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HBSA9(阳性)是什么意思?
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免疫途径及载体对乙肝病毒DNA疫苗免疫效果影响的研究
来源:中华微生物学和免疫学杂志 作者:风清扬
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摘要: 免疫途径及载体对乙肝病毒DNA疫苗免疫效果影响的研究
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 疫苗学
作者:袁正宏方昕郑玲洁姚忻何丽芳闻玉梅
单位:袁正宏(通讯作者)方昕郑玲洁姚忻何丽芳闻玉梅(200032 上海医科大学医学分子病毒学实验室)
关键词:乙肝病毒。疫苗。抗体特异性
【 摘要 】目的......
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免疫途径及载体对病毒DNA疫苗免疫效果影响的研究
中华学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 疫苗学
作者:袁正宏 方昕 郑玲洁 姚忻 何丽芳 闻玉梅
单位:袁正宏(通讯作者)方昕 郑玲洁 姚忻 何丽芳 闻玉梅(200032 上海医科大学医学分子病毒学实验室)
关键词:乙毒;疫苗;合成;接种方法;基因携带体;抗体特异性
  【 摘要 】 目的 探讨DNA载体结构及接种途径对DNA疫苗免疫效果的影响。方法 分别构建插入HBV表面抗原编码基因的表达载体pcDNA1.1/SA(无抗性基因)和pcDNAI/Amp/SA(含氨苄青霉素抗性基因),肌注小鼠后比较其诱生特异性免疫应答的能力;同时比较不同接种途径(肌内、皮内、皮肤划痕)及CpG免疫刺激元件(ISS)对DNA疫苗诱生免疫效果的影响。结果 pcDNAI/Amp/SA的免疫效果优于pcDNA1.1/SA。pcDNA1.1/SA的免疫效果可被ISS增强,而pcDNAI/Amp/SA诱生特异性免疫应答的能力则可被ISS抑制;诱生免疫应答的能力以肌内注射最强,皮内注射免疫其次,皮下划痕法较弱。结论 不同HBsAg表达载体诱生免疫应答的能力不尽相同;CpG免疫刺激元件在决定DNA疫苗免疫原性中起重要作用,可增强不含相应结构DNA疫苗的免疫效果;皮内注射可诱发与肌内接种相似的免疫应答,是一种简便、有效的免疫接种途径。
  HBV DNA vaccine immunization the effects of DNA vector constructs and routes of gene delivery on the induction of antiviral immunity YUAN Zhenghong, FANG Xin, ZHENG Lingjie, et al. Department of Molecular Virology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
     【 Abstract 】 Objective To investigate the effects of DNA vector structure and different routes of administration on the efficiency of induction of immune responses to the HBV surface antigen (HBsAg) in mice by DNA immunization.Methods DNA vectors that contained or did not contain amplicilin resistance gene (pcDNAI/Amp, pcDNA1.1) were engineered to contain HBsAg encoding gene fragments. The efficiencies of these vector constructs to prime antibody responses were compared in mice by detection of serum HBsAg-specific antibody titers after intramuscular immunization. The effects of CpG motifs and routes of administration (intramuscular, intradermal and skin abrasion) on the immunogenicity of DNA vaccines were also studied.Results Recombinant vector pcDNAI/Amp/SA that contained ampicilin selection gene stimulated significantly higher levels of HBsAg-specific serum antibody after intramuscular DNA injection than the pcDNA1.1/SA vector which did not contain antibiotics resistance gene. The immunogenicity of pcDNA1.1/SA was increased by coadministrating CpG-containing oligos while that of pcDNAI/Amp/SA was reduced. Both intradermal gene administration and intramuscular injection could induce strong antibody responses, while skin abrasion could not. Conclusion 1.Different vector constructs induced different levels 2. CpG motifs present in ampicilin resistance gene play an important role in the immunogenicity of DNA 3. Compared with intramuscular injection, intradermal adminstration was an simple and efficient way for application of DNA vaccines.
  【 Subject words 】 Hepatitis B virus  DNA vaccine  Vector construct  Gene delivery  Immune response
  DNA疫苗是近年来免疫学和疫苗研究领域中的一个热点。由于它能克服传统疫苗的缺陷,制备简单,同时诱发持久的特异性细胞及体液免疫应答,并可兼作预防和治疗性疫苗,是未来新型疫苗的发展方向,在病毒性疾病和等的防治中有广阔的应用前景〔1〕。Davis和Whalen等〔2〕把这一新技术应用于乙型肝炎病毒的研究,他们把含乙肝病毒表面抗原(HBsAg)编码基因的表达质粒通过肌内注射免疫小鼠,成功地诱发了针对HBsAg的细胞和体液免疫。Mancini等〔3〕在有HBV复制的转基因小鼠中发现,肌注HBV DNA疫苗可逆转小鼠对HBV的免疫耐受,诱导产生抗HBsAg的抗体,清除血液中游离病毒,并抑制肝内HBV的复制。这提示DNA疫苗有可能成为防治乙肝的一条新途径。
  然而,要使DNA疫苗从动物实验转为使用,尚有许多工作要做。这是因为:1)对DNA疫苗的免疫机制还远未了解;2)DNA疫苗的效率有待加强,接种途径需进一步简化;3)DNA疫苗的安全性(主要涉及载体结构)尚待进一步确认。
  为深入探讨应用DNA疫苗防治乙肝病毒感染的可能性,构建具有高度免疫原性,安全的可在人体内使用的DNA疫苗用载体,简化DNA疫苗接种途径,本研究比较了不同HBsAg表达载体pcDNA1.1/SA(无抗性基因)、pcDNAI/Amp/SA(含氨苄青霉素抗性基因)的免疫效果及不同接种途径(肌内、皮内、皮肤划痕)对DNA疫苗诱生免疫效果的影响。同时,研究了CpG免疫刺激元件对DNA疫苗的作用。初步研究结果表明,不同HBsAg表达载体诱生免疫应答的能力不尽相同;CpG免疫刺激元件在决定DNA疫苗免疫原性中起重要作用,可增强不含相应结构DNA疫苗的免疫效果;皮内注射可诱发与肌内接种相似的免疫应答,是一种简便、有效的免疫接种途径。
  材料与方法
  1.质粒、菌株及试剂:质粒pcDNA1.1、pcDNAI/Amp购自Invitrogen公司。菌株DH5α来自Gibco BRL公司,用于pcDNAI/Amp质粒的构建及扩增;菌株MC1061/P3购自Invitrogen公司,用于pcDNA1.1质粒的构建及扩增(MC1061/P3具有卡那霉素抗性,但对四环素和氨苄青霉素敏感;经pcDNA1.1转化后MC1061/P3转对四环素和氨苄青霉素抗性,以此进行筛选)。
  各种工具酶及试剂分别购自Boehringer Mannhein、Promega、Qiagen、Gibco BRL、华美和华顺生物试剂公司。检测HBsAg和鼠抗HBsAg抗体试剂盒由上海市传染病医院肝炎免疫室提供。
  2.DNA重组及质粒大量制备:以pADR〔4〕(含我国adr型HBV基因,由中科院上海生化所提供)为模板,PCR扩增获得目的基因(含HBsAg编码基因及HBV polyA信号,1.8引物序列为:正引物5'-ATGAATTCATGGAGAACATCACA-3',反引物5'-ATGAATTCAAGAAGTCAGAAGGC-3')。HBsAg真核细胞表达载体的构建按文献〔5〕进行。DNA免疫用质粒均采用Qiagen Plasmid Maxi Kit制备及纯化,溶于生理盐水。
  3.含免疫刺激元件寡核苷酸(ISS)的设计及合成:ISS按CpG两侧分别有两嘌呤及两嘧啶相邻设计,序列为5'CCGAACGTTCGGGC3';同时设计一无关序列为对照:5'GAAGTTTCCTGTGTGTACCC3'。寡核苷酸由中科院生物工程中心合成。
  4.HBsAg重组载体在细胞内的表达情况:按本室常规采用磷酸钙沉淀法将HBsAg重组转染人细胞HepG2。HepG2细胞在转染前24小时以106/皿接种于55mm培养皿,转染4小时前换液。每平皿内加入由10μg质粒DNA、500μl 1×HeBS、31μl 2mol/L CaCl2组成的混合物。每种重组载体转染两平皿,并用空载体为对照。实验中同时采用SEAP(分泌性碱性磷酸酶)报告基因pBC12/CMV/SEAP共转染HepG2细胞,以作为转染效率的内参〔7〕。
  5.实验动物和动物免疫:BALB/c小鼠购自上海医科大学实验动物部,为6~8周龄雌性小鼠。小鼠用戊巴比妥钠(75mg/kg)麻醉后,分三种途径免疫。A.肌内注射:用1ml注射器于双侧胫前肌处进针,缓慢注入质粒DNA溶液(每侧50μl/20μg);B.皮内注射:在离鼠尾根部5~10mm处,注入质粒DNA溶液(40μg/50μl);C.皮上划痕:在小鼠背部皮肤造成创伤后,涂布40μg质粒DNA。每实验组注射4只小鼠。
  6.鼠抗HBsAg抗体(HBsAb)检测:免疫后定期从尾部采血,分离血清,-20℃保存。一并用ELISA法检测鼠抗HBsAg抗体。每小鼠血清分双孔测定,操作按说明书进行,492nm检测吸光度(A)值。实验测定值取组内小鼠(4只/组)测定值的均值。
  7.统计处理:采用两样本均数比较的t。
  结 果
  1.插入我国adr型HBV S基因的真核细胞表达质粒载体的构建:通过PCR、酶切、基因重组等技术分别构建了插入我国adr型HBV表面抗原编码基因加HBV polyA信号的重组载体pcDNA1.1/SA、pcDNAI/Amp/SA,测序确认插入方向和编码框架。两表达载体的结构仅在抗性基因上存在差异(图1),pcDNA1.1/SA无抗性基因,pcDNAI/Amp/SA含氨苄青霉素抗性基因。
  图1 乙肝病毒表面抗原真核细胞表达载体结构示意图
  Fig 1. Construction of HBsAg expression vectors
  2.HBsAg重组载体在HepG2细胞内的表达情况:质粒DNA转染HepG2细胞72小时后收集培养上清,ELISA测定培养上清中HBsAg的表达,取平行两皿测定值的均值。同时用SEAP测定值调整各平皿的转染效率以使HBsAg测定值具有可比性。结果发现,重组载体pcDNA1.1/SA、pcDNAI/Amp/SA均可在HepG2细胞中表达HBsAg,两者的表达水平相近(图2)〔培养上清1∶10稀释后的HBsAg测定值(A)分别为:pcDNA1.1/SA 0.745±0.054;pcDNAI/Amp/SA 0.825±0.1209,P>0.05〕。空载体转染组的测定值为0.115±0.0558。
图2 重组载体在HepG2细胞内短暂表达HBsAg
  Fig 2. Transient expression of HBsAg in HepG2 cells transfected with HBsAg vectors
  3.不同载体诱生免疫应答能力和免疫刺激元件对其免疫作用的影响:将pcDNA1.1/SA和pcDNAI/Amp/SA分别肌内注射免疫BALB/c小鼠,同时设立添加无关序列和ISS组以观察免疫刺激元件对其免疫作用的影响。每实验组为4只小鼠,质粒DNA为40μg/小鼠,寡核苷酸的用量为10μg/鼠。免疫2月后采血,ELISA法测抗HBs-IgG。结果显示,pcDNA1.1/SA单独、pcDNA1.1/SA加无关序列、pcDNA1.1/SA加ISS、pcDNAI/Amp/SA单独、pcDNAI/Amp/SA加ISS免疫小鼠后诱生的抗HBs-IgG ELISA测定值(血清1∶50稀释,A)分别为0.397±0.±0.079,0.661±0.±0.±0.1823(图3)。以上结果提示,pcDNAI/Amp/SA的免疫效果优于pcDNA1.1/SA(P<0.01),pcDNA1.1/SA的免疫效果可被ISS增强(P<0.05),而pcDNAI/Amp/SA诱生特异性免疫应答的能力则可被ISS抑制(P<0.01)。
图3 不同载体诱生免疫应答能力及CpG元件的影响
  Fig 3. Effect of CpG-containing oligos on the production of anti-HBs in mice induced by intramuscular injections of two HBV DNA vaccines
  4.不同注射途径免疫效果的比较:用40μg pcDNAI/Amp/SA分别经胫前肌内注射、皮内注射、皮上划痕法免疫BALB/c小鼠。每实验组采用4只小鼠,免疫2个月后尾部采血,ELISA法检测抗HBs-IgG。结果显示,肌内注射在三种途径中免疫效果最好,皮内注射免疫效果其次,皮上划痕法免疫效果较弱(图4),其诱生的抗HBs-IgG ELISA测定值(血清1∶50稀释,A值)分别为0.761±0.±0.±0.0973。
图4 乙肝DNA疫苗经不同途径接种诱生免疫效果的比较
  Fig 4. Effect of gene delivery routes on production of anti-HBs in mice induced by genetic immunizations of HBV DNA vaccines
  IM:ID:SA:skin abrasion
  讨 论
  1992年Tang等〔1〕根据将含有编码人生长激素基因的质粒接种小鼠后可诱发小鼠产生抗人生长激素抗体的结果,提出基因免疫(genetic immuniza-tion)或核酸免疫(nucleic acid immunization)这个概念。几年来,人们纷纷将编码不同病原基因的表达载体接种到不同动物体内,发现均可诱发特异的体液及细胞免疫应答〔2,3〕。本研究结果(图3,4)表明,利用我国adr型HBV S基因构建的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)表达质粒接种小鼠后,亦可成功地诱生HBsAg特异的体液免疫应答。
  DNA疫苗接种多采用肌内注射,但近来有人提出皮肤具有更大的优势〔8〕。皮肤是免疫优势器官,含有许多参与免疫反应的细胞如皮肤朗罕氏细胞、嗜表皮淋巴细胞、树突细胞和皮肤巨噬细胞等;此外,皮肤相关的淋巴组织能产生许多可加强免疫反应的细胞因子。采用基因枪将包被于金颗粒表面的质粒DNA射入表皮细胞已证实为最有效的接种途径即是例证之一,但存在需特殊设备、难于推广等缺陷。Raz等〔8〕报道,直接给小鼠经皮内注射编码病毒核蛋白基因的质粒DNA,可诱生能持续大于68~70周的抗核蛋白特异性抗体和CTL。本研究结果4显示,皮内注射亦能诱发相当强的免疫应答,进一步提示皮内直接注射DNA疫苗可诱生特异性免疫应答。而皮上划痕法效果较差,可能与操作中DNA量不易控制有关。如能进一步证实皮内直接接种可诱发持久有效的保护性免疫应答,则有可能通过皮内或皮下注射等常规途径进行DNA疫苗接种,使DNA疫苗更易于被接受和推广。
  DNA疫苗接种实质上是将外源DNA引入宿主细胞,其安全性不容忽视。除形成抗DNA抗体、抗原持续表达引起耐受以及导致宿主细胞恶性转化等可能性外,人们亦开始关注质粒DNA中残留微量抗生素对人体的潜在有害作用。美国FDA已规定,应用于人体的质粒DNA疫苗不应含有氨基甙类抗生素(如氨苄青霉素)抗性基因,他们推荐使用含卡那霉素和新霉素等抗性基因的表达载体。然而Sato等〔9〕发现,由于卡那霉素等抗性基因中不含有在氨苄青霉素抗性基因中存在的CpG免疫刺激元件(ISS),用相应载体构建的DNA疫苗免疫原性弱。免疫刺激元件(ISS)实际是一段含有CpG,两侧分别为两个嘌呤和两个嘧啶的特定核苷酸序列,如5'-GACGTC-3';5'AGCGCT-3';5'AACGTT-3'。已证明,ISS能在体外诱导细胞产生大量α、β干扰素、白细胞介素-12等细胞因子〔10〕。为提高DNA疫苗免疫效果,组建能在人体内使用的DNA疫苗用载体,本研究根据文献报道设计、合成了含有多个CpG序列的寡核苷酸,并观察了其对不同质粒载体免疫作用的影响,得到了与Sato等〔9〕相似结果;带有氨苄抗性的pcDNAI/Amp/SA在细胞内表达HBsAg的水平虽与无氨苄抗性的pcDNA1.1/SA相似,诱导小鼠产生抗体的水平却明显高于pcDNA1.1/SA;含有多个CpG元件的寡核苷酸可增强pcDNA1.1/SA诱生抗体的水平(图2,3,4)。本研究亦发现,ISS序列有抑制pcDNAI/Amp/SA免疫效果的作用,可能为该核苷酸与pcDNAI/Amp中相应序列互补,从而抑制基因的复制、转录或翻译,这进一步说明ISS序列在DNA疫苗中的关键作用。对ISS的进一步研究将有助于研制无抗性基因或含有其它抗性基因、同时又保证其免疫效果的DNA疫苗用载体。
  本工作受863课题(编号:863-102-07-01-04)及博士点基金(编号:95054)资助
  参考文献
  [1] Tang DC,Devit M,Johnston SA,et al.Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response.Nature,2-154.
  [2] Davis HL,Mancini M,Whalen RG,et al.DNA-mediated immunization to hepatitis B surface antigen:longevity of primary response and effect of boost.Vaccine,0-915.
  [3] Mancini M,Hadchouel M,Michel ML,et al.DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state.PNA Sci USA,496-12501.
  [4] Gan RB,Cu MJ,Li ZP,et al.The complete nucleotide sequence of the cloned DNA of hepatitis B virus subtype adr in pADR-1.Sci Sin 〔B〕,)∶507-521.
  [5] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbour Laboratory Press,NY,1989.
  [6] 袁正宏,何丽芳,赵苏伶,等.反义寡聚脱氧核苷酸(ODN)衍生物抑制乙肝病毒抗原表达的研究.中国病毒学,)∶34-40.
  [7] Berger J,Hauber J,Cullen BR,et al.Secreted placental alkaline phosphatase:a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells.Gene,)∶1-10.
  [8] Raz E,Carson DA,Rhodes GH,et al.Intradermal gene immunization:the possible role of DNA uptake in the induction of cellular immunity to viruses.PNA Sci USA,19-9523.
  [9] Sato Y,Roman M,Raz E,et al.Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization.Science,2-354.
  [10] Klinman DM,Yi AK,Krieg AM,et al.CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6,interleukin 12,and interferon gamma.PNA Sci USA,79-2883.
(收稿:  修回:)
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1.1 课程设计的设计内容
设计带式运输机的传动机构,其传动转动装置图如下图-1 所示。
图 1.1 带式运输机的传动装置
1.2 原始数据
带 圆周力 F/N 6850 带速 v(m/s) 0.7 滚筒直径 D/mm 340
1.3 工作条件
带式输送机在常温下连续工作、 单向运转; 空载起动, 工作载荷有轻微冲击; 输送带工作速度 V 的允许误差为±5%;二班制(每天工作 8h),要求减速器设计 寿命为 8 年,大修期为 2-3 年,中批量生产;三相交流电源的电压为 390、220V。
第二章 传动方案的选择
带式运输机的传动方案如下图所示
图 2-1 两级圆柱齿器 1-电动机;2-联轴器;3 两级圆柱齿轮减速器;4-滚筒;5-输送带
采用二级圆柱齿轮传动,结构尺寸小,齿轮传动效率高,传动平稳,适合于 较差环境下长期工作,考虑到以上原因所以选择此传动方案
第三章 原动机的选择
3.1 选择电动机的类型
按按照设计要求以及工作条件, 选用一般 Y 型全封闭自扇冷式笼型三相异步 电动机,电压为 380V。
3.2 选择电动机的容量
3.2.1 工作机所需的有效功率
Pw ? Fv 6850 ? 0.7 ? ? 4.795 KW
式中: Pw —工作机所需的有效功率(KW)
F —带的圆周力(N)
v—带的工作速度(m/s)
3.2.2 电动机的输出功率
Pd ? Pw (KW )
式中:η 为传动系统的总效率,按下式计算
2 ? ? ?14?2?32?4
? 0.984 ? 0.99 2 ? 0.97 2 ? 0.96
其中,根据文献【2】中表 3-3(按一般齿轮传动查得) η 1——一对滚动轴承效率,η 1=0.98 η 2——联轴器的效率,η 2=0.99 η 3——闭式圆柱齿轮的传动效率,η 3=0.97 η 4——运输机滚筒的效率,η 4=0.96 故
4.795 ? 5.88 KW 0.816
因载荷平稳,电动机的功率稍大于 Pd 即可,根据文献【2】中表 12-1 所示 Y 系列三相异步电动机的技术参数,可选择电动机的额定功率 Pe=7.5KW。 .
3.3 确定电动机的转速
根据已知条件,可得输送机滚筒的工作转速 nw 为 60000 v 60000 ? 0.7 nw ? ? ? 39.34( r / m i n ) ?D 3.14 ? 340 按照传动比的合理范围, 【2】 3-4 可知, 查 表 单级圆柱齿轮传动比 i 齿=3~5, 则总传动比的范围 i=9~25. 故电动机的转速的可选范围为
nm ? i ? nw ? 354 .06 ~ 983.5(r/mi n)
符合这一范围的同步转速的只有 750r/min,再由 3.2 中的电动机的额定功 率 Pe=7.5kw,可根据文献【2】中表 12-1 查得,可选取 Y160L-8 型号的电动机, 其数据列于表 3-1 中。 额定功率 kw 7.5 满载转速 r/min 715 表 3.1 电动机数据 电流/A 堵转转矩 最大转矩 额定转矩 额定转矩 17.7 2.0 2.0 堵转电流 额定电流 5.5
第四章 确定总传动比及分配各级传动比
4.1 传动装置的总传动比,
i? nm 715 ? ? 18 .17 nw 39 .34
式中:i —总传动比
nm —电动机的满载转速(r/min)
4.2 分配传动比
由传动系统方案知: i01 ? 1
计算得两级圆柱齿轮减速器的总传动比 i? 为:
i? ? i12 ? i23 ? i ? 18.17 i01 ? i34
为了便于两级圆柱齿轮减速器采用浸油润滑,当两级齿轮的材料相同,齿面 硬度 HBS≤350,齿面系数相等时,考虑齿面接触强度接近相等的条件,取高速 急传动比为
i12 ? 1.3i? ? 1.3 ? 18.17 ? 4.86
低速级传动比为 i23 ?
i? ? 3.74 i12
则传动系统各级传动比分别为:
i12 ? 4.86
i23 ? 3.74
第五章 传动装置运动和动力参数的计算
0 轴(电动机轴)
n0 ? nm ? 715( r / min) P0 ? Pd ? 7.5kW
P0 7.5 ? 9550 ? ? 100 .17( N ? m) n0 715
Ⅰ轴(减速器高速轴)
n1 ? n0 715 ? ? 715( r / min) i01 1
P ? P 0 ?01 ? 7.5 ? 0.99 ? 7.425(kW ) 1
P 7.425 1 ? 9550 ? ? 99.17( N ? m) n1 715
Ⅱ轴(减速器中间轴)
n2 ? n1 715 ? ? 147 .12 ( r / min) i12 4.86
P2 ? P?12 ? 7.425 ? 0.97 ? 7.20(kW) 1
T2 ? 9550 ? P2 7.20 ? 9550 ? ? 467 .38( N ? m) n2 147 .12
Ⅲ轴(减速器低速轴)
n3 ? n2 147 .12 ? ? 39.34 ( r / min) i23 3.74
P3 ? P2?23 ? 7.20 ? 0.97 ? 6.984 (kW )
T3 ? 9550 ?
P3 6.984 ? 9550 ? ? 1695 .40( N ? m) n3 39.34
Ⅳ轴(输送机滚筒轴)
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