、 t(4;14) 和 t(14;16)。 室温下将如下液体加入到微量离心管中。 杂交缓冲液 7μl + 去离子水 1μl + 探针 2μl = 10μl 离心 3 秒，将探针混合液充分混匀。将 10?l 探针混合物滴加于玻片杂交区域， 立即加盖盖玻片，用 rubber cement 封片。共变性：76℃ ，5 分钟；杂交：置于预 热的 42℃ 湿盒中，16 小时。 10、洗涤：洗涤前将 0.3%NP-40/2× SSC 溶液置于 73℃ 水浴箱中至少 30 分钟。轻轻移 去盖玻片，将玻片迅速置于 0.3% NP-40/0.4× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 2 分 钟；取出玻片，将玻片浸入室温 0.1% NP-40/2× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 2 分钟；将玻片浸入 70％乙醇溶液中 3 分钟。 11、样本复染：暗处自然干燥玻片。将 10?l DAPI 复染剂滴加于杂交区域位置，立即 盖上盖玻片。暗处放置 10-20 分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察 玻片。 12、样本 FISH 结果观察：首先在 10 倍物镜下，在 FISH 标本玻片上找到杂交细胞区 域；然后在 40 倍物镜下扫描整个区域，观察信号的质量，满意的标本应是 75% 以上的细胞核中都有杂交信号； 100 倍物镜下观察细胞核的结果并进行信号计 在 数和比值计算。计数 200 个细胞，计算异常信号细胞所占的百分率。结果分析时 随机计数样本细胞。计数的细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞。细胞核轮 廓不清或有重叠的不计数。杂交不均匀的区域不计数。 13、建立阈值：健康人群 20 例设为对照组。每份样本分析 200 个细胞，计算异常信 号的细胞数、百分比的平均值及标准差，异常阈值定义为平均值+3 倍标准差。 异常阈值=平均值（M）+3× 标准差（SD） 。 14、根据阈值判断结果：每例样本随机记数 200 个细胞，如果显示异常信号细胞比例16 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文的检测值大于异常阈值，判定为阳性结果；如果显示异常信号细胞比例的检测值 小于异常阈值，判定为阴性结果。 15、统计学分析：采用 SPSS 17.0 软件进行统计学处理。染色体异常与临床特征的组 间相关性比较采用皮尔森相关系数分析，治疗效果的比较使用卡方检验。PFS 的 分析运用 Kaplan and Meier 评估，并用 Log-rank 检验比较各染色体异常组的生存 率。P 值小于 0.05 时认为有统计学意义（双尾） 。附 1、MM 的诊断标准如下： 主要标准： ① 组织活检证明有浆细胞瘤或骨髓涂片检查：浆细胞&30%，常伴有形态改变。 ② 单克隆免疫球蛋白（M 蛋白） ：IgG&35g/L，IgA&20g/L，IgM&15g/L，IgD&2g/L， IgE&2g/L，尿中单克隆 K 或 λ 轻链&1g/24 小时，并排除淀粉样变。 次要标准： ① 骨髓检查：浆细胞 10%～30%。 ② 单克隆免疫球蛋白或其片段的存在，但低于上述标准。 ③ 线检查有溶骨性损害和（或）广泛骨质疏松。 X ④ 正常免疫球蛋白量降低：IgM&0.5g/L, IgA&1.0g/L, IgG&6.0g/L。 凡满足下列任一条件者可诊断为 MM： 主要标准第 1 项+第 2 项；或第 1 项主要标准+次要标准② ③ ④ 中之一；或第 2 项 主要标准+次要标准① ③ ④ 中之一；或次要标准① ② +次要标准 ③ ④ 中之一。 2、分期按照国际分期体系（ISS） ，标准见表 1：表 1：ISS 分期 分期 I ISS 分期标准 β2-MG＜3.5mg/L， 白蛋白≥35g/L； II III 不符合 I 和 III 期的所有患者 β2-MG≥5.5mg/L。17 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文3、 治疗效果的评价根据国际骨髓瘤工作组的标准， 分为完全缓解 （CR） 接近完 全 ， 缓解（VGPR） ，部分缓解（PR）和病情持续（SD） 。标准见表 2：表 2：国际骨髓瘤工作组疗效标准 分类 sCR 标准 完全缓解，并符合 游离轻链比例正常 免疫组化或免疫荧光证实骨髓中无单克隆浆细胞CR血清及尿中免疫固定电泳检测阴性 软组织未见浆细胞瘤 骨髓浆细胞≤5%VGPR免疫固定电泳可检出血清及尿中 M 蛋白，但常规电泳无法检出 血清中 M 蛋白减少 90%及以上，加上尿中 M 蛋白＜100mg/24hPR血清 M 蛋白减少≥50% 24 小时尿 M 蛋白减少≥90%或＜200mg/24h 若血清和尿 M 蛋白无法检测，可以游离轻链水平下降≥50%计 若血清、尿 M 蛋白及血游离轻链均无法检测，可以骨髓浆细胞 比例下降≥50%计， 同时骨髓浆细胞基础值须≥30%且组织浆细胞 瘤大小减少≥50%SD不符合 CR, VGPR, PR 及疾病进展标准4、 疗效的分析根据总缓解率 （ORR, overall response rate） 其定义为 CR+VGPR+PR。 ， 无进展生存期（PFS, progression free survival）起点为初次治疗时，终点为病情发 生进展或任何原因所致的死亡。疾病进展的评价依据国际骨髓瘤工作组标准，见18 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文表 3：表 3：国际骨髓瘤工作组疾病进展及复发标准 分类 疾病进展 （用于计算 PFS 的终点） 标准 至少符合以下标准之一： 与基础值相比升高≥25% 血清 M 蛋白水平升高的绝对值必须达到 0.5g/dL 24 小时尿 M 蛋白增长绝对值必须≥200mg/24h 如果血清和尿 M 蛋白无法检出，轻链增长绝对值&l0mg/dL 骨髓浆细胞比例的绝对值至少达到 10% 出现新的溶骨性病变或者软组织浆细胞瘤或现存骨病变或者软组 织浆细胞瘤增大 排除其他原因引起的高钙血症加重(校正血钙&l1.5mg/dL，或者 2.65mmol/L临床复发至少符合下述条件之一： 出现新的溶骨性病变或者软组织浆细胞瘤 现存骨病变或者软组织浆细胞瘤增大&50%（至少 1cm） 高钙血症（ l1.5mg/dL，或者 2.65mmol/L） 血红蛋白下降≥2g/dL（1.25mmol/L） 血肌酐上升≥2mg/dL（177?mmol/L）完全缓解后复发至少符合下述条件之一： 免疫固定或者常规电泳检查血或尿 M 蛋白再次出现 骨髓浆细胞比例≥5% 疾病进展的任何指征之一19 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文结果患者资料 共 166 名患者纳入调查，其中男性患者 99 名，女性 67 名。中位年龄为 56 岁（年 龄区间：34 岁至 78 岁） 。诊断时，90 名患者处于 ISS 分期的 III 期，占 54.2%。患者 详细资料及临床特征详见表 4。表 4：患者基本资料 临床特征 性别 男 女 中位年龄 (年龄区间) &56 岁 ISS 分期 I II III M 蛋白免疫分型 IgG IgA IgD 轻链型 不分泌型 骨髓浆细胞比例 &30% 血红蛋白&90g/L 血小板&100G/L 溶骨性破坏 66 39 19 36 6 82 103 39 157 39.8 23.5 11.4 21.7 3.6 49.4 62.0 23.5 94.6 22 54 90 13.3 32.5 54.2 99 67 56 (34-78 ) 85 51.2 59.6 40.4 病例数目 百分比%20 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文分析临床资料显示多个临床特征之间有着密切的联系。患者的 ISS 分期与骨髓浆 细胞比例呈显著正相关（r=0.306，p=0.001） ，与患者血红蛋白水平呈显著负相关 （r=0.531，p＜0.001） ，与患者血小板水平呈显著负相关（r=0.238，p=0.013） ，与血 肌酐水平正相关（r=0.488，p＜0.001） ，与血尿酸水平正相关（r=0.332，p=0.003） ， 与血钙水平正相关（r=0.195，p=0.048） 。可见 ISS 分期方式虽然简单直接，但与各个 临床特征，包括血象、骨髓象、以及肾功能均有紧密的联系，是种经典、易临床推行 的分期方法。FISH 检测结果以及与临床特点的关系 间期 FISH 检测的结果显示，88.0%（146/166）的病人存在不同程度的染色体异 常。最常见的染色体异常为 IGH 易位，即 t(14q32)，其异常率为 58.4%（97/166） 。其 中 t(11;14)为 25.9%（43/166） ，t(4;14)为 17.5%（29/166） ，t(14;16)为 7.2%（12/166） ， 其他未能确定的 14q32 易位占 7.8%（13/166） 。其次最常见的染色体异常为 13q14 缺 失（del13q14） ，RB1 探针检测出的异常率为 55.4%（92/166） ，D13S319 检测出的异 常率为 53.6% （89/166） 探针 RB1 的检出敏感性高于 D13S319。 ， 1q21 扩增 （amp1q21） 率为 49.4%（82/166） 。17p13 缺失（del17p13）见于 25.3%（42/166）的患者。 （图 1）图 1A：左图为 IGH 易位患者，右图为正常对照21 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 1B：此图显示的为 t(4;14)的患者，左上 t(11;14)为阴性，右上 t(14;16)显示为阴性，下方两 张图显示的为 t(4;14)阳性，红绿信号融合成黄色。22 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 1C：左图为 del13q14 的患者，右图为正常对照图 1D：左图为 amp1q21 患者，右图为正常对照23 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 1E：左图为 del17p13 患者，右图为正常对照在研究中， 我们发现各个染色体异常与患者的某些临床指标及临床症状有密切的 联系，也许与该染色体区段的缺失或扩增，影响定位在该区段的基因表达，从而影响 下游蛋白水平，最终与疾病的发生发展有关。 分析表明，amp1q21 阳性率与 ISS 分期密切相关（r=0.311，p=0.001） ，与骨髓浆 细胞比例（r=0.216，p=0.011） ，与血红蛋白水平（r=0.532，p＜0.001） ，与血小板水 平 （r=0.363， p＜0.001） 与血白蛋白水平 ， （r=0.300， p=0.002） 与血肌酐水平 ， （r=0.234， p=0.032） ，与尿酸水平（r=0.312，p=0.005）均密切相关，且与 t(14;16)易位显著相关 （r=0.265，p=0.009） 。 del13q14 与血清 M 蛋白水平（r=0.180，p=0.021） ，与骨髓浆细胞比例（r=0.357， p＜0.001） ，与血白蛋白水平（r=0.200，p=0.039）密切相关。 del17p13 与 ISS 分期（r=0.214，p=0.019） ，与白细胞减少（r=0.226，p=0.012） ， 与血 LDH（r=0.472，p＜0.001）显著相关。 IGH 易位与溶骨性破坏累计部位（r=0.226，p=0.013） ，与血清 M 蛋白水平 （r=0.215， p=0.005）与骨髓浆细胞比例 ， （r=0.237， p=0.005）与血白蛋白水平 ， （r=0.195，24 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文p=0.044） ，与血尿酸水平（r=0.281，p=0.012）均呈密切相关。其中 t(4;14)与 t(14;16) 均与 ISS 分期显著相关（r=0.239，p=0.039；r=0.245，p=0.034） 。染色体异常与治疗效果的关系 为了了解不同染色体异常的患者使用不同的化疗方案， 所显示出的不同的治疗反 应，我们观察了在医院规范进行 3 疗程化疗的 99 名患者。按照不同的化疗方法，将 患者分成两组进行分析，一组使用包含硼替佐米的化疗方案，共 55 人，其中使用硼 替佐米（1.3mg/m2 ，第 1，4，8，11 天）加地塞米松（20 mg，第 1，2，4，5，8，9， 11，12 天）方案的 37 人，使用硼替佐米联合地塞米松及阿霉素（10mg，第 1-4 天） 方案的 11 人，使用硼替佐米联合地塞米松及沙利度胺的 7 人。另一组为使用不包含 硼替佐米方案的患者，共 44 人。其中使用 VAD 方案（长春新碱，阿霉素，地塞米松） 化疗的 23 人，使用 VADT（VAD 加沙利度胺）的 4 人，使用 MP 方案（马法兰，强 的松）5 人，MPT 方案（马法兰，强的松，沙利度胺）5 人，M2 方案（马法兰，环 磷酰胺，卡莫司汀，长春新碱，强的松）1 人，COMPT 方案（环磷酰胺，长春新碱， 马法兰，强的松，沙利度胺）1 人，交叉使用以上化疗方案的 5 人。99 名初治患者中， 11.1%（11/99）名患者获得 CR，10.1%（10/99）患者获得 VGPR，48.5%（48/99）获 得 PR，30.3%（30/99）名患者为 SD。疗效分析结果详见下表。表 5：总 99 人 缓解率（%） 非万珂化疗方案 (44 人) 含万珂化疗方案 （55 人） p CR 4.5%(2) 16.4%(9) 0.063 VGPR 4.5%(2) 14.5%(8) 0.101 C+V 9.1%(4) 30.9%(17) 0.008 PR 47.7%(21) 49.1%(27) 0.893 ORR 56.8%(25) 80.0%(44) 0.013 SD 43.2%(19) 20.0%(11) 0.013表 6：无染色体异常者 11 人 缓解率（%） CR VGPR 0 0 C+V 0 37.5%(3) PR 100%(3) 62.5%(5) ORR 100% 100% SD 0 0 非万珂化疗方案(3 人) 0 含万珂化疗方案 人） 37.5%(3) （825 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文表 7：有染色体异常者 88 人 缓解率（%） 非 万珂化疗 方案 (41 人) 含 万珂化疗 方案 （47 人） P CR 4.9%(2) 12.8%(6) 0.199 VGPR 4.9%(2) 17.0%(8) 0.073 C+V 9.8%(4) 29.8%(14) 0.020 PR 43.9%(18) 46.8%(22) 0.785 ORR 53.7%(22) 76.6%(36) 0.024 SD 46.3%(19) 23.4%(11) 0.024表 8：13q14 缺失 56 人 缓解率（%） 非 万 珂 化 疗 方案 （25 人） 含 万 珂 化 疗 方案 （31 人） P CR 4.0%(1) 12.9%(4) 0.245 VGPR 0 22.6%(7) 0.011 C+V 4.0%(1) 35.5%(11) 0.004 PR 48.0%(12) 35.5%(11) 0.344 ORR 52.0%(13) 71.0%(22) 0.145 SD 48.0%(12) 29.0%(9) 0.145表 9：1q21 扩增 50 人 缓解率（%） 非 万珂化疗 方案 （29 人） 含 万珂化疗 方案 （21 人） P CR 3.4%(1) 14.3(3) 0.163 VGPR 0 4.8%(1) C+V 3.4%(1) 19.0%(4) 0.070 PR 44.8%(13) 47.6%(10) 0.845 ORR 48.3%(14) 66.7%(14) 0.196 SD 51.7%(15) 33.3%(7) 0.196表 10：17p13 缺失 25 人 缓解率（%） 非 万珂化疗 方案 （13 人） 含 万珂化疗 方案 （12 人） p 表 11：IGH 易位 56 人 缓解率（%） 非 万珂化疗 方案 （28 人） 含 万珂化疗 方案 （28 人） P CR 7.1%(2) 3.6%(1) 0.553 VGPR 7.1%(2) 14.3%(4) 0.388 C+V 14.3%(4) 17.9%(5) 0.71626CR 0 8.3%(1) -VGPR 0 8.3%(1) -C+V 0 16.6%(2) -PR 38.5%(5) 50.0%(6) 0.561ORR 38.5%(5) 66.7%(8) 0.158SD 61.5%(8) 33.3%(4) 0.158PR 39.3%(11) 53.6%(15) 0.284ORR 53.6%(15) 71.4%(20) 0.168SD 46.4%(13) 28.6%(8) 0.168 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文表 12：t(11;14)易位 25 人 缓解率（%） 非 万珂化疗 方案 （12 人） 含 万珂化疗 方案 （13 人） P CR 16.7%(2) 7.7%(1) 0.490 VGPR 16.7%(2) 30.8%(4) 0.409 C+V 33.3%(4) 38.5%(5) 0.790 PR 41.7%(5) 53.8%(7) 0.543 ORR 75.0%(9) 92.3%(12) 0.238 SD 25.0%(3) 7.7%(1) 0.238表 13：存在 13q14 缺失但无 17p13 缺失者 41 人 缓解率（%） 非万珂化疗方案 （19 人） 含万珂化疗方案 （22 人） P CR 5.3%(1) 18.2%(4) 0.207 VGPR 0 31.8%(7) 0.007 C+V 5.3%(1) 50.0%(11) 0.002 PR 52.6%(10) 27.3%(6) 0.097 ORR 57.9%(11) 77.3%(17) 0.184 SD 42.1%(8) 22.7%(5) 0.184有临床研究证实，获得更高的 CR 率以及至少达到 VGPR，可以延长患者的 PFS 和 OS。8 和传统化疗方法相比，硼替佐米具有明显的优势。在纳入研究的 99 名患者 中，使用硼替佐米化疗组，比起非硼替佐米化疗方案组，获得了更高的 CR+VGPR 率 （30.9% vs 9.1%, p=0.008）以及更高的 ORR 率（80.0% vs 56.8%, p=0.013） 。在存在 染色体异常的 88 名患者中，使用硼替佐米化疗组，比非硼替佐米化疗组，也获得了 更高的 CR+VGPR 率（29.8% vs 9.8%, p=0.020）以及 ORR 率（76.6% vs 53.7%, p=0.024） 。存在 13q14 缺失的患者中，使用硼替佐米治疗亦可获得较高的 CR+VGPR 率（35.5% vs 4.0%, p=0.004） 。但是在存在 1q21 扩增，17p13 缺失以及 IGH 易位的患 者，使用两种方式化疗并没有显示出明显的差异。 （表 5~表 13）染色体异常与无进展生存期的关系 存在染色体异常的患者，其中位无进展生存期（PFS）与不存在染色体异常的患 者有明显的差异。具体来说，存在 amp1q21 的患者，其中位无进展生存期为 5.9 月， 而无 amp1q21 患者的中位 PFS 为 8.8 月 （5.9 月 vs 8.8 月， p=0.002， 见图 2A）del13q14 。 的患者，中位无进展生存期为 6.7 月，无 del13q14 患者的中位 PFS 为 8.6 月， （6.727 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文月 vs 8.6 月，p=0.043，见图 2B） 。存在 del17p13 的患者，其中位无进展生存期为 4.9 月（4.9 月 vs 8.9 月，p&0.001，见图 2C） 。存在 IGH 易位即 t(14q32)的患者，其中位 无进展生存期为 6.8 月（6.8 月 vs 9.0 月，p=0.049，见图 2D） 。存在 t(14;16)的患者， 其中位无进展生存期为 3.0 月（3.0 月 vs 7.9 月，p=0.006，见图 2E） 。 del13q14 患者中，合并 amp1q21 与未合并 amp1q21 的患者比较，其中位 PFS 无 显著差异（p=0.388） ；而合并 del17p13 的患者，其中位 PFS 显著短于不合并 del17p13 的患者（4.6 月 vs 8.0 月，p=0.002，图 2F） 。同时，在无 del17p13 的患者中，del13q14 患者的中位 PFS 比起无 del13q14 的患者， 并无显著性的差异 （8.0 月 vs 9.8 月， p=0.153） 。 此外，del13q14 合并 t(14;16)的患者，其中位 PFS 明显短于不合并 t(14;16)的患者（2.8 月 vs 7.2 月，p=0.001） 。amp1q21 患者，合并 del17p13 与未合并 del17p13 患者的中位 PFS，无明显差异（p=0.104） 。且 amp1q21 合并 t(14;16)的患者，其中位 PFS 亦明显 减少（3.0 月 vs 6.3 月，p=0.010） 。图 2A：Kaplan-Meier 曲线图：amp1q21 对患者 PFS 的影响，黑色线 代表无 amp1q21 患者组，灰色线代表 amp1q21 患者组（p=0.002）28 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 2B：Kaplan-Meier 曲线图：del13q14 对患者 PFS 的影响，黑色线 代表无 del13q14 患者组，灰色线代表 del13q14 患者组（p=0.043）图 2C：Kaplan-Meier 曲线图：del17p13 对患者 PFS 的影响，黑色线 代表无 del17p13 患者组，灰色线代表 del17p13 患者组（p&0.001）29 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 2D：Kaplan-Meier 曲线图：t(14q32)对患者 PFS 的影响，黑色线 代表无 t(14q32)患者组，灰色线代表 t(14q32)患者组（p=0.049）图 2E：Kaplan-Meier 曲线图：t(14;16)对患者 PFS 的影响，黑色线 代表无 t(14;16)患者组，灰色线代表 t(14;16)患者组（p=0.006）30 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 2F：Kaplan-Meier 曲线图：del17p13 对 del13q14 患者 PFS 的影响，黑色线 代表合并 del17p13 患者组，灰色线代表不合并 del17p13 患者组（p=0.002）研究亦证实，在治疗时获得 CR 及 VGPR，可显著延长患者的中位 PFS，其中位 值为 10.4 个月。PR 患者的中位 PFS 为 6.7 个月，SD 患者的中位 PFS 仅为 5.0 个月 （p=0.015，见图 3） 。此外，患者的 PFS 还与初治时的临床特征有密切的关系。如就 诊时的骨髓浆细胞比例（p=0.044） ，β2 微球蛋白的水平（p=0.007）等。讨论多发性骨髓瘤是处于分化终末期的 B 细胞形成的克隆性浆细胞肿瘤。 在其克隆性 浆细胞中，存在多种复杂的染色体异常。MM 是一种不可治愈的疾病，现代分子诊断 技术的发展，使人们了解到染色体异常在 MM 患者中发生率很高而且发生在疾病早 期阶段，参与疾病的发生发展。1-4 因此，能够在疾病诊断初期，了解 MM 患者的染 色体异常差异，评价患者的预后，选择不同的化疗方案，进行个性化的治疗，对于医31 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文图 3：Kaplan-Meier 曲线图：缓解率对患者 PFS 的影响，右侧黑色线代表 CR+VGPR 患 者组，中间曲线为 PR 患者组，左侧灰色曲线为 SD 患者组（p=0.015）学研究者来说，仍然是个需要探索的话题。 在欧美国家，MM 是发病率较高的血液恶性疾病之一，亚洲国家的 MM 发病率 则较低。本研究在纳入了在国内多家医院就诊 166 名初治的 MM 患者，对其染色体 异常进行了标准化 FISH 检测，FISH 检测出接近 90%的 MM 患者存在不同程度的染 色体异常， 阳性率的检出大大高于常规的 G 显带分析。 各染色体异常阳性率如下， IGH 易位 58.4%（97/166） 。其中 t(11;14)为 25.9%（43/166） ，t(4;14)为 17.5%（29/166） ， t(14;16)为 7.2%（12/166） ，其他未确定的 14q32 易位占 7.8%（13/166） 。del13q14， RB1 探针检测出的阳性率为 55.4%（92/166） ，D13S319 检测出的阳性率为 53.6% （89/166） 。amp1q21 为 49.4%（82/166） 。del17p13 为 25.3%（42/166） 。与韩国、台 湾等亚洲其他地区 MM 染色体异常率接近，9,10 中国 MM 患者的 del17p13 阳性率高 于西方文献报道的阳性率（25.3% vs 10%） ，是否 del17p13 的阳性率存在种族差异， 还是由于样本误差、检测误差等原因引起，还需要多中心大样本的实验进行证实。其32 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文余染色体异常率与西方国家人群均较一致。11 在对 MM 患者的治疗方面，前期文献证实获得 CR，或者至少达到 VGPR，可以8,12-14 显著延长患者的 PFS 及 OS。 本实验中我们比较了包含硼替佐米的化疗方案与其他传统化疗方案的疗效，结果提示对初治的 MM 患者使用硼替佐米化疗，可获得更 高的 CR+VGPR 率（30.9% vs 9.1%, p=0.008）以及更高的 ORR 率（80.0% vs 56.8%, p=0.013） 。本研究亦证实，治疗效果达到 CR，以及至少达到 VGPR，可显著延长患 者的中位 PFS，为 10.4 个月。患者的中位 PFS 为 6.7 个月，SD 患者的中位 PFS 仅为 5.0 个月（p=0.015） 。对于具体存在各种染色体异常的患者来说，硼替佐米的治疗， 与其他化疗方案相比，并不是处处显示出其优势。15-17 在对 del13q14 患者的治疗中， 硼替佐米化疗方案组的 CR+VGPR 率为 35.5%，显著高于非硼替佐米化疗组 4.0% （p=0.004） 。但对于其他染色体异常的患者，如 del17p13，amp1q21，以及 t(14q32) 等，硼替佐米化疗方案组，并没有获得更高的 CR+VGPR 率及 ORR 率，与非硼替佐 米化疗组没有明显的差异。 同样，染色体异常与患者的无进展生存期亦有密切的关系。18,19 关系较显著的为 del17p13，存在该染色体异常的患者，其中位 PFS 为 4.9 月，无 del17p13 患者的中位 PFS 为 8.9 月（4.9 月 vs 8.9 月，p&0.001） 。同样，amp1q21 患者的中位 PFS 为 5.9 月 （vs 8.8 月， p=0.002） t(14;16)易位的患者， 。 其中位 PFS 为 3.0 月 （vs 7.1 月， p=0.006） 。 另外，del13q14 的患者与无 del13q14 患者相比，其中位 PFS 也有一定的差异（6.7 月 vs 8.6 月，p=0.043） 。在 del13q14 患者群中，是否合并 amp1q21 对中位 PFS 并无明显 的影响。但合并 del17p13 与未合并 del17p13 的患者，其中位 PFS 有显著的差异（4.6 月 vs 8.0 月， p=0.002） 排除去 del17p13 的患者， 。 再将余下患者按照是否存在 del13q14 分成两组，分析比较中位 PFS，发现无显著性的差异（8.0 月 vs 9.8 月，p=0.153） 。 amp1q21 患者，合并 del17p13 与未合并 del17p13 患者的中位 PFS，无明显差异（4.5 月 vs 6.7 月，p=0.104） 。amp1q21 合并 t(14;16)的患者，其中位 PFS 亦明显减少（3.0 月 vs 6.3 月，p=0.010） 。由于病例数量的限制，本研究未能把存在 del13q14 患者中的 amp1q21 阳性的患者排除掉再行分析，因此，对于 del13q14 是否能够做为 MM 患者 独立的预后因素，仍然需要进一步的研究证实。33 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文本研究从立项至今，对患者的中位随访时间为 16.4 个月，根据 MM 患者的病情 进展情况，并不足以获得患者的总生存期（OS）数据，因此对染色体异常与预后的 研究采用患者的 PFS 数据来分析，是本实验的局限之一。PFS 比起 OS，具有独特的 优势，主要表现在其收集数据时间快，易于研究，而且可随时根据 PFS 的数据调整临 床化疗方案。尽管获得更长的 PFS 与 OS，均为治疗 MM 的重要目标，但是现有的研 究证实，PFS 并不能完全取代 OS 的地位。Ludwig 等研究证实，对老年 MM 患者进 行沙利度胺以及干扰素维持治疗，其 PFS 显著高于对照组（27.7 月 vs13.2 月， p=0.0068） ；但是两组的 OS 并没有显著的差异（52.6 月 vs 51.4 月，p=0.081） 20 PFS 。 是个短期预后指标，容易受到治疗疗程、治疗药物、患者身体状况、并发症等等其他 因素的影响，因此 PFS 作为预后的评价尚有一定的局限性，在 MM 的预后研究中， OS 仍然是不可或缺的研究指标。 本研究收集了大量 MM 患者的临床标本，进行间期 FISH 检测，了解中国人群中 MM 患者的染色体异常发生率，并将临床资料汇总，对 MM 患者的染色体异常情况 与临床特征， 包括治疗效果与预后进行了研究分析。 证实了中国人群 del17p13 发生率 略高，其余染色体异常的发生率与其他亚洲人群以及欧美人群比较，并没有显著的差 异。MM 患者的染色体异常与其就诊时各项临床特征都有明显的关联，且与患者化疗 的疗效有关。无染色体异常的患者，可获得更高的临床缓解率。硼替佐米能够改善染 色体异常患者的缓解率，尤其对 del13q14 的患者，能显著提高其 CR+VGPR 率。在 MM 初次化疗中如果能够获得更高的 CR+VGPR，对于提高 PFS、改善预后有积极的 作用。本研究亦证实了，染色体异常 del17p13、amp1q21、t(14;16)、del13q14，是 MM 患者的不良预后因素，可以作为在疾病早期对 MM 患者的预后进行推断的指标。参考文献1、Dewald GW, Kyle RA, Hicks GA, et al: The clinical significance of cytogenetic 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Haematologica. 2010; 95 : 1548-5436 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第二部分 cIg FISH 与 FISH 检测多发性骨髓瘤方法学比较MM 染色体异常对疾病进程、治疗反应、预后的重要意义已毋庸置疑。FISH 技 术可检测大量间期细胞，能够对染色体扩增、缺失、易位等等进行良好的识别，且具 有检测速度快、敏感性高等优势。FISH 检测 MM 染色体异常已经越来越多应用于临 床，但是 FISH 阳性率的检出依赖于骨髓穿刺术所获得的良好的浆细胞比例，为了更 准确的得知 MM 染色体异常的发生率，FISH 检测最好在克隆性浆细胞上进行。胞质 轻链免疫荧光原位杂交法（cIg FISH）是浆细胞确认方法之一。对于骨髓浆细胞比例 较低的患者，在 FISH 检测中同时识别浆细胞，分析浆细胞上的染色体异常，对此类 患者的染色体异常分析具有尤为突出的意义。材料和方法一、实验试剂 1、 AMCA 抗人 Lambda 轻链抗体 （AMCA Anti-human Lambda Chain， 货号 CI-3070） 购自美国 Vector 公司 2、AMCA 抗人 Kappa 轻链抗体（AMCA Anti-human Kappa Chain，货号 CI-3060） 购自美国 Vector 公司 3、MM FISH 检测试剂盒（MM FISH test kit，货号 F01003-02） ，购自北京金菩嘉医 疗科技有限公司。包括杂交缓冲液，DAPI 及以下探针：探针名称 RB1 1q21 检测位点 13q14 1q214、RPMI-1640 培养基，购自 Gibco 公司 5、4-壬基苯基-聚乙二醇， （Nonidet P-40，NP-40，octylphenoxypolyethoxyethanol） ， 购自 Sigma 公司。 6、1:15000 胃蛋白酶，购自武汉天傲公司37 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文7、无水乙醇，甲醇，冰醋酸，氯化钾，氯化钠，柠檬酸钠（国产分析纯） 。二、主要实验仪器 1、电子天平，美国 Mettler Toledo 公司 2、恒温水浴箱，上海新苗有限公司 3、电热恒温培养箱，上海新苗有限公司 4、水平离心机，湖南赛特湘仪公司 5、BX51 荧光显微镜，日本 Olympus 公司 6、ProgResMFcool 显微镜分析仪 7、净水机，美的公司 8、0.5-1000μ l 移液器，德国 Eppendoff 公司 9、-20 度及 4 度冰箱，容声电器有限公司三、主要实验试剂的配制 1、标准柠檬酸盐储存液：20×SSC 氯化钠 柠檬酸钠 去离子水 88g 44g 400ml充分溶解，用盐酸调节 pH 值至 5.3，去离子水定容至 500ml。 2、标准柠檬酸盐工作液：2×SSC 20×SSC（pH5.3） 100ml 去离子水 800ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0±0.2，去离子水定容至 1L。 3、各浓度乙醇溶液：70％乙醇：将 700ml 无水乙醇，用去离子水稀释至 1L；85％ 乙醇：将 850ml 无水乙醇，用去离子水稀释至 1L。 4、固定液： （甲醇：冰乙酸体积比 3：1） 量取 30ml 甲醇和 10ml 冰乙酸，充分混匀，使用前新鲜配制。38 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文5、0.1%NP-40/2×SSC 溶液 20×SSC（pH5.3） 40ml NP-40 去离子水 0.4ml 300ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0±0.2，去离子水定容至 400ml。 6、0.3％NP-40/0.4×SSC 溶液 20×SSC（pH5.3） 20ml NP-40 去离子水 3ml 950ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0-7.5，去离子水定容至 1L。 7、氯化钾低渗溶液（0.075 M KCl） KCl 去离子水 2.795g 300ml充分混匀，用去离子水定容至 500ml。 8、胃蛋白酶工作液： 1:15000 胃蛋白酶 10M HCL 去离子水 50μ l 50μ l 50ml四、实验方法与步骤 （一）病例收集：本院及宜昌中心医院 55 名 MM 患者，待患者知情同意后，采集新 鲜骨髓液及骨髓涂片标本。 （二）cIg FISH 操作步骤 1、骨髓涂片制备：取新鲜骨髓液 0.1ml 进行骨髓涂片，涂片时推片与载玻片呈 30° 角，轻压推片下缘散开，使骨髓展开并充满整个推片的宽度。良好的骨髓涂片厚 薄适宜，头、体、尾分明。 2、低渗：将玻片浸入 37℃ 预热的 0.075mol/L KCL 溶液进行低渗处理。39 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文3、 固定： 将玻片浸入甲醇 20 分钟， 取出玻片，浸入乙酸 5 分钟。 取出玻片， 浸入 70% 乙醇 3 分钟，室温下自然干燥。 4、消化：将玻片浸入 37℃ 预热的胃蛋白酶工作液中 20~30 分钟，直至涂片区域变透 明。 5、梯度脱水：将玻片置于 37℃ SSC 溶液中浸泡 30 分钟。室温下将玻片依次置于 2× 70%乙醇、85％乙醇和 100％乙醇中各 3 分钟脱水。自然干燥玻片。 6、所用探针 RB1、1q21（北京金菩嘉医疗科技有限公司） ，分别检测 13q14、1q21 位 点的异常。 室温下将如下液体加入到微量离心管中。 杂交缓冲液 7μl + 去离子水 1μl + 探针 2μl = 10μl 离心 1-3 秒，使探针混合液充分混匀。将 10?l 探针混合物滴加于玻片杂交区域， 立即加盖盖玻片，用 rubber cement 封片。共变性：76℃ ，5 分钟；杂交：置于预 热 42℃ 的湿盒，16 小时。 7、洗涤：将 0.3%NP-40/2× SSC 置于 73℃ 水浴箱中至少 30 分钟。轻轻移去盖玻片， 迅速将玻片置于 0.3% NP-40/0.4× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 2 分钟；取出玻 片，室温下将玻片浸入 0.1% NP-40/2× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 2 分钟；室 温下将玻片置于 70％乙醇中 3 分钟。 8、AMCA 复染：取 AMCA 抗人 Lambda7.5μl + RPIMμl = 15μl 加入微量离心 管中；将 15?l AMCA 混合液滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置 30 分钟。 9、洗涤：除去盖玻片，室温下将玻片置于 0.1% NP-40/2× SSC 中，振荡 1-3 秒，漂洗 1 分钟；室温下将玻片置于 70％乙醇中 3 分钟。暗处自然干燥玻片。 10、AMCA 再次复染：取 AMCA 抗人 Kappa 7.5μl + RPIMμl = 15μl 加入微量 离心管中；将 15?l AMCA 混合液滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处 放置 30 分钟。 11、样本 FISH 结果观察：首先在 10 倍物镜下，于 FISH 标本玻片上找到杂交区域； 然后在 40 倍物镜下扫描整个区域，观察信号的质量，满意的标本应是 75%以上40 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文细胞核中都有杂交信号； 100 倍物镜下观察细胞核的信号结果并进行信号分类 在 计数和比值计算。计数 100 个浆细胞，计算异常细胞所占的百分率。计数细胞必 须是各通道信号均清晰可辨的细胞。轮廓不清或重叠的不计数。杂交不均匀的区 域不计数。 12、建立阈值：健康人群 10 例设为对照组，制备玻片及进行 FISH 实验。每份样本 分析 100 个细胞，计算出显示异常信号的细胞数、百分比的平均值及标准差，异 常阈值定义为平均值+3 倍标准差。异常阈值=平均值（M）+3× 标准差（SD） 。 13、根据阈值判断结果：每例样本随机记数 100 个浆细胞，如果显示异常信号细胞比 例的检测值大于异常阈值， 判定为阳性结果； 如果显示异常信号细胞比例的检测 值小于异常阈值，判定为阴性结果。若细胞数太少或浆细胞比例太低，最少可计 数 20 个浆细胞，其中 15 个及以上细胞显示异常信号，可判定为阳性结果。 （三） FISH 操作步骤 1、标本采集。采新鲜骨髓液 3ml，0.3ml 肝素抗凝。 2、收集细胞：将骨髓液移至 15ml 离心管，1300rpm/min，5min；弃上清，吸管混匀 后缓缓加入 37℃ 预热的 0.075mol/L KCL 溶液至 8ml 进行低渗处理，继续用吸管 混匀后置 37℃ 水浴箱 30min，中间吹打混匀 1~2 次；加入 1ml 3:1 甲醇:冰醋酸固 定液进行预固定，吸管充分混匀；1300rpm/min 离心 5min，弃上清，缓缓加入 3:1 甲醇/冰醋酸固定液至 8ml，混匀，室温下静置 10min 进行固定；1300rpm/min 离 心 5min，去上清，缓缓加入 3:1 甲醇/冰醋酸固定液至 8ml，混匀，室温下静置 10min，1300rpm/min 离心 5min，弃上清，充分混匀后，再加入固定液至 2ml， 置-20℃ 冰箱冷藏，可随时取出供 FISH 检验。 3、FISH 玻片制片：取出细胞悬液，1300rpm/min 离心 5 分钟，去上清，按细胞数量 加入适量固定液，用吸管将细胞悬液轻轻吹打混匀后吸取少量，滴至干净的载玻 片上，自然晾干。 4、老化：室温放置过夜或 56℃ 烤片至少 60 分钟。玻片放入片盒中，室温干燥保存。 剩余标本置于-20℃ 冰箱备用。 5、将玻片置于 37℃ 2× SSC 溶液中浸泡 30 分钟。41 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文6、将玻片置于 37℃胃蛋白酶工作液中 10~15 分钟，直至滴片区域变透明。 7、室温下将玻片依次置于 70%乙醇、85％乙醇和 100％乙醇中各 3 分钟脱水。自然 干燥玻片。 8、 探针配制。 所用探针 RB1、 （北京金菩嘉医疗科技有限公司） 分别检测 13q14、 1q21 ， 1q21 位点的异常。 室温下将如下液体加入到微量离心管中。 杂交缓冲液 7μl + 去离子水 1μl + 探针 2μl = 10μl 离心 3 秒，使探针混合液充分混匀。将 10?l 探针混合物滴加于玻片杂交区域， 立即加盖盖玻片，用 rubber cement 封片。变性：76℃ ，5 分钟；杂交：置于 42℃ 预热的湿盒，16 小时。 9、洗涤程序：洗涤前将 0.3%NP-40/2× SSC 置于 73℃ 水浴箱中至少 30 分钟。轻轻移 去盖玻片，迅速将玻片置于 0.3% NP-40/0.4× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 2 分 钟；取出玻片，室温下将玻片浸入 0.1% NP-40/2× SSC 中，振荡 3 秒，漂洗 2 分 钟；室温下将玻片置于 70％乙醇中 3 分钟。 10、样本复染：暗处自然干燥玻片。将 10?l DAPI 复染剂滴加于杂交区域位置，立即 加上盖玻片。暗处放置 10-20 分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察 玻片。 11、样本 FISH 结果观察：首先在 10 倍物镜下，于 FISH 标本玻片上找到杂交区域； 然后在 40 倍物镜下扫描整个区域，观察信号的质量，满意的标本应是 75%以上 细胞核中都有杂交信号； 100 倍物镜下观察细胞核的信号结果并进行信号分类 在 计数和比值计算。计数 200 个细胞，计算异常信号细胞所占的百分率。结果分析 时随机计数骨髓样本细胞。计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞。细胞 核轮廓不清或有重叠的不计数。杂交不均匀的区域不计数。 12、建立阈值：健康人群 20 例设为对照组，制备玻片及进行 FISH 实验。每份样本 分析 200 个细胞，计算出显示异常信号的细胞数，百分比的平均值及标准差，异 常阈值定义为平均值+3 倍标准差。异常阈值=平均值（M）+3× 标准差（SD） 。 13、根据阈值判断结果：每例样本随机记数 200 个细胞，如果显示异常信号细胞比例42 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文的检测值大于异常阈值， 判定为阳性结果； 如果显示异常信号细胞比例的检测值 小于异常阈值，判定为阴性结果。 （三）统计学分析：采用 SPSS 17.0 软件进行统计学处理。检测阳性率的差异性比较 使用卡方检验。P 值小于 0.05 时认为有统计学意义。43 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文结果患者基本信息 本研究共采集 55 例 MM 患者骨髓标本，包括初治及经治病人。其中男性患者 35 名，女性患者 20 名，患者中位年龄为 57 岁。其浆细胞比例分布见表 1：表 1：患者浆细胞比例分布 临床特征 性别 男 女 骨髓浆细胞比例 &10% 10~30% 30~50% &50% 4 23 15 13 7.3 41.8 27.3 23.6 35 20 63.6 36.4 病例数目 百分比%cIg FISH 与 FISH 阳性检出率的比较 55 名 MM 患者中，cIg FISH 检出 del13q14 阳性率为 58.2%(32/55)，常规 FISH 检 出率为 41.8%(23/55)。在浆细胞比例&10%的患者中，cIg FISH 检出率为 50%(2/4)，常 规 FISH 未检出异常。 在浆细胞比例&30%的患者中， FISH 检出率为 51.9%(14/27)， cIg 常规 FISH 检出率为 22.2%(6/27)， 差异有统计学意义 （p=0.024）在浆细胞比例 30~50% 。 的患者中，cIg FISH 检出率与常规 FISH 检出率无统计学差异。而在浆细胞比例&50% 的患者中，两者的检出率相同。 （见图 1、表 2、表 3）表 2：55 名 MM 患者阳性率的检出 cIg FISH del13q14 amp1q21 58.2%(32/55) 52.7%(29/55) FISH 41.8%(23/55) 40.0%(22/55) 差异比较 p=0.086 p=0.18144 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文表 3：del13q14 检出率的比较 浆细胞比例 &10% &30% 30~50% &50% cIg FISH 50%(2/4) 51.9%(14/27) 60.0%(9/15) 69.2%(9/13) FISH 0 22.2%(6/27) 53.3%(8/15) 69.2%(9/13) 差异比较 p=0.024 P=0.713 -在 amp1q21 的检测中，cIg FISH 检出阳性率为 52.7%(29/55)，常规 FISH 检出率 为 40.0%(22/55)。在浆细胞比例&10%的患者中，cIg FISH 检出率为 75%(3/4)，常规 FISH 检出 1 例异常。在浆细胞比例&30%的患者中，cIg FISH 检出率为 55.6%(15/27)， 常规 FISH 检出率为 29.6%(8/27)（p=0.054） 。在浆细胞比例&30%的患者中，cIg FISH 检出率与常规 FISH 检出率相同。 （见图 1、表 2、表 4）表 4：amp1q21 检出率的比较 浆细胞比例 &10% &30% 30~50% &50% cIg FISH 75%(3/4) 55.6%(15/27) 53.3%(8/15) 46.2%(6/13) FISH 25%(1/4) 29.6%(8/27) 53.3%(8/15) 46.2%(6/13) 差异比较 p=0.054 -图 1：左图为 cIg FISH 检测 1q21 扩增，右图为 cIg FISH 检测 13q14 缺失。45 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文讨论多发性骨髓瘤（MM）是单克隆浆细胞的异常增殖性疾病。MM 患者的临床进程 呈现出很大的差异。大量遗传学的研究证明 MM 与其他血液系统恶性疾病一样，其 单克隆浆细胞存在多种复杂的染色体异常，对 MM 的诊治具有重要临床意义。1-4 现 代遗传学检测技术的发展大大提高了 MM 染色体异常的检出率，不仅为我们更深入 的了解 MM 的发病机理提供了更多的依据；同时也为临床对 MM 疾病的诊治提供了 支持。 MM 遗传学异常的研究经历了多个阶段： 对 从传统的 G 显带核型分析， FISH 到 检测、比较基因组杂交（CGH） 、单核苷酸多态性分析（SNP）等等。FISH 检测不仅 能够分析染色体的扩增和缺失，还能够检测出染色体的平衡易位，其针对性强，灵敏 度高，且操作简便、检测周期短，得以在临床上广泛推广。 FISH 检测中对阳性率的评价，通常是计数 100 个以上细胞，得出异常信号的细 胞比例，再同阈值比较判断阳性。对于骨髓浆细胞比例较低的 MM 患者，骨髓中大 量的非浆细胞有核细胞，包括中性粒细胞、淋巴细胞、晚幼红细胞等等，并不存在染 色体异常，若计数骨髓中的所有有核细胞，会大大降低异常信号细胞的比例，从而导 致假阴性的产生。因此，对浆细胞提纯或者确认，来单独计数浆细胞上染色体的异常 情况，对此类患者来说，可大大提高染色体异常的检出率。5 对浆细胞的确认，主要 有两种方法：CD138 磁珠分选和胞质轻链染色。本研究选取 cIg FISH 检测方法，通 过对浆细胞胞质中的免疫球蛋白轻链进行荧光染色， 从而识别浆细胞。 本研究证实了， 在浆细胞&30%的患者中，del13q14 的 cIg FISH 检出率为 51.9%(14/27)，常规 FISH 检 出率为 22.2%(6/27)，差异有统计学意义（p=0.024） 。amp1q21 的 cIg FISH 检出率为 55.6%(15/27)，常规 FISH 检出率为 29.6%(8/27)（p=0.054） 。后者并没有显示出明显 的统计学差异，相信与样本量不够大有关，虽然如此，亦体现出 cIg FISH 较高的检出 率。在浆细胞&30%的患者中，cIg FISH 与 FISH 检测的阳性率并没有明显的差异。 CD138 磁珠分选同样可以获得更高的染色体异常检出率。6,7 但磁珠分选并不能 区分正常浆细胞和克隆性浆细胞， 而对于某些表面不表达 CD138 的 MM 细胞亚群 （如 凋亡细胞） ，CD138 磁珠分选法亦无法识别。8 而且 CD138 分选需要对骨髓液中的浆 细胞进行富集，因此需要采集大量的骨髓液，这在实际临床操作中常常难以完成。cIg46 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文FISH 仅在骨髓涂片上完成，对骨髓液采集量要求不高，在临床工作中可操作性较强。 但 cIg FISH 也具有其局限性，尚没有文献报道 cIg FISH 对于不分泌型 MM 的浆细胞 确认，而且骨髓涂片中其他细胞含量高，处理步骤复杂，对于涂片质量不高、细胞重 叠的涂片无法进行检测。9 尽管两种浆细胞确认方式各有其优势劣势，但其检测出的 阳性率，并没有显著的差异。将两种方法结合使用，将会优劣互补。国外已有实验室 开展两种浆细胞确认方式同时进行，对 MM 的染色体异常检测，取得了满意的效果。参考文献1、Dewald G.W., Kyle R. 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[Epub ahead of print] 6、Avet-Loiseau H, Facon T, Grosbois B, et al: Oncogenesis of multiple myeloma: 14q32 and 13q chromosomal abnormalities are not randomly distributed, but correlate with47 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文natural history, immunological features, and clinical presentation. Blood. ): 、安刚, 李承文, 李倩等：免疫磁珠分选对荧光原位杂交检测多发性骨髓瘤细胞遗传 学异常的影响。中国实验血液学杂志，2011 ; 19( 1): 54- 58。 8、Jourdan M, Ferlin M, Legouffe E, et al: The myeloma cell antigen syndecan-1 is lost by apoptotic myeloma cells. Br J Haematol, : 637-646. 9、 Ahmann GJ, Jalal SM, Juneau AL, et al: A novel three-color, clone-specific fluorescence in situ hybridization procedure for monoclonal gammopathies. Cancer Genet Cytogenet, : 7-11.48 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第三部分 FISH 检测慢性淋巴细胞白血病分子遗传学 异常及其临床意义B 细胞慢性淋巴细胞白血病（B-CLL）是西方国家最多见的成年人血液恶性增殖 性疾病。在东方国家发病率较低。B-CLL 的病程呈现出多样性和复杂性，部分病人在 诊断初期即出现明显的临床症状，病情进展迅速；而部分患者在诊断后多年并无明显 的临床症状。因此，临床医生需要在疾病早期对病程进行合理推断，从而选择正确的 治疗策略。CLL 的预后因素主要有临床分期、分子细胞遗传学异常、免疫球蛋白重链 可变区基因突变、CD38 和 ZAP-70 的表达等。1-3 采用间期 FISH 技术，可发现 80% 的 CLL 患者存在染色体异常，其中常见的包括 del13q14、+12、del11q22、del17p13、 t(14q32)等。4-6 FISH 不仅可以帮助判断预后，还可以协助进行鉴别诊断。如套细胞淋 巴瘤（MCL）早期临床症状、细胞学特点与 CLL 类似，但 95%以上的 MCL 具有 IGH/CCND1 阳性的遗传学特点，故可以从而鉴别。7 本实验研究了 94 例在本院就诊 的 CLL 患者的染色体异常情况，并初步分析 CLL 患者染色体异常的临床意义。材料和方法一、实验试剂 1、肝素钠（Heparin Sodium）抗凝剂，2ml：12500 单位，购自南京新百有限公司。 2、4-壬基苯基-聚乙二醇， （Nonidet P-40，NP-40，octylphenoxypolyethoxyethanol） ， 购自 Sigma 公司。 3、IGH/CCND1 FISH 检测试剂盒（Vysis IGH/CCND1 Dual Color Dual Fusion Probes kit，货号 05J69-001） ，购自美国雅培公司。 包括：a. IGH/CCND1 双色融合探针 b. 杂交缓冲液 4、CLL FISH 检测试剂盒（货号 F01004-02） ，购自北京金菩嘉医疗科技有限公司。包 括杂交缓冲液，DAPI 及以下探针：49 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文探针名称 RB1 D13S25 ATM P53 CSP12 检测位点 13q14 13q14.3 11q22.3 17p13 12p11.1-q11.15、无水乙醇，甲醇，冰醋酸，氯化钾，氯化钠，柠檬酸钠（国产分析纯） 。二、主要实验仪器 1、电子天平，美国 Mettler Toledo 公司 2、恒温水浴箱，上海新苗有限公司 3、电热恒温培养箱，上海新苗有限公司 4、水平离心机，湖南赛特湘仪公司 5、BX51 荧光显微镜，日本 Olympus 公司 6、ProgResMFcool 显微镜分析仪 7、净水机，美的公司 8、0.5-1000μ l 移液器，德国 Eppendoff 公司 9、-20 度及 4 度冰箱，容声电器有限公司三、主要实验试剂的配制 1、标准柠檬酸盐储存液：20×SSC 氯化钠 柠檬酸钠 去离子水 88g 44g 400ml充分溶解，盐酸调节 pH 值至 5.3，去离子水定容至 500ml。 2、标准柠檬酸盐工作液：2×SSC50 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文20×SSC（pH5.3） 100ml 去离子水 800ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0±0.2，去离子水定容至 1L。 3、各浓度乙醇溶液：70％乙醇：700ml 无水乙醇，用去离子水稀释至 1L；85％乙 醇：850ml 无水乙醇，用去离子水稀释至 1L。 4、固定液： （甲醇：冰乙酸体积比 3：1） 量取 30ml 甲醇和 10ml 冰乙酸，充分混匀，使用前新鲜配制。 5、0.1%NP-40/2×SSC 溶液 20×SSC（pH5.3） 40ml NP-40 去离子水 0.4ml 300ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0±0.2，去离子水定容至 400ml。 6、0.3％NP-40/0.4×SSC 溶液 20×SSC（pH5.3） 20ml NP-40 去离子水 3ml 950ml充分混匀，用碳酸氢钠调节 pH 值至 7.0-7.5，去离子水定容至 1L。 7、低渗溶液（0.075 M KCl） KCl 去离子水 2.795g 300ml充分混匀，用去离子水定容至 500ml。四、实验方法与步骤 1、病例收集及分类：从 2008 年 3 月至 2011 年 12 月，在本院共有 94 名 CLL 患者纳 入研究。在获得患者知情同意之后，取外周血进行 FISH 检测。 2、标本采集。采新鲜外周血 2ml，0.3ml 肝素抗凝。 3、收集细胞：将血液移至尖底离心管，1300rpm/min，5min；弃上清，吸管混匀后缓51 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文缓加入 37℃ 预热的 0.075mol/L KCL 溶液至 8ml 进行低渗处理，继续用吸管混匀 后置 37℃ 水浴箱 15min，中间吹打混匀 1~2 次；加入 1ml 3:1 甲醇:冰醋酸固定液 进行预固定，吸管充分混匀；1300rpm/min 离心 5min，弃上清，缓缓加入 3:1 甲 醇/冰醋酸固定液至 8ml，混匀，室温下静置 10min 进行固定；1300rpm/min 离心 5min， 去上清， 缓缓加入 3:1 甲醇/冰醋酸固定液至 8ml， 混匀， 室温下静置 10min， 1300rpm/min 离心 5min，弃上清，充分混匀后，再加入固定液至 2ml，置-20℃ 冰 箱冷藏，可随时取出供 FISH 检验。 4、FISH 玻片制片：取出细胞悬液，1300rpm/min 离心 5 分钟，去上清，按细胞数量 加入适量固定液，用吸管将细胞悬液轻轻吹打混匀后吸取少量，滴至干净的载玻 片上，自然晾干。 5、老化：室温放置过夜或 56℃ 烤片至少 60 分钟。玻片放入片盒中，室温干燥保存。 剩余标本置于-20℃ 冰箱备用。 6、将玻片置于 37℃ 2× SSC 溶液中浸泡 30 分钟。室温下将玻片依次置于 70%乙醇、 85％乙醇和 100％乙醇中各 3 分钟脱水。自然干燥玻片。 7、探针配制。所用探针 RB1、D13S25、ATM、p53、CSP12（北京金菩嘉医疗科技有 限公司） ，分别检测 13q14、13q14.3、11q22、17p13、12 号染色体着丝粒位点的 异常。探针 IGH/CCND1(Vysis，美国雅培公司)检测 t(11;14)。 室温下将如下液体加入到微量离心管中。 杂交缓冲液 7μl + 去离子水 1μl + 探针 2μl = 10μl 离心 3 秒，使探针混合液充分混匀后。将 10?l 探针混合物滴加于玻片杂交区域， 立即加盖盖玻片，用 rubber cement 封片。共变性：76℃ 分钟，杂交：置于 42℃ ，5 预热的湿盒，16 小时。 8、洗涤程序：洗涤前将 0.3%NP-40/2× SSC 置于 73℃ 水浴箱中至少 30 分钟。轻轻移 去盖玻片，迅速将玻片浸入 0.3% NP-40/0.4× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 2 分 钟；室温下将玻片浸入 0.1% NP-40/2× SSC 溶液中，振荡 3 秒，漂洗 1 分钟；室 温下将玻片置于 70％乙醇溶液中 3 分钟。 9、样本复染：暗处自然干燥玻片。将 10?l DAPI 复染剂滴加于杂交区域位置，立即52 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文加上盖玻片}
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