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两步酶消化法分离培养大鼠触须毛囊上皮细胞
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&& 文章详情
C/EBPs在不同发育阶段人毛囊-皮脂腺单位中的表达与意义
作者：郑业华 杨 恬 高强国
【关键词】& 毛囊-皮脂腺单位
&&&&&& 【摘要】 目的 寻找不同发育阶段人毛囊-皮脂腺单位中C/EBPα和C/EBPβ的表达变化规律及与毛囊皮脂腺分化的关系。方法 应用免疫组化方法检测胚胎及新生儿和成人毛囊皮脂腺组织中C/EBPα和C/EBPβ的定位及表达。结果 C/EBPα和C/EBPβ分别在胚胎期毛囊外根鞘，毛乳头，毛母质及皮脂腺细胞的胞核内强表达;新生儿毛囊峡部下端外根鞘基底层细胞的胞核内也存在强表达，基底内层胞核阳性信号逐渐减弱;而成体毛囊核内阳性信号仅定位于峡部下端外根鞘基底层及皮脂腺基底层。毛囊外根鞘内层细胞随分化程度升高，胞浆内C/EBPα和C/EBPβ的表达逐渐升高，毛乳头细胞则未见阳性颗粒。在整个毛囊皮脂腺发育过程中C/EBPα的表达都略强于C/EBPβ。结论 C/EBPα和C/EBPβ在不同发育阶段的毛囊皮脂腺单位中均有表达，定位及表达水平与分化程度密切相关。
　　关键词 毛囊-皮脂腺单位 C/EBPs 分化
　　Characteristics of C/EBPs protein expressions in the pilo-sebaceous unit& of human at different developmental stage and 　　their biological significance&
　　Zheng Yehua，Yang Tian，Gao Qiangguo
&&&& Department of Cell Biology，Third Military Medical University，Chongqing400038.
&&& 【Abstract】 Objective To study the expression of C/EBPαand C/EBPβprotein in human piol-sebaceous uˉnit during different developmental stage.Methods C/EBPαand C/EBPβprotein expressions were studied by using immunohistochemical method.Results C/EBPαand C/EBPβexpressed differently in the outer root sheath，follicular papilla，hair matrix and sebaceous gland in embryonic period.The positive signals were chiefly distributed in the nucleˉuses.The expression of C/EBPαand C/EBPβwere found in the basal cell layer of outer root sheath and sebaceous gland in the new born and maturation phase，The expression in nucleuses of outer root sheat cells decreased with the differentiation but enhanced oppositely in the cytoplasm.Ngetive stain was in the follicular papilla.Conclusion They are expressions of C/EBPαand C/EBPβprotein in human pilo-sebaceous unit at different stage.The expression level is closely correlated with the differentiation degree.This indicates that C/EBPs play important roles in the development of human pilo-sebaceous unit.Key words human pilo-sebaceous unit C/EBPs differentiation&&
　　C/EBPs蛋白是一组耐热的转录调控因子，能与启动子CCAAT区及多种病毒增强子结合，在细胞增殖、分化、信号转导及肿瘤发生、免疫反应、能量代谢等方面发挥重要作用。有实验表明C/EBP家族在细胞分化，炎症反应及基因调控中扮演了关键角色 ［1］& 。C/EBPs存在于表皮中，与角质形成细胞分化及生长停滞有关 ［2］& 。但它们与毛囊皮脂腺的关系却很少提到。我们检测了C/EBPα、C/EBPβ在人不同发育时期的毛囊皮脂腺单位中的分布与表达，探讨其与人毛囊皮脂腺单位生长发育的关系。
　　1 材料和方法
&&& 1.1 材料 人胚胎（12～17周胎龄）、新生儿及成人正常头皮标本各5例，取自西南医院。标本去除皮下组织后立即用4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脱水后切片备用。
&&& 1.2 主要试剂 免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中山生物试剂公司，兔抗人C/EBPα和C/EBPβ单克隆抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品。
&&& 1.3 免疫组织化学 标本在冰冻切片仪上连续切片，片厚8μm，载于多聚赖氨酸包被的玻片上，冰冻切片完全烘干后，1%H 2 O 2 甲醇封闭内源性过氧化物酶30min后依次加入正常工作血清15min，一抗（1:100，4℃过夜），二抗，S-P/HRP复合物，上述步骤间均以PBS缓冲液振洗3次，5min/次，DAB显色，常规脱水，透明，中性树脂封片，倒置显微镜观察。
&&& 1.4 结果判定 在400倍光镜下观察免疫组化结果，随机选取5个视野，每个视野均观察100个细胞，C/EBPα标记定位于细胞核和（或）浆内，呈棕黄色颗粒或均匀黄染。阳性判定标准按着色深度和范围分:强阳性（+++），阳性细胞数>70%;中度阳性（++），阳性细胞数占30%～70%;轻度阳性（+），阳性细胞数占10%～30%;阴性（-），未见细胞着色。C/EBPβ阳性判定标准同C/EBPα。
&&& 2 结果
　　在胚胎期（embryo，E）毛囊包括bulge区、外根鞘（outer root sheath，ORS）、毛球部（hari bulb）及皮脂腺（sebaceous gland，SG）中都存在强烈的C/EBPα与C/EBPβ的表达，阳性信号主要定位于外根鞘角质形成细胞、毛母质（hair matrix，HM）细胞、毛乳头（dermal papilla，DP）细胞及皮脂腺细胞的胞核内。C/EBPα在新生儿（neonate，N）的毛囊主要表达在峡部下端外根鞘基底层细胞的胞核中，且在外根鞘内层细胞中核内阳性信号随细胞分化程度升高而减弱，毛乳头与毛母质细胞均呈中度阳性，同时皮脂腺细胞也存在C/EBPα强表达特别是其基底层细胞的胞核;C/EBPβ在毛球部表达呈弱阳性，在外根鞘呈中度阳性且主要表达在其基底层（图 1、2）。在成人（adult，A）毛囊E/EBPα与E/EBPβ的表达明显 减弱，阳性信号主要分布在毛囊峡部外根鞘角质形成细胞及毛球部的毛母质细胞的胞浆内，毛乳头细胞为阴性，皮脂腺基底层细胞的胞核呈强表达，同时在毛囊内层的胞浆表达量随细胞分化程度升高而增强（图3）。在整个毛囊发育过程中C/EBPα的表达都略强于C/EBPβ。ORS、HM、DP、SG胞核和胞浆中的表达程度见表1和表2。表1 C/EBPs在毛囊皮脂腺单位各类型细胞胞核中的表达(略）
　　3 讨论
　　C/EBP即CCAAT/增强子结合蛋白，得名于其具有激活特定基因DNA增强子CCAAT重复序列的功能，这种转录因子共有7种亚型α、β、δ、γCRP1等，它们的分子结构中含有一个碱性转录激活区和一个亮氨基酸拉链模体，可形成同源或异源二聚体，通过DNA结合区结合于靶基因的调控元件。C/EBPs以组织和阶段特异性方式表达，调控大量组织中的细胞分化，如肝、脂肪组织、血管细胞、内分泌腺。近来，有实验发现C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ在表皮中表达参与角质形成细胞分化和生长抑制，在表皮角阮细胞中C/EBPα和C/EBPβ能下调分化标记蛋白;外壳蛋白、角蛋白1和10的表达 ［3］& 。还有实验证明C/EBPα和C/EBPβ在鼠的生长期毛囊的内、外根鞘、皮脂腺、bulge区，真皮乳头和毛母质细胞中均有表达 ［4］& ，说明它们参与了角质形成细胞的终末分化并调控毛发周期中重要基因的表达。在本实验中我们通过免疫组化研究了C/EBPα、C/EBPβ在人不同发育阶段的特异表达，了解其与人毛囊皮脂腺生长分化的关系。我们的实验结果发现C/EBPα和C/EBPβ在胚胎期毛囊发育阶段突出表达在bulge区（毛囊干细胞聚集区），外根鞘，毛乳头及皮脂腺细胞的胞核内，说明在毛囊上皮分化过程中基因的表达调控可能有C/EBP的参与，根据既往实验发现它们可能通过细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p21（wafl/cipl）起作用 ［5］& ，p21（wafl/cipl）的表达能引起细胞周期G1期阻滞，促进细胞分化成熟。在p21上游存在有转录因子C/EBPα和C/EBPβ的DNA结合区，它们可能通过与p21结合，调节p21基因的表达，从而导致毛囊上皮细胞分化。同时我们的实验还发现在成体毛囊峡部以下球部以上外根&&& 鞘角质形成细胞的胞核内C/EBP的表达较强，有文献报道 此处细胞表达上皮干细胞的标志蛋白K19，从而提出此处是除立毛肌附着处外另一个干细胞储蓄库 ［6］& 。C/EBP在此处的表达进一步证实，C/EBP在低分化细胞的胞核内作用，激活转录使细胞停止增殖，转向分化。我们还发现随着毛囊外根鞘细胞逐渐分化，核内C/EBP表达水平逐渐减弱，胞内C/EBP表达水平逐渐增强，这也进一步证实了以前一些研究发现;C/EBP在维持细胞分化状态中起着重要作用。另外，我们发现C/EBPα、C/EBPβ在皮脂腺腺体边缘细胞的胞核中强表达。C/EBPα、C/EBPβ是控制脂肪细胞分化和脂质形成的重要因子，如果我们假设皮脂腺细胞分化和脂质形成的机制与脂肪细胞相似 ［7］& 。那么C/EBPα、C/EBPβ也可能是调控皮脂腺细胞分化和脂质新陈代谢的重要因子。C/EBP蛋白对基因转录的调控是多层次、多因子、有一定时空次序的复杂精细调控，它们在毛囊皮脂腺分化过程中的作用研究仍然停留在初级阶段，它们与哪些因子协同作用?通过何种信号途径实现细胞间对话，调控毛囊皮脂腺中的基因转录?这些问题仍有待于进一步研究。（本文图片见封三）
　　参考文献
&&&& 1 Lekstrom-Himes J，Xanthopoulos KG.Biological role of the CCAAT/enhancer binding protein family of transcription factors.J Biol Chem，545-28548.
&&& 2 Maytin EV，Habener JF.Transcription factors C/EBPa，C/EBPb and CHOP（Gadd153）expressed during the differentiation program of kerˉatinocytes in vitro and in vivo.J Invest Dermatol，8-246.
　　3 Zhu S，Oh H-S，Shim M，et al.C/EBPb modulates the early events of keratinocyte differentiation involving growth arrest and keratin1and kerˉatin10expression.Mol Cell Biol，1-7190.
　　4 Bull JJ，Muller-Rover S，Chronnell CM.Contrasting expression patterns of CCAAT/enhancer-binding protein transcription factors in the hair follicle and at different stages of the hair growth cycle.J Invest Dermaˉtol，2002Jan，118（1）:17-24.
&&& 5 Mitsui S，Ohuchi A，Adachi-Yamada T.Cyclin-dependent kinase inˉhibitors，p21（waf1/cip1）and p27（kipl），are expressed site-and hair cycle-dependently in rat hair follicles.J Dermatol Sci.2001，Feb，25&&& （2）:164-169.
　　6 Commo S，Gaillard O，Bemard BA.The human hair follicle contains two distinct K19positive compartments in the outer root sheath:a unifying hypothesis for stem cell reservoir?Differentiation，2000，Dec，66（4-5）:157-164.
&&& 7 Rosenfield RL，Deplewski D，Kentsis A，et al.Mechanisms of androgen induction of sebocyte differentiation.Dermatology，-46.&
　　作者单位:400038重庆第三军医大学基础部细胞生物教研室
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论文写作技巧毛囊外根鞘细胞混悬液移植术，攻克肢端型白癜风壁垒 白里屠苏文章-琪琪女性网
毛囊外根鞘细胞混悬液移植术，攻克肢端型白癜风壁垒
日，由四川省中医药信息学会色素专业委员会发起的“毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术临床应用媒体发布会暨肢端型白癜风外科诊疗新进展报告”在中国成都举办。
【发布会现场照片】
四川省中医药信息学会王笳会长；核工业四一六医院皮肤病与性病科主任、美国哥伦比亚大学博士后、成都博润白癜风医院“白癜风临床实验研究中心”主任兰长贵教授；中华医学会皮肤性病分会委员、成都博润白癜风医院院长林昭春等知名专家出席了此次活动。
在发布会上，兰长贵教授对白癜风外科诊疗的新进展作了详细报告，并对毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术的研发背景、治疗原理和技术前景进行了全面的介绍。
【发布会现场照片：出席活动的知名专家】
聚焦肢端粘膜型白癜风，深入外科诊疗研究
肢端粘膜型白癜风是一种顽固性皮肤病，多发于人体暴露活动量较大的位置，对患者外貌影响非常大。而且随着白斑区域不断的扩散，治疗难度更成倍加大。正因如此，肢端粘膜型白癜风的治疗一直是个难题。
《白癜风外科治疗共识》指出：外科治疗是针对顽固型白癜风的有效手段之一。然而，经过对比研究目前临床中应用的众多外科技术后发现，这些技术虽各有优点，但在治疗肢端粘膜型白癜风时，效果都不是很理想。
【发布会现场照片：王笳会长在发布会上发言】
为了解决肢端粘膜型白癜风诊疗的困境，兰长贵教授与其团队经过一年多的临床试验、研究、对比，成功研发了毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术。
毛囊外根鞘细胞混悬液移植术，安全高效针对性强
兰长贵教授介绍，该技术采用FUE方法获取ORS细胞悬液，获得的ORS细胞中含有较多CD200阳性的细胞（AMMC），可以分化为成熟的黑色素细胞，促进黑色素的生长。而且，在获取ORS细胞悬液时，将毛囊作为一个整体单位进行移植，保障了毛囊周围微环境的平衡，更有利于黑素细胞的增殖。
【发布会现场照片：兰长贵教授介绍毛囊技术的背景、原理、前景】
此项技术适用于对光疗或药物治疗无效的稳定期白癜风患者，对非外科治疗不敏感的皮损，如唇部、手足、手指以及生殖粘膜等部位的肢端粘膜临床效果更为明显。
毛囊外根鞘细胞混悬液移植术，开启肢端型白癜风治疗新格局
兰长贵教授在会后接受采访时说到：“综合对比目前白癜风诊疗技术，毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术是现行最为有效的治疗白癜风的方法之一，尤其在治疗肢端粘膜型白癜风方面有着独到的优势，为广大的肢端粘膜型白癜风患者打开了一扇希望之窗。”
【发布会现场照片：兰长贵教授接受会后采访】
目前，毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术已成功运用于白癜风的临床诊疗。该技术定会有力推动西南地区肢端粘膜型白癜风诊疗技术的发展，为越来越多的、深受肢端型白癜风困扰的广大患者带去康复的希望。
此次发布会的成功召开，展示了肢端粘膜型白癜风外科诊疗的新进展。毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术的临床应用，突破了肢端粘膜型白癜风的诊疗难题，开启了精细化诊疗白癜风的新局面，势必会促进区域内白癜风临床诊疗水平提升。
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白癜风诊疗新进展发布会圆满落幕―聚焦肢端粘膜型白癜风，开启精准治疗新局面
来源: 时间： 15:11:56点击次数：
　　日，由四川省中医药信息学会色素专业委员会与我院联合发起的&毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术临床应用媒体发布会暨肢端型白癜风外科诊疗新进展报告&圆满落幕。四川省中医药信息学会王笳会长、四川省中医药信息学会色素专业委员会林昭春秘书长、四川省中医药信息学会色素专业委员会|我院&白癜风临床实验研究中心&主任兰长贵教授等知名专家出席活动。
&&&&&&&&&&&&&&&
　　&白癜风临床实验研究中心&促进科研成果转化
　　在国家《关于全面推进卫生与健康科技创新的指导意见》、《关于加强卫生与健康科技成果转移转化工作的指导意见》等文件精神背景下，为了促进白癜风领域的相关研究，推动白癜风医学研究的发展，建构以临床研究实验室为依托的白癜风科学研究、临床试验、成果转化体系，中西医结合进一步探索白癜风的发病机理以及临床治疗。本着优势互补以及长期合作原则，四川省中医药信息学会色素专业委员会联合我院于日成立并运作&白癜风临床实验研究中心&。而此次发布会的核心&&毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术便是&白癜风临床实验研究中心&的首项研究成果。
(四川省中医药信息学会王笳会长会上发言)
　　&四川省中医药信息学会与成都博润联合运作&白癜风临床实验研究中心&，正是为补上白癜风医疗科研领域的空白与缺失，优化白癜风临床技术与疗效，造福我们广大的白癜风患者。&王笳会长采访说到。
(我院林昭春院长接受采访)
　　&作为四川省首个&白癜风大数据中心&，我院有近7万例的白癜风患者数据，对开展白癜风临床治疗方法、疗效、理论研究，开辟新的诊疗模式、手段，攻坚肢端粘膜型等顽固型白癜风诊疗的临床试验提供数据指导和支撑。&成都博润白癜风医院林昭春院长说到。
　　聚焦肢端粘膜型白癜风，深入外科诊疗研究
　　《白癜风外科治疗共识》指出：当前的白癜风诊疗多采用综合疗法，但是某些类型白癜风对药物治疗反应不好，甚至部分治疗有效的患者也存在某些皮损对治疗疗效不佳的现象。因此，外科治疗是对顽固型白癜风的有效手段之一。
　　目前临床有多种外科方法可用于白癜风，虽然每一种手术方法都有优点，但经过对比研究多种手术方案的治疗疗效及相关指标发现，众多外科诊疗技术对肢端粘膜型的白癜风诊疗临床效果较为不理想。为此，&白癜风临床实验研究中心&主任兰长贵教授联合我院开展了肢端粘膜型白癜风的临床研究，合作研发了毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术。经过一年多的临床试验、研究、对比，目前，毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术已成功运用于白癜风临床诊疗。
(我院研究中心科研主任兰长贵教授)
　　毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术，开启精准治疗新局面
　　会上，兰长贵教授作了白癜风外科诊疗新进展报告，并对毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术的治疗原理和病例征集筛选原则进行了全面的介绍。据悉，毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术是采用FUE方法获取ORS细胞悬液，获得的ORS细胞中含有较多CD200阳性的细胞(AMMC)，可以分化为成熟的黑色素细胞，促进黑色素的生长。适用于对光疗或药物治疗无效的稳定期白癜风患者，对非外科治疗不敏感的皮损，如唇部、手足、手指以及生殖粘膜等部位的肢端粘膜临床效果更为明显。
(兰长贵教授接受采访)
　　此次发布会的成功召开，展示了我院肢端粘膜型白癜风的外科诊疗新进展，毛囊外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术的临床应用，突破了肢端粘膜型白癜风的诊疗难题，开启了精细化诊疗白癜风的新局面。据悉，根据成都博润白癜风医院计划，下一步将面向全社会征集肢端型、粘膜型等顽固型白癜风患者进行外根鞘细胞混悬液(NCORSHFS)移植技术，为深受白癜风困扰的广大患者带去康复的希望。
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