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请问下,羊拉稀特别严重,已经死亡2只了,还会传染,要怎么治疗
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2012年兽医专业
家畜传染病学、禽病学
家畜传染病学、禽病学目录 第一部分 基本技术实验指导一、消毒 二、免疫接种 三、剖检技术及病变检查要点 四、细菌分离、培养技术 五、药敏试验 六、病毒分离培养技术 七、鸡胚接种技术 八、动物试验技术 九、病原体的鉴定方法第二部分传染病实验室诊断技术一、鸡新城疫的诊断及免疫监测技术 二、减蛋综合征的诊断及抗体检测 三、马立克氏病琼扩试验 四、鸡传染性法氏囊病琼扩试验 五、鸡传染性喉气管炎的诊断 六、传染性支气管炎的诊断及防制 七、包涵体肝炎的实验室诊断 八、禽脑脊髓炎的实验室诊断 九、鸡传染性贫血的实验室诊断 十、禽霍乱的诊断 十一、鸡白痢的检疫 十二、鸡枝原体的检疫 十三、大肠杆菌病的实验室诊断 十四、禽流感的实验室诊断 十五、炭疽的诊断和防治 十六、布病的实验室诊断 十七、结核的实验室诊断 十八、巴氏杆菌的实验室诊断 十九、口蹄疫的实验室诊断 二十、兔瘟的诊断 二十一、乳胶凝集试验检测猪细小病毒 二十二、犬细小病毒的实验室诊断二十三、间接血凝抑制试验测定猪瘟抗体 二十四、乳胶凝集试验检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体 二十五、乳胶凝集试验检测猪伪狂犬病毒抗体 二十六、乳胶凝集试验测猪萎缩性鼻炎病毒抗体 二十七、猪圆环病毒的血清学诊断第三部分疫苗制造技术一、新城疫Ⅰ系弱毒疫苗的制造 二、鸡新城疫Ⅱ系弱毒疫苗的制造 三、鸡新城疫 LaSota 系弱毒疫苗的制造 四、鸡痘鹌鹑化弱毒疫苗制造 五、氢氧化铝胶苗的制造 六、动物脏器组织灭活疫苗的制造 七、油乳剂灭活疫苗的制造 八、猪瘟兔化弱毒苗的制备第四部分抗体制备技术一、传染性法氏囊病高免卵黄抗体的制备 二、抗新城疫高免血清的制备 三、猪瘟高免血清的制备及应用 四、抗体提纯技术1第一部分一、消毒基本技术1．人员的消毒：所有进入禽场生产区的人员，必须在更衣室内更衣换鞋，然后方可进 入场区。要控制或谢绝参观人员进入禽舍内。在场区(生产区)入口应设有喷雾消毒装置和消 毒池。喷雾消毒药物可用 0.1%新洁尔灭或 3～5%来苏儿，使用新洁尔灭时应避免与肥皂或 碱类接触，以防减弱其杀菌能力，消毒池要经常更换消毒药液。凡进入场内的人员及车辆都 必须经过消毒。也可采用紫外线照射消毒。 2．禽舍消毒：禽舍在消毒前必须进行彻底清扫与冲刷，以增强消毒效果，一般按以下 步骤进行消毒： 向禽舍的空间喷洒雾状消毒剂，使禽舍内空中飘浮的尘埃沉落，常用药为 3～5%的来 苏儿溶液。 将舍内一切可移动的设备移出。 进行洗刷和消毒。 夏季应尽量利用阳光曝晒消毒； 1～ 用 2%热氢氧化钠，20%草木灰，10～20%石灰乳洗刷墙壁和地面；金属笼或用具冲洗晾干后， 用 0.1%新洁尔灭溶液喷洒，或用火焰喷射消毒。 最后将禽舍密闭堵严，用甲醛熏蒸消毒。根据禽舍污染微生物种类和密闭程度，一般 每平方米空间用甲醛 20～40 毫升，高锰酸钾是甲醛的半量(即 2 毫升甲醛、1 克高锰酸钾、 1 毫升清水)放在大容量瓷器内进行熏蒸消毒。操作时先把盛有高锰酸钾的瓷器放在需要烟 熏消毒的地方，然后加入甲醛，决不可将高锰酸钾加到甲醛中去，这两种药物结合后生成大 量的热，所以在操作完后应立即离开现场，切忌使烟雾进入眼内。熏蒸时间最少 2～4 小时， 延长至 8 小时更好，消毒后，要打开窗户，排除剩余的甲醛蒸气，消毒后的禽舍应闭置 1～ 2 周后再使用。 3．用具的消毒：禽场的蛋箱、笼子、雏盒、工具等。应先洗刷干净，晾干或晒干，再 放到密闭的房间内用甲醛熏蒸 5～10 小时，进行严格消毒。 4．孵化消毒：种蛋的消毒方法很多，下面介绍几种：(1)福尔马林消毒法：将种蛋放入 孵化机内，关闭进、出气孔和鼓风机。每立方米用 30 毫升福尔马林，另加 15 克高锰酸钾， 经 20～30 分钟后，打开门和进出气孔，开动鼓风机。这种方法对病毒和霉形体的消毒效果 显著。(2)新洁尔灭消毒法：新洁尔灭溶液呈碱性，忌与肥皂、碘、高锰酸钾配用。消毒种 蛋时配成千分之一浓度的溶液。喷于种蛋表面。有较强的除污和消毒作用。(3)氯消毒法： 将种蛋浸入含 1.5%活性氯的漂白粉溶液中 3 分钟，取出晾干。(4)高锰酸钾消毒法：用千分 之 5 的高锰酸钾溶液泡种蛋 1 分钟，取出晾干。注意高锰酸钾溶液必须现配现用。(5)红霉 素消毒法： 将孵化前的种蛋先加温至 37.8℃， 然后置于 2～4℃红霉素溶液中。 浸泡 15 分钟。 红霉素溶液的浓度是每 1000 毫升含 400～1000 毫克。 (6)氢氧化钠消毒法： 将种蛋浸泡在 0.5% 的氢氧化钠溶液中 5 分钟。能有效地杀灭蛋壳表面的鼠伤寒沙门氏菌。(7)庆大霉素消毒： 用 100 毫升水含 0.5 克庆大霉素的溶液浸泡种蛋，能杀死种蛋中严重污染的沙门氏菌。孵化 室每天用 3%来苏儿喷洒消毒，蛋盘、出雏器用 3%来苏儿洗刷消毒后，再用清水冲洗干净。 5．环境消毒：禽场周围每季度喷洒消毒一次，运动场每年更换一次表土或清扫干净用 火焰彻底消毒。 6．粪便消毒：最常用生物热消毒法。即用堆粪法进行消毒。在距离场 100 米以外设一 粪场。堆粪的方法如下：在地面挖一浅沟，深红约 20 厘米、宽约 1.5～2 米，长度不限，随 粪便多少而定。先将非传染性的粪便或秸、秆等堆至 25 厘米厚，其上堆入欲消毒的粪便、 垫草等，高达 1～1.5 米，然后在粪堆外面再铺上 10 厘米厚的非传染性的粪便或麦草，并覆2盖 10 厘米厚的沙子或土，如此堆入三个星期到三个月，即可用以肥田，若粪便太干可加入 适量水，当粪便较稀时应加杂草，使其不稀不干，以促其迅速发酵。 7．带动物消毒：常用药物有过氧乙酸、新洁尔灭、抗毒威等，可按说明使用。 消毒药种类很多，理想的消毒药物应具有下列特性：(1)价廉易得；(2)对人、畜安全；(3)易 溶于硬水；(4)对用具和纺织物不会损伤；(5)在空气中较稳定；(6)无恶臭味；(7)无残余毒性； (8)在肉或蛋中不会有积存；(9)对杀灭大多数病原微生物有效。 目前尚无一种消毒药能全部符合上述要求，因此选用消毒药时应根据具体情况而定， 常用化学消毒剂见表 1。 表 1 常用化学消毒剂 消毒剂 名称 苛性钠 (火碱) 生石灰 草木灰 漂白粉 使用浓度 1～3%热 溶液 10～20% 乳剂 10～20% 热溶液 0.5% ～ 20% 一 般 常 用 为 2～5% 2～5% 5～10% 5～10% 使用对象 禽舍、 车船、 用 具等 同上 注意事项对病毒性传染病消毒效果很好。但对皮肤有腐蚀作 用禽舍消毒后数小时用清水冲洗后才能放入家禽。 必须新鲜配制。如用 1～2%碱水和 5～10%石灰乳 混合液消毒效果更好。 同上 用 10 公斤水和 2 公斤草木灰煮沸 2 小时，过滤后 备用，用时再加 2～4 倍热水稀释。 饮水、 污水、 禽 含氯量应在 25%以上，新鲜配制，用其澄清液，对 舍、 用具、 车船、 金属用具和衣物有腐蚀作用。禽舍消毒后应彻底通 土壤和排泄物 风以防中毒。 器械、 用具和洗 手等 禽舍、 土壤和用 具等 孵化器、蛋壳、 蛋盘等 蛋壳消毒， 洗手 用于含大量蛋白质的分泌物或排泄物消毒时，效果 不够好。 即来苏儿粗制品，注意点同上 空气消毒时可用福尔马林熏蒸法，每立方米空间用 福尔马林 20 毫升，加 10 克高锰酸钾和 10 毫升水 在瓷器内，室内密闭消毒至少半小时后彻底通风 且市售 5%新洁尔灭 20 毫升，加 25%亚硝酸钠 20 毫升，清水加至 1000 毫升即成。使用时不能接触 肥皂或洗衣粉。 对各种病原微生物杀灭效果都很好，价格低廉，无 公害，禽舍消毒时可喷雾，用具可浸泡来苏儿 (石炭酸) 臭药水 福尔马 林(甲醛 溶液) 新洁尔 灭 过氧乙 酸0.1%0.2 0.5%～禽舍、 除金属制 品外， 可用于各 种对象二、免疫接种免疫接种是预防和控制传染病的一项极为重要的措施。 免疫接种就是用人工的方法， 把 有效疫苗或菌苗引入动物体内， 从而激发机体产生特异性抵抗力， 使易感动物转化为有抵抗 力的动物，以免传染病的发生和流行。免疫接种的目的，就是提高动物对传染病的抵抗力， 预防传染，保证动物健康。 (一)免疫程序的制订 免疫程序就是预防计划，它包括预防疾病的种类、疫苗的选择、免疫次数、免疫时间、3免疫方法、联合用苗等内容。没有任何一个免疫程序能适用所有地区或不同类型的养殖场。 因此， 每一个养殖场都应按照自己的实际情况制订适合本场特点的免疫程序。 只有这样才能 有效地预防传染病的发生。 免疫程序的制订，至少考虑以下 8 个方面的因素：(1)当地疾病的流行情况及严重程度； (2)母源抗体的水平；(3)上一次免疫接种引起的残余抗体水平；(4)家禽的免疫应答能力；(5) 疫苗的种类；(6)免疫接种方法；(7)各种疫苗接种的配合；(8)对动物全身健康及生产能力的 影响。这 8 个因素是互相联系，互相制约的，必须统筹考虑。一般来说，免疫程序的制订首 先要考虑当地疾病的流行情况及严重程度。 据此才能决定需要接种什么种类的疫苗， 达到什 么样的免疫水平。首次免疫接种时间的确定，除了考虑疾病的流行情况外，主要取决于母源 抗体的水平。如新城疫母源抗体滴度低的要早接种；母源抗体滴度高的推迟接种效果更好。 (二)疫苗的种类 预防动物传染病的疫苗可分为两大类： 一类是灭活疫苗， 是把病毒或细菌灭活后制成的； 类是活毒疫苗或弱毒疫苗，一般是用毒力较弱，不会引起动物发病的活病毒或细菌制成的。 弱毒疫苗按生产过程不同， 又分为湿苗及冻干苗两种。 一般来说湿苗使用方便， 免疫效果好， 但不能长期保存，而冻干苗保存期长。 下面是几种常用的家禽疫苗。 1．目前我国已生产的新城疫疫苗有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等四个品系，它是把新城疫疫苗病 毒接种于鸡胚经一定时间培养后制成的活毒疫苗。Ⅰ系疫苗(又称为印度系)毒力较强，其次 是Ⅳ系疫苗(Lasota)，Ⅱ系(B1 系)苗毒力较弱，Ⅲ系(F 系)苗最弱。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ系苗适用于雏 鸡和成鸡，一般接种后不会引起严重反应，只出现轻微呼吸道症状或完全没有症状。但Ⅰ系 苗毒力比较强，只供 2 个月以上鸡使用，接种后引起的反应比较重，然而免疫效力最强。适 合疾病严重流行的地区使用。一般来说，为了安全起见，在使用Ⅰ系苗之前，要先用Ⅱ系或 Ⅲ系苗进行基础免疫。另外，目前还用Ⅳ系弱毒苗灭活后制成的新城疫油乳剂灭活疫苗，效 果优于各种弱毒疫苗，大小鸡均可用，不但安全，而且免疫期长。 2．鸡痘疫苗 目前预防鸡痘的疫苗有两类： 一类是由鸽痘病毒制成的， 另一类是由鸡痘弱毒病毒制成 的。 鸽痘弱毒苗适用于各种年龄的鸡，对一日龄雏鸡也没有不良反应，但免疫力差些，一般 免疫期为 3～4 个月。 鸡痘弱毒苗适用于 20 日龄的鸡，用于雏鸡接种可能会引起严重的反应，个别甚至会死 亡，免疫期五个月左右。 上述两种疫苗在接种后均应出现局部反应， 如局部红肿增厚、 毛囊肿胀或局部皮肤出现 豆大的小疱等，如果接种部位不见反应，应重新接种一次。 3．马立克氏病疫苗 目前世界上已有三类疫苗：(1)强毒化疫苗；(2)自然弱毒疫苗；(3)火鸡疱疹病毒 FC126 株疫苗，对 1 日龄雏鸡作肌肉或皮下接种 0.2 毫升，只能防止肿瘤的发生，但不能防止马立 克氏病强毒的感染。因此，接种越晚，雏鸡感染马立克氏病毒的危险性越大。近来已有由上 述两种以上毒株组成的多价疫苗，免疫效果更好。 4．禽霍乱菌苗 目前生产的禽霍乱菌苗有灭活菌苗和弱毒菌苗两类， 弱毒菌苗在国内外育成的菌株有很 多个。但弱毒苗的各个菌株，其免疫效果均不理想，一般免疫期仅三个月，有时会更短。不 同菌株所引起的接种反应不同， 但有时同一菌株甚至是同一批菌苗， 在不同情况下反应也不 相同。国内现已研制出油佐剂灭活菌苗，安全，免疫期较长。 禽霍乱弱毒菌苗和灭活苗还有许多不足之处。国内外都开始了亚单位疫苗的研制工作，4并得了初步效果。 5．传染性支气管炎疫苗 目前使用最广的弱毒株是 H52 和 H120，两者均为马萨诸型。此外，还有别的血清型，如 康涅狄格，也有灭活苗。H120 毒力比较温和，适用于幼龄雏鸡。H52 毒力稍强，一般用于 1 月龄以上的鸡或加强免疫。弱毒苗免疫有效期不长，每隔 2～3 个月重复接种一次，可获得 坚强保护力， 如果接种某一血清型的疫苗后仍不能防止疾病的发生， 应该选用别的血清型的 疫苗或多价苗。 6．传染性法氏囊病疫苗 目前有两种疫苗：一种是灭活苗，须加佐剂，否则无效。另一种是弱毒苗，不瘟和型和 中等毒力型等，其应用对象及剂量等有所不同。国内已试制出 PBC98 弱毒疫苗，是一种温 和型弱毒苗。对 1 日龄雏鸡进行肌肉注射，28 日龄时进行饮水免疫，实践证明安全有效。 7．传染性喉气管炎疫苗 目前有两种疫苗： 一种是弱毒疫苗， 可用于滴眼， 滴鼻或毛囊接种； 另一种是强毒疫苗， 只能用于擦肛或滴肛，如经呼吸道接种则会引起严重发病。 8．鸭瘟疫苗 现在普遍使用的是鸭胚培养、 鸡胚培养或细胞培养的弱毒疫苗。 我国有好几个单位培育 的鸭瘟疫苗弱毒株，安全有效，一般无不良反应。 9．减蛋综合征疫苗 目前使用的主要是用鸭胚生产的、加有油佐剂的灭活疫苗，效果良好。 (三)疫苗的选择和使用 疫苗的种类很多，各有优缺点和适用范围，不可乱用，否则不但不能起到预防疾病的作 用，反而会影响动物的健康，甚至会把本来没有的疾病带入养殖场。因此，必须根据不同情 况，慎重使用。 一般来说，需要接种哪些种类的疫苗，主要取决于当地流行的或可能流行的疾病种类， 经过调查和了解，当地有该种疾病的流行或可能受到威胁时，才进行该种疫苗的接种，尤其 是该疫苗是毒力强的活毒苗或活菌苗，更不应当轻率地引入从没有该病发生的地区进行接 种。 对于已有该病流行或威胁的地区， 选用什么类型的疫苗， 主要是根据疾病流行的严重程 度。一般流行较轻的，可选用比较温和的疫苗。例如新城疫可用Ⅱ系、Ⅲ系等缓发性疫苗。 而疾病严重流行的地区，则要选用效力较强的疫苗，如新城疫Ⅰ系等中发性疫苗。总之，要 使疫苗接种后产生的抵抗力与疾病流行的情况相适应，使动物有足够坚强的免疫力。 有些疫苗往往有几个品系， 一般来说， 初次接种应该选择毒力弱的品系， 而重复接种(又 称强化接种)则应选用毒力较强的品系，例如新城疫疫苗。目前我国已有 4 个品系，作为初 次接种，可选用Ⅱ系、Ⅲ系，而重复接种，可选用Ⅳ系或Ⅰ系苗。 在选用疫苗时， 还应考虑该疫苗对动物接种后是否会引起不良反应。 例如禽霍乱弱毒菌 苗如果用于产卵鸡，会引起产卵量短期下降。如果有其它病并发，也会引起死亡。此外，新 城疫疫苗、传染性支气管炎疫苗等接种，可能造成使本来不明显的败血霉形体病严重暴发， 因此当鸡群中有败血霉形体病潜伏存在的情况下， 又要进行上述疫苗接种时， 应该考虑提前 一、二天给要免疫接种的鸡连续服用药物，以便减轻或防止疾病的暴发。 在选择疫苗时，必须注意疫苗的质量，质量的好坏直接影响免疫效果。疫苗的质量除与 制造厂生产过程有关外，与贮存、运输及使用过程是否妥当也关系极大。以下是贮存、运输 及使用过程中影响疫苗的质量的一些因素： 1．保存条件：不同类型的疫苗，要求的保存条件是不一样的。必须按说明书规定的条 件保存，才能保证疫苗质量不会显著下降，一般来说，灭活苗要保存于 2～15℃的阴暗环境5中，活菌苗应保存于 4～8℃的冰箱中，这两种疫苗都不应冻结保存。但对于冻干的弱毒活 毒(菌)苗，除了个别的有不同要求之外，一般都要求低温保存。保存温度要稳定，尤其不能 反复冻融。 2．保存期：使用前检查瓶签上的截止有效期，离截止有效期越近，疫苗病毒(或细菌) 死亡越多。因为即使在最适宜的保存条件下，疫苗病毒(或细菌)也会缓慢死亡。 3．运输过程：疫苗运输时，通常达不到低温的要求，因此运输时间越长，疫苗中的病 毒(或细菌)死亡越多，如果中途转运多次，影响就更大。 4．疫苗的稀释：各种疫苗所用的稀释剂、稀释倍数及稀释方法，都有一定的规定，必 须严格按使用说明书进行。否则，疫苗的滴度会下降，影响免疫效果。例如，用于饮水的疫 苗稀释剂，最好是用蒸馏水或去离子水，但不能用自来水，因为自来水中的消毒剂会把疫苗 毒杀死。又如用于气雾的疫苗稀释剂，应该是用蒸馏水或去离子水，如果稀释水中含有盐， 雾滴喷出后，由于水分蒸发，盐类浓度提高，会引起疫苗病毒死亡。如果能在饮水或气雾的 稀释剂中加入 0.1%的脱脂奶粉，会有助于对疫苗病毒的保护。在稀释疫苗时，应使用注射 器先吸入少量稀释液注入疫苗瓶中，充分振摇溶解后，再加入其余的稀释液，如果疫苗瓶太 小，不能装入全量的稀释液，需要把疫苗吸出入在另一容器内，再用稀释液把原疫苗瓶冲洗 几次，使全部疫苗病毒(或细菌)都被冲洗下来。 5．疫苗的使用：疫苗在临用前由冰箱取出稀释后应尽快使用，活毒疫苗一般应在 4 小 时内用完。 马立克氏病疫苗应在两小时内用完。 当天未用完的疫苗， 应废弃， 不要隔天再用。 疫苗无论在稀释前后都不应受热或晒太阳，更不许接触消毒药，稀释疫苗的一切用具，必须 洗涤干净，煮沸消毒。饮苗的容器也要洗干净，无消毒药残留。 (四)免疫接种的途径和方法 对家禽进行免疫接种的常用方法有： 滴眼、 滴鼻、 翼下刺种、羽毛囊涂擦、 滴肛或擦肛、 皮下或肌肉内注射、饮水法及气雾法等。采用哪一种方法，应根据具体情况决定，既要考虑 工作方便及经济核算，更要考虑疫苗的特性及免疫效果。 1．滴眼、滴鼻：这种方法适用于新城疫Ⅱ系、Ⅲ系及Ⅳ系疫苗，法氏囊弱毒疫苗，传 染性支气管炎疫苗及传染性喉气管炎弱毒型疫苗等的接种， 对幼雏应用这种方法， 可以避免 疫苗病毒被母源抗体中和，并能诱导粘膜免疫，从而有比较良好的免疫效果。滴眼、滴鼻法 是逐只进行接种，能保证每只禽都得到免疫，并且剂量一致，免疫效果确实。因此，一般认 为，滴眼、滴鼻法是疫苗接种的最佳方法，尤其是对新城疫接种更是如此。 进行滴眼、滴鼻法接种时，可把１０００羽份的疫苗稀释于５０毫升的生理盐水中，充 分摇匀，然后于每只禽的眼结膜或鼻孔上滴一滴（０.05 毫升） 。也可把１０００只份的疫苗 稀释于１００毫升的生理盐水中，然后于每只禽的眼结膜及鼻孔上各滴两滴。 ２．翼下刺种：此法适用于鸡痘疫苗、新城疫Ⅰ系疫苗等的接种。进行接种时，将１０ ００羽份的疫苗稀释于 25 毫升的生理盐水中，充分摇匀，然后用接种针或蘸水笔尖蘸取疫 苗，刺种于鸡翅膀内侧无血管处，小鸡刺种１针即可，较大的鸡可刺种２针。 ３．羽毛囊涂擦：此法可用于鸡痘疫苗的接种，但已少用。 ４．滴肛或擦肛：此法仅用于传染性喉气管炎的强毒型疫苗。方法是把 1000 只份的疫 苗稀释于 30 毫升的生理盐水中，然后把鸡的肛门向上，将肛门粘膜翻出，滴上疫苗 1 滴。 ５．皮下注射：现在广泛使用的马立克氏病疫苗是火鸡疱疹病毒，宜用颈背皮下注射接 种。通常是把 100０只份的疫苗稀释于木 200 毫升稀释溶液中，然后每只雏注射０.2 毫升。 另外，各种油乳剂灭活疫苗也适用于皮下注射法。 ６．肌肉注射：此法是把疫苗直接注射于肌肉内，禽霍乱弱毒菌苗或灭活菌苗以肌肉内 注射较好。此法作用迅速，剂量准确，效果确实。新城疫Ⅰ系苗肌肉注射免疫效果比滴眼、 滴鼻好，灭活苗必须用注射法，不能口服，也不能用于滴眼、滴鼻。6肌肉内注射，一般按疫苗使用说明书稀释后，较小的禽只注射 0.5 毫升，成禽则每只注射１ 毫升。肌肉注射以胸部肌肉为好，应斜向前入针，以防刺入肝脏、心脏或胸腔内造成死亡， 对较小禽只尤其要注意。 ７．饮水法：对于大群禽只（例如一群超过 10000 只）逐只进行免疫接种费时费力，且 不能于短时间内达到全群免疫。对于产卵期和产卵盛期的鸡群，为避免骚扰禽群，常采用群 体免疫法。群体免疫法中最常用，最易做的，就是饮水法。目前采用饮水法较广泛，效果又 较好的疫苗有新城疫Ⅱ系及Ⅳ系苗、 传染性支气管炎Ｈ52 及Ｈ120 疫苗． 传染性法氏囊病弱毒 疫苗等。饮水法免疫虽然省时省力，但由于种种原因会造成每只禽饮水的疫苗量不一，免疫 效果参差不齐。而且，很多研究者证实，饮水法引起的免疫反应最小，往往不能产生足够的 免疫力，不能抵抗较强毒力的毒株引起的疾病流行，尤其是对速发嗜内脏型（亚洲型）的新 城疫是如此。 为使饮水法免疫达到一定效果，必须注意以下几个问题： （1）用于饮水法的疫苗必须是高效价的，且疫苗剂量加大 2～3 倍。 （２）稀释疫苗的饮水必须不含有任何使疫苗灭活的物质，例如：氯、锌、铁等离子， 必要时要用蒸馏水。 （３）饮水器具要充足，以保证所有禽只能在短时间内饮到足够的免疫量，饮水器具要 干净，饮水前必须彻底清除铁锈、脏物等，以免降低疫苗效价。 （４）饮疫苗前停止饮水２～４小时（视天气及饲料等情况而定） ，以便使禽只能尽快 而又一致地饮用疫苗。第二天再以同样剂量和方法重复饮水免疫一次。 （５）饮水中最好能加入 0.1%的脱脂奶粉。 （６）稀释疫苗的用水量要适当。正常情况下，可参考下表稀释： 鸡龄 ４天～２周 ２周～４周 ４周～８周 ８周以上 每５００只 １０公斤水 １４公斤水 ２０公斤水 ４０公斤水（７）饮水法免疫接种间隔时间不要太长，一般２～３个月进行一次。 ８．气雾法：此法是用压缩空气通过气雾发生器，使稀释疫苗形成直径１～１０微米的 雾化粒子，均匀地浮游于空气之中，随呼吸而进入禽体内，以达到免疫。 气雾免疫不但省时省力， 而且对某些呼吸道有亲嗜性的疫苗效果最好， 例如新城疫各系 疫苗，传染性支气管炎弱毒疫苗等。但是气雾法免疫对禽群的干扰大，尤其会加重败血霉形 体及大肠杆菌引起的气囊炎。必要时可在气雾免疫前后在饲料中加入抗菌药物。 气雾免疫就应注意的问题是： （1）疫苗必须是高效价的，而且通常应使用加倍的剂量。 (2)稀释疫苗应该用去离子水或蒸馏水，最好加入 0.1%的脱脂奶料或明胶。 (3)雾粒大小要适中，一般以喷出的雾粒中直径在 1～10 微米占 70%以上为最好，雾粒 过大，停留于空气中的时间短，也易被粘膜阻止，不能吸入呼吸道；雾粒过小，则吸入后易 被呼气时又排出。 (4)气雾免疫房舍应密闭，减少空气流动，并应无直射阳光，保证舍内有适宜的温度与 湿度。夜间气雾免疫最好，此时鸡群密集而安静，喷雾 20 分钟后打开门窗即可。 (五)紧急接种 当一个养禽场已经发生疫病，威胁到禽舍或禽场时，为了迅速控制和扑来疫病的流行，7一个重要的措施就是疫区及受威胁的禽群进行紧急接种。紧急接种可以用免疫血清或疫苗。 实践证明，在疫区内使用疫苗进行紧急接种，不但可以防止疫病向周围地区蔓延，而且对某 些疫病，如新城疫及鸭瘟，还可以减少已发病禽群的死亡损失。这主要是利用疫苗产生免疫 力快的特点，使未受感染的家禽获得抵抗力，但是对正处在潜伏期或尚未明显发病的家禽， 有可能促使发病和死亡，经过段时间后，发病及死亡数就会迅速下降，使疫病得到控制。 紧急接种应该包括养禽场内所有禽只，以使禽群一致地获得免疫力，而不留下易感禽。 这样强毒病原体就不会一代一代传下去。 例如发生新城疫时， 2 个月龄以上的鸡可用Ⅰ系 对 苗，幼龄鸡可用Ⅱ系进行紧急接种。为了保证接种效果，疫苗剂量可加倍，但必须注意不是 所有疫苗均可用于紧急接种，只有被证明紧急接种确实有效的疫苗(新城疫Ⅰ系、Ⅱ系、鸭 温弱毒疫苗)才能使用。另外，一般先接种健康的或无明显症状者，然后再接种可疑感染者 或发病者，以防人为地将病原体由病禽传给健康禽只，扩大疫情。 (六)免疫接种的一般注意事项 1．接种前应对禽群进行详细了解和检查，注意营养状况和有无疫病。一般鸡群健康， 可保证接种安全，相反，可能出现明显的接种反应，甚至发病，产生免疫力差。因此免疫接 种应于禽群健康状况良好时进行为宜。 2．接种前应考虑雏禽母源抗体水平，决定首次免疫接种时间。雏鸡的母源抗体，一方 面可以抵抗病原的传染， 另一方面又能妨碍疫苗接种后的免疫反应。 一般来说传染性支气管 炎的母源抗体可维持 2 周左右， 新城疫的母源抗体 3 周后完全消失， 但传染性法氏囊病的母 源抗体可持续 4～5 周龄。雏鸡的母源抗体受母禽抗体的影响。由于母禽免疫接种时间的不 同，或者孵化的种蛋来源不同，因此后代雏鸡的母源抗体水平就会有较大的差异。所以就很 难规定一个统一免疫程序而适用于各养禽场。如新城疫，根据母源抗体的检测结果，对于母 源抗体水平低而个体差异又较小的雏鸡，首次接种应在早龄进行；相反，母源抗体水平高的 雏鸡，应推迟疫苗接种时间。对于母源抗体水平参差不齐，差别很大，而该地区又存在有新 城疫威胁时，应早用苗，以提高母源抗体水平低的雏鸡的免疫力，然后再接种一次，使本来 母源抗体水平较高的雏鸡， 也能对疫苗接种有良好的反应， 重复接种可根据监测血凝抑制抗 体的情况，如果多数鸡只血凝抑制抗体下降到 1:16 以下时，就应进行强化免疫。 3．接种弱毒活菌苗前后各 5 天，禽群应停止使用对疫苗菌株敏感的药物，以免影响免 疫效果。此外，抗病毒性疾病的疫苗的常加入某些抗菌药物，如青霉素、链霉素等。如果与 弱毒活菌苗混合使用，则会降低疫苗的活菌数，从而也会影响免疫效果。 4．一个养禽场往往都不只进行一各种疫苗的接种。因此必须考虑到各种疫苗的互相配 合，以减少相互之间的干扰作用，保证免疫的效果。例如一日龄雏鸡同时进行马立克氏病疫 苗和新城疫疫苗接种时， 新城疫疫苗的免疫效果受到抑制， 新城疫疫苗与传染性支气管炎疫 苗同时接种时，一般无不良影响，但如果分别接种，则认为支气管炎疫苗接种 14 天内不应 接种新城疫疫苗，否则新城疫疫苗的免疫效果显著下降。为了保证免疫效果，对当地流行最 严重的传染病，最好能单独进行接种，以便产生坚强的免疫力。从免疫学的角度考虑，任何 疫苗都以单使用时效果最好，并已被实践证明。 5．使用各种疫苗，一定要按说明书的要求做，才能确保免疫效果。要做好免疫接种的 详细记录。记录内容至少应包括：接种日期、禽群的品种、日龄、数量、使用疫苗的名称、 厂名、批号、生产日期及有效期、稀释剂及稀释倍数、疫苗接种方法、操作人员等。 6．免疫接种后，要注意观察禽群接种疫苗后正常的异常的反应，如有不良反应或发病 等情况，应采取适当的措施，并向有关部门报告。疫苗接种经过一定时间(10～20 天)后，应 检查免疫效果。尤其是改用新的免疫程序及疫苗种类时更应检查。 (七)免疫接种失败的原因分析 禽群经免疫接种后，抵挡不住特定疫病的流行(例如：接种鸡新城疫疫苗后仍发生鸡新8城疫)，或者效力检查不合格(例如鸡新城疫疫苗接种后，血凝抑抗体滴度不能达到应有的水 平或抽检攻毒保护率低于标准要求)。均认为免疫接种失败。 分析免疫接种失败原因，必须从客观实际出发，周密地考虑各方面的因素，切忌主观武 断。事实上，每次免疫接种失败，都有其特殊的原因，但为了便于分析，开阔思路，把一些 可能的原因归纳如下，以供参考。 1．雏禽在免疫接种时，存在有母源抗体。 2．疫苗选择不当，在疫病严重流行的地区，仅选用安全性好，但免疫效果较低的疫苗 品系，例如，在有速发嗜内脏型新城疫流行的地区选用Ⅲ系苗。 3．免疫接种途径错误，例如，1 周龄内的雏鸡，采用饮水法接种新城疫疫苗；强化免 疫时，把新城疫Ⅰ系疫苗用于点眼、滴鼻。把灭活苗用于饮水等。 4．疫苗质量差。 5．疫苗运输、保管不当，造成疫苗失效或减效。 6．使用超过有效期的疫苗。 7．免疫接种工作不认真，例如采用饮水法免疫时饮水器不足，进行疫苗稀释时计算错 误或稀释不均匀，没有把应该接种的禽只全部接种等。 8．鸡群中有免疫抑制性疾病存在，如法氏囊病、马立克氏病等。 9．不同种类疫苗之间的干扰作用。 10．服用抗菌药物或免疫抑制性药物。 11． 接种时禽群内已潜伏有强毒病原微生物， 或由接种人员及接种工具带入强毒病原微 生物。三、剖检技术及病变检查要点病理剖检和病变检查是诊断传染病的重要方法之一。 它既可验证临床诊断结果的正确与 否，又可为实验室诊断方法和内容的选择提供进一步的参考依据。 对家禽的基本剖技术可参考下述方法： 1．将病、死禽只羽毛、皮肤用水浸湿，以减少空气染污。用力压迫，使髋关节断袭， 两腿叉开。 2．在靠近胸骨柄处剪开腹肌，沿两侧胁骨缘向前剪开胸肌，用力将胸骨向上折断、掀 起，充分暴露胸腔和腹腔。 3．先检查胸腔脏器，如心、肺、气囊等；再检查腹腔脏器，如肝、脾、肾、法氏囊、 卵巢、睾丸、气囊、输卵管、输尿管及胃、肠浆膜，观察有无变性、坏死、肿瘤等明显异常 变化。需要做细菌或病毒分离培养时，则应按照无菌手续采取所需病料。最后剖开口腔、气 管、食道、胃及肠管检查有无典型病理变化。四、细菌分离、培养技术细菌分离培养不仅是确诊传染病的重要和可靠手段， 而且也是进上步研究病原特性， 如 耐药性、致病性和生化特性等必不可少的步骤。病原细菌分离培养的一般方法如下： 1．采取接种材料：分离细菌一般多采取心血、淋巴结、肝脏或脾脏，雏鸡白痢可取胆 汁或未吸收完的卵黄。所选病料应在病鸡自然残废后立即采取，并严格按照无菌要求操作。 病料取好后应尽快接种到培养基上， 不应久放， 以免被杂菌污染或病料中细菌死亡而得出错 误培养结果。92．制备培养基：一般大多数细菌在普通营养琼脂平板或肉汤中均能良好生长，因此最 常用的培养基主要是普通琼脂或肉汤。为了特殊目的，有时需用特殊培养基，例如禽霍乱巴 氏杆菌，为检查其荧光性菌落，要用血清琼脂平板（普通琼脂中加入 10%的鸡或绵羊血清） ； 为让其生长更旺盛并检查有无溶血性，要用血液琼脂平板（普通琼脂中加入 10%的新鲜绵 羊血） 。另外，对霉形体、孤菌、霉菌及传染性鼻炎等病原体的分离培养，也需要较特殊的 培养基。 普通琼脂的制备方法：取牛肉汤 100 毫升，加蛋白胨 1 克，氯化钠 0.8 克，琼脂粉 2 克，加 热使其充分溶化，用 NaHO 溶液调 PH7.8，15 磅高压灭菌 30 分钟，冷至 45℃左右时倾注于 干烤消毒过的平皿中，每个平皿约 20 毫升，冷却凝固后用消毒纸包好放 4℃冰箱备用，可 保存 1～2 周。 若上述培养基中不加琼脂粉便叫普通肉汤。 将普通肉汤装入 10 毫升的试管中， 每管 2～ 3 毫升，高压灭菌 30 分钟后放 4℃冰箱备用，可保存数月。 3．细菌的接种：将选好的病料放于灭菌容器内，在无菌室或无菌罩或酒精灯下，以烧 热的铁片或剪刀在病料表面烧烙消毒，然后在烧烙处剪一小口，用接种棒插入小口，勾取少 量组织接入肉汤内，或在普通琼脂平板上划线接种，然后将接种过的肉汤或平皿放入 37℃ 温箱培养 18～24 小时，观察细菌生长情况，并将培养物涂片染色镜检，或进一步纯培养后 作生化试验，动物接种试验或药敏试验。根据以上培养特性，染色镜检特性、生化试验结果 以及动物接种结果对疫病做出最后诊断。 不同细菌的各种特性可参考后面有关内容或微生物 学教材。 所有过程都应严格无菌操作。五、病原菌药敏试验抗菌药物（中草药、抗菌素、磺胺类等）是兽医临床常用的药物，但是各种病原体对抗 菌药物的敏感性各不相同，同时，由于抗菌药物的广泛应用，以及广谱抗菌素的不断增加， 它们虽然对病原体有一定的作用， 但在使用不当时常导致抗药性的形成， 甚至干扰机体内的 正常微生物群的作用，反而对机体带来不良影响。因此，测定病原菌对抗菌药物的敏感性， 正确使用抗菌药物，对于临床治疗工作具有重要的意义，药敏试验有以下几种方法。 （一）纸片法 纸片法操作简单，应用也最普遍。 抗菌素纸片的制备 1．将质量较好的滤纸用打孔机打成直径 6 毫米的圆片，每 100 片放入一小瓶中，160℃ 干热灭菌 1～2 小时，或用高压灭菌（15 磅 30 分钟）后在 60℃条件下烘干。 2．抗菌药物的浓度（用蒸馏水或生理盐水稀释） 青霉素 200 单位/毫升 其他抗菌素 1000 微克/毫升 磺胺类药物 10 毫克/毫升 中草药制剂 1 克/毫升 3． 用无菌操作法将欲测的抗菌药物溶液 1 毫升， 加入 100 片纸片中， 置冰箱内浸泡 1～ 2 小时， 如立即试验可不烘干， 若保存备用可用下法烘干 （干燥的抗菌素纸片可保存六个月） 。 （1）培养皿烘干法：将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于 37℃温箱内保持 2～3 小时即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。 （2）真空抽干法：将放有抗菌药物纸片的试管，放在干燥器内，用真空抽气机抽干， 一般需要 18～24 小时。 4．将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中，置冰箱内保存备用，并用标准敏感菌株作10敏感性试验，记录抑制圈的直径，若抑菌圈比原来的缩小，则表明该抗菌药物已失效，不能 再用。 培养基：一般细菌如肠道杆菌及葡萄球菌等可用普通琼脂平板；链球菌、巴氏杆菌或肺 炎球菌等可用血液琼脂平板；测定对磺胺类药物的敏感试验时，应使用无蛋白胨琼脂平板。 菌液：为培养 10～13 小时的幼龄菌液（抑菌圈的大小受菌液浓度的影响较大，因而菌液培 养的时间一般不宜超过 17 小时） 。 试验方法：用白金耳取培养 10～18 小时的幼龄菌，均匀涂抹于琼脂平板上，待干燥后， 用镊子夹取各种抗菌素纸片，平均分布于琼脂表面（每个平板放置 4～5 片） ，在 37℃温箱 内培养 18 小时后观察结果。 结果测定：根据抗菌纸片周围无菌区（抑菌区）的大小，测定其抗药程度。因此，必须 测量抑菌圈的直径（包括纸片） ，按其大小，报告该菌株对某种药物敏感与否。 1．青霉素抑菌圈的标准： 抑菌圈直径 ＜10 毫米 10～20 毫米 ＞20 毫米 2．其他抗菌素及磺胺类药物的敏感标准： 抑菌圈直径 ＜10 毫米 11～15 毫米 ＞15 毫米 3．中药抑菌素的标准： 抑菌圈直径 ＜15 毫米 15 毫米 15～20 毫米 敏感性 抗药 中度敏感 极度敏感 敏感性 抗药 中度敏感 极度敏感 敏感性 抗药 中度敏感 极度敏感（二）快速敏感试验DD葡萄糖指示法 许多细菌能分解葡萄糖而产酸， 使培养基 PH 值发生改变， 若在培养基中加入抗菌药物， 接种的细菌对抗菌药物敏感时， 培养基中的葡萄糖就不被细菌分解利用， 不会形成酸性物质， PH 值不发生变化，因而指示剂也不变色，相反，细菌对抗菌药物不敏感时，抗菌药物抑制 不了该菌的生长繁殖，因而分解葡萄糖并产酸，使加入其中的溴甲酚紫由紫变黄，以此来测 定细菌对药物的敏感性。具体操作方法如下： 1．抗菌素纸片及菌液的准备，同纸片法。 2．配制指示培养基：取普通琼脂 15 毫升，加入 1%葡萄糖及 0.6%溴甲酚紫指示剂 0.7 毫升。 3．灭菌后，待培养基凉至 50℃左右时，加入菌液 0.5 毫升，充分混匀后（防止气泡） 作倾注培养。 4．待凝固后，用镊子将抗菌素纸片分别贴于表面，于 37℃条件下培养 24 小时后观察。 5．结果判定：纸片周围有细菌生长者呈现黄色，不生长时仍为紫色，并侧量抑菌圈的 直径，判定其敏感方法，方法同纸片法。 （三）试管法11试管法是将药物作倍比稀释， 观察不同含量对细菌的抑制能力， 以判定细菌对药物的敏 感度，常用于测定抗菌素及中草药对细菌的抑制能力。 试验方法：取无菌试管 10 支，排列于试管架上，于第一管中加入肉汤 1.9 毫升，其余 9 管各加入 1 毫升，吸取配制好的抗菌素原液、磺胺类原液或中药原液 0.1 毫升，加入第一管 中，充分混合后吸出 1 毫升吸入第二管中，混合后，再从第二管移 1 毫升到第三管，依此移 到第九管中，吸出 1 毫升弃去。第十管不加药液作对照。然后向各管中加入幼龄菌液稀释液 0.05 毫升（培养 17 小时的菌液作 1:1000 稀释，培养 6 小时作 1:10 稀释） ，于 37℃温箱中培 养 18～24 小时后观察结果。 结果测定：培养 18 小时后，凡无细菌生长的药物最高稀释管中即为该菌对药物的敏感 度。若由于加入药物（如中药）而使培养基变为混浊，眼观不易判断时，可进行接种或涂片 染色镜检判定结果。 药物名称 磺胺类药 链霉素 青霉素 多粘菌素、庆大霉素 金霉素、土霉素、 四环素、红霉素 新霉素、氯霉素 合霉素 敏感（微克/毫克） ＜50 ＜5 ＜0.1 ＜1 ＜2 中 度 敏 感 （微 克 /毫 克） 50～ 0.1～0.2 1～10 2～6 抗药（微克/毫克） ＞1000 ＞20 ＞2 ＞10 ＞6影响抗菌药物敏感试验的因素 1．器材：抗菌药物敏感性试验是利用微生物学方法进行的，其用量极微，实验仪器的 规格和精确度会直接影响实验结果，因此必须严格要求。试管、吸管、培养皿和其它器皿， 尤其是定量用的吸管，均须选用中性，硬质一级品，并且必须经过彻底灭菌。 2．培养基成分：培养基成分不但影响敏感菌株的生长繁殖，并可影响到抑菌圈的直径。 不同批号的蛋白胨，所含的氨基氮的总量不同，因而抑菌圈大小有一定差别。氯化钠、琼脂 中的钙、镁离子影响链霉素、新霉素的扩散，尤其是氯化钠对链霉素影响大，含量越高，抑 菌圈越小，甚至不出现反应，但氯化钠对多粘菌素反而有助于扩散。琼脂含量和平板厚度也 影响抑菌圈的大小，含量大，影响抗菌素的扩散，一般以 1.3～1.6%的浓度较合适，琼脂层 过厚抑菌圈也较小，以 2～4 厘米为最适宜。磺胺类药用琼脂平板法试验时，不能含蛋白胨， 因胨会使磺胺失去作用。血清成分的吸附或结合作用，会使金霉素、中药提取物抗菌作用减 弱。 表4 抗菌素 青霉素： 抗菌素的溶解度、稳定性及保存有效期 溶解度及稳定性 易溶于水， 在中性水溶液中较 稳定，尢在 PH6～6.5 的磷酸 盐缓冲液中最稳定 易溶于水，水溶液中较稳定 溶于水，溶解度为 132 毫克/ 毫升，PH6.3 缓冲液中溶解12保存期 4℃2～3 周，-10℃可延长 1 倍 4℃保存 2 周 4℃有效期 2 周链霉素 盐酸四环素盐酸金霉素氯化四环素和氧化四环素 新霉素 紫霉素硫酸盐 卡那霉素硫酸盐 多粘菌素 杆菌肽 氯霉素 红霉素黄霉素1000 微克/毫升 易溶于水，溶解度 0.5～0.6 毫克/毫升， PH2～5 之间较稳 定，高浓度 PH2～2.9 范围更 稳定 溶于水，酸性溶液较稳定 易溶于水 易溶于水，溶解度 500 毫克/ 毫升 溶 于 水 ， 250 毫 克 / 毫 升 ， PH2～9 范围稳定 PH3～5 的溶液中最稳定 易溶于甲醇、 乙醇， 也能溶于 水，在酸性环境中稳定 微溶于水， 易溶于甲醇、 乙醇、 丁醇、丙酮及醋酸中 易溶于有机溶媒中， 水中溶解 度仅为 2 毫克/毫升，PH7 最 稳定????????? 易溶于 N/10 氢氧化钠溶液， 乙醇、乙醚，溶解度 1%，耐 热， 蛋白胨、 血清成分可阻止 其抑菌作用4℃有效期 60 天4℃有效期 6 周 4℃,1 年 4℃，1 年 4℃，有效期半年 4℃，1 周 4℃，1 周 4～20℃有效期 1 年 4℃，二个月3．敏感菌株：菌种的敏感度差别较大，如金黄色葡萄球菌对青霉素最敏感。四联球菌 对四环素族最敏感。大肠杆菌对链霉素、多粘菌素敏感。因此，接种量要适宜，接种量多， 即使最敏感的菌株也不能抑制其发育，影响实验结果。 4．标准液和被检液：要用同一方法和在同一条件下配制，避免因操作方法不一致而造 成误差。 5．培养时间：细菌在发育过程中，对数期繁殖最快，以后处于稳定和衰落期，必须掌 握这一规律和特性，以便达到预期试验目的。时间过短则细菌不繁殖，过长则敏感性降低， 抑菌圈不清楚。一般以 37℃16～18 小时为适宜。 6．PH 值：对实验结果有显著的影响，新霉素、链霉素在碱性环境中活性最大，而在酸 性时抑菌圈缩小。四环素族以酸性为佳。青霉素、氯霉素以中性为宜。六、病毒分离培养技术病毒分离培养是确诊病毒性传染病的最可靠方法之一，其分离培养技术包括鸡胚接种、 动物接种和细胞接种分离培养。其中最简便、适用因而也最常用的是用鸡胚分离培养病毒。 1．接种材料的制备 分离、培养病毒用的材料除了应新鲜、无菌外，还要做一些特殊处理。首先应将所选取 的病料在无菌容器中剪碎、研磨，并根据所培养病毒特性用肉汤、生物盐水或特定稀释液将13病料作 1:5～10 稀释。然后按稀释后的病料悬液量计算并加入双抗（青、链霉素） ，使两者 最终浓度达每毫升 1000 单位或微克，并在 4℃环境下作用 1～2 小时，离心沉淀后取上清液 作为分离培养病毒的接种材料。 2．病料接种 若用鸡胚分离、培养病毒，则多选 9～12 日龄之间的发育鸡胚。许多病毒、特别是大多 数禽病毒都能在鸡胚或鸭胚中生长繁殖。接种时应先在照蛋器下检查鸡胚是否健康、活泼， 并划出气室和接种部位。然后严格消毒接种部位和气室，用打孔器打孔后，每胚接种处理好 的病料 0.1～0.2 毫升。接种后要用石蜡将孔口封死，放 37℃环境中继续孵育 48～96 小时。 不同病毒其接种部位、方法和培养时间不尽一样。可参考后面各有关内容。 若用动物分离、培养病毒，则最好选用本种动物或自然易感动物。除此之外，常用于分 离病毒的实验动物有小白鼠、豚鼠、家兔、大白鼠等。兔子的接种常采用肌肉注射、耳静脉 注射，剂量一般是 1 毫升。小白鼠、大白鼠、豚鼠常采用腹腔注射，剂量一般为 0.2～0.5 毫升。接种动物所用病料的处理与鸡胚接种法相同。动物接种后要单独饲养，不断观察，按 照规定时间收获病毒并进行鉴定。 根据病毒种类的不同，鸡胚接种后病毒可在不同部位生长、繁殖，例如新城疫病毒在尿 囊液和羊水中、 喉气管炎病毒和痘病毒在绒毛膜上含量最高。 其它试验动物接种后亦是如此， 即不同种类的病毒存在于不同的部位， 如猪瘟病毒接种家兔后主要存在于血液、 脾脏和淋巴 结，而狂犬病毒主要存在于接种动物的脑和神经组织中。因此收获病毒时应根据其生长、存 在部位来选取不同的组织器官。 除了鸡胚和动物外，细胞体外培养也是分离病毒的常用方法，但由于所需物品，试剂和 条件要求较严格，有些病初次分离不易在人工培养细胞上生长，而且技术难度较大，因此在 一般基层单位难以开展推广应用，故不作介绍。七、鸡胚接种技术鸡胚接种技术用途广泛， 除了可以分离培养病毒、 枝原体及衣原体等病原以确诊传染病 外，还可用于病毒的鉴定，效价测定，致病力测定及制造疫苗、抗原等。因此掌握鸡胚接种 技术对进行传染病的研究和防制工作非常有用。下面介绍鸡胚接种的基本技术。 1．选胚 根据需要选用合适日龄的鸡胚， 大多数病毒适于 9～12 日龄的鸡胚。 鸡胚应以白色蛋壳 者为好，便于照蛋观察。鸡胚应发育正常，健康活泼，不要过大、过小或畸形蛋孵化的胚。 鸡胚应来自健康无病的鸡群，而且不能含有可抑制所接种病毒的母源抗体，最好选用 SPF 鸡胚或非免疫鸡胚。 2．照蛋定位 接种前应在照蛋器下检查鸡胚， 挑出死胚和弱胚。 对所有健康胚应先用红铅笔画出气室 位置，再于胚胎侧画出接种位点（进针点） ，接种点应避开大血管，靠近气室边缘处，离胚 头约 1cm 左右。 3．接种 照蛋定位完毕后，即可开始接种。先用碘酊将接种位点和气室消毒，再用 70酒精脱 碘，然后根据需要用三棱针或 20 号针头在蛋壳上打孔。根据部位，鸡胚接种有以下几种方 法（可参照图 1） （1）尿囊腔接种 这是最常用的接种方法，鸡新城疫、减蛋综合症病毒、传染性支气管炎病毒、法氏囊病 毒等均可采用这种方法。蛋壳消毒后，先在气室上打一小孔，再于胚胎一侧近气室处所画位 点打一小孔，用带 5～7 号针头的注射器插入孔内约 1.5 厘米，接种接种材料 0.1～0.2 毫升。14进针时针头与蛋壳应保持 30℃角，不应垂直进针，注射完毕，立即用溶化的热石蜡将注射 口和气室上小孔密封，然后放回 37℃孵化箱孵化 72～120 小时。 （2）绒毛尿囊膜接种 该方法主要用于痘病毒、喉气管炎病毒和马立克氏病毒等的分离培养。将卵壳消毒后， 先在气室上打一小孔， 再于胚胎侧靠近气室处避开大血管用电烙铁或钢锯条将蛋壳打开一个 4 毫米见方的小口，用刀尖小心撬开蛋壳，不能损伤卵壳膜，形成卵窗。用针尖轻轻挑破卵 窗中心的卵壳膜， 但不能损伤卵壳膜下的绒毛尿囊膜。 在针尖挑破处滴一滴灭菌生理盐水或 甘油，然后用吸头在气室小孔上吸气，使胚内造成负压，这时卵窗处绒毛尿囊膜下陷而形成 人工气室，此时可见生理盐水或甘油迅速渗入。用注射器滴加 2～3 滴接种物于卵窗的绒毛 尿囊膜上，以透明胶纸封住卵窗。气室小孔用石腊密封，接种后的鸡胚平放在孵化箱中，卵 窗向上，不要转运。 （3）卵黄囊接种 此法适用于马立克氏病毒、披膜病毒、衣原体及立克次氏体的分离、培养。接种方法： 气室端蛋壳消毒后，在气室中央打一小孔，用带 7 号针头的注射器垂直刺入约 3 厘米，注射 接种物 0.1～0.2 毫升。石蜡封口，继续在 37℃孵化，每天翻蛋 2 次。 4．接种后的孵化和观察 接种后继续在 37℃孵化，每天照蛋 2 次，死胚随时取出。一般 24 小时内死亡的胚多因 创伤或细菌污染所致， 故弃去不用。 小时以后死亡的胚， 24 取出后放 4℃冰箱， 并作上记号。 接种后的孵化时间长短随病毒种类不同而不同，一般新城疫病毒、支气管炎病毒、减蛋综合 征病毒和法氏囊病毒要孵化 48～120 小时，喉气管炎病毒、马立克氏病毒要孵化 48～96 小 时，痘病毒要孵化 4～5 天，脑脊髓炎病毒要孵化至小鸡出壳。 5．收毒 接种鸡胚孵化到规定时间后， 应从孵化器中取出放 4℃环境冷冻 36 小时左右， 或在-10℃ 以下速冻 4 小时左右，但不得使鸡胚冻结，否则易发生溶血。冷冻完毕按下列步骤收毒： （1）鸡胚放于蛋盘或蛋架上，气室向上，用碘酊、酒精消毒后，以无菌镊子敲开气室 蛋 壳或去掉人工卵窗的透明胶纸，暴露卵膜。注意不要让卵壳碎屑掉入鸡胚内。 （2）根据接种部位，病毒种类或需要，收获相应的鸡胚材料如尿囊液、羊水、绒毛尿 囊膜、胎儿、卵黄囊等，有时需要收获全胚（除去卵黄和蛋白） ，如新城疫病毒、马脑炎病 毒等。 尿囊液：气室打开后，用无菌眼科镊子慢慢撕去卵壳膜，然后夹住绒毛尿囊膜轻轻提起，用 巴氏吸管刺破绒毛尿膜直接吸取尿囊液。 为防止羊膜堵住吸管口， 可用镊子轻轻压下羊膜及 胎鱼和，然后再吸。每个鸡胚一般可收 8 毫升左右尿囊液。 羊水：吸完尿囊液后，可用镊子夹住羊膜，将巴氏吸管直接插入羊膜腔吸取羊水，然后 再用镊子提起羊膜或压住胎儿， 直至羊水收获干净。 相当一部分病毒其羊水和尿囊液可以混 合，如新城疫，支气管炎、法氏囊病毒等。有些有能混合，则应将两者单收、单放。 绒毛尿囊膜：如要收获整个尿囊膜，则可在消毒、打开蛋壳、撕去壳膜后，将整个卵内 容物倒出，这时绒毛尿囊膜贴在卵壳内壁上，用镊子夹住将其撕脱下来即可。 胚胎：消毒、打开气室卵壳后，用镊子撕破卵壳膜和绒毛尿囊膜，夹起胚胎，用剪刀剪 断卵黄带，将胎儿放灭菌容器内即可。 6．鸡胚接种注意事项 （1）接种材料一般都应按每毫升 1000 单位或微克加入青、链霉素。 （2）接种位点应避开鸡胚在血管和胚头，以免针头刺伤鸡胚而造成接种后的损伤性死 亡。15（3）接种点最好选在胚头左侧，因一般人均右手持注射器，注射时易往左侧倾斜，这 样不易刺伤鸡胚。 （4）接种后注射口和气室孔均应用石蜡切实密封，防止细菌污染造成死亡。死亡鸡胚 应随时取出，以免时间过长细菌繁殖并对周围鸡胚造成污染。 （5）鸡胚取出冷冻时应保持气室向上，否则收获尿囊液时很困难。八、动物试验技术动物试验常用于病原微生物的分离、鉴定、免疫原性测定、致病力测定，保护力测定、 感染谱测定、病原的继代保存或致弱、中和试验、半数感染量或致死量测定以及制造疫苗和 免疫血清等。下面介绍几种常用的动物试验技术。 1．常用的实验动物：兽医常用实验动物有家兔、小白鼠、豚鼠、大白鼠、鸡和鸽子等。 必要时亦可使用本种动物，如猪病用猪，羊病用牛。无论何种动物均应健康无病，不带有任 何病原微生物，如能使用 SPF 动物则更好。同时应对所试验病原体敏感。 2．动物试验技术 根据实验目的，动物试验的接种技术有皮下、皮内、肌内、腹腔、口鼻、静脉及颅内等 多种方法。动物接种前必须保定、消毒、剪毛。针头的大小根据动物种类和接种部位而定。 接种剂量小白鼠一般 0.2 毫升，大白鼠一般 0.5 毫升，家兔、鸡一般 1～2 毫升，鸽子 0.5 毫 升。 （1）动物的保定 家兔可用保定台或保定筒进行保定，也可徒手保定。徒手保定时让其侧卧于实验台上， 一手压住臀部和后腿， 另一手抓住肩部和前腿。 大鼠和小鼠的保定是用左手拇指捏紧双耳和 颈部皮肤，手掌和其余手指握住背部。较小的豚鼠其保定方法同大鼠或小鼠：较大或怀孕的 豚鼠，可用左手捏住头颈部皮肤及背部，右手固定其臀部和后肢。保定鸡或鸽子时让其侧卧 于实验台，右手压住翅根部和背部，左手握住两后肢大腿部。 （2）动物接种 不同部位的接种方法如下： 皮下接种： 选皮下组织疏松， 便于注射和易于吸收处。 一般兔和豚鼠在腹部和大腿内侧， 鸡和鸽在胸部两侧，大鼠在背部或腹股沟部，羊和猪、犬在四肢内侧。注射时可于消毒后用 镊子将皮轻轻夹起，在镊子下部进针注射，注射后用酒精棉球压住注射部位再将针头拨出， 以防注射物流出。 肌肉接种：除禽类常用胸肌接种方法外，其他实验动物一般均为臀部肌肉接种。接种时 先消毒，然后将针头垂直或稍倾斜刺入肌肉内注射。 腹腔接种：该方法常用于小鼠、豚鼠或家兔。小鼠在脐后部中线附近，消毒后将针头以 几乎平行于腹中线的角度刺过皮肤和腹肌， 注射时应感觉不到有阻力， 否则可能在皮内或皮 下。 家兔和豚鼠腹腔接种时， 先从腹股沟处刺入皮下， 再进针约 1 厘米左右。 进入腹腔注射。 检验注射是否正确，除无阻力感外，还不应看到或摸到注射部位有鼓泡，否则可能在皮下或 皮内。 静脉注射：多用于家兔接种，可选择耳外侧背部边缘静脉，用酒精棉球涂擦或以手指用 力弹打耳边，可使耳静脉充血，怒涨，利于进针。消毒后左手拇指和食指紧捏静脉基部，无 名指和小指夹住耳尖部， 5 号针头对准静脉先垂直进入皮肤和血管， 以 然后将针头置于与血 管平行位置进针 1～2 厘米。轻轻抽动注射器，若有血液进入针管则说明已进入静脉，此时 松开静脉基部，慢慢注入接种材料，感到毫无阻力。若针头不回血或注射时阻力较大，则说 明针头未进入血管，应重新调整进针位置。注射时针管内千万不可进入气泡，否则会使兔血 管产生气性拴塞而引起急性死亡。注射完毕用棉球压迫针口片该，以免出血。小鼠多采用尾16静脉注射。 脑内接种： 小白鼠、 雏鸡常为脑内接种的动物。 以两眼或两耳连线中央偏左颅骨处将 4～ 6 号针刺入脑内约 1 厘米深，注入接种材料 0.05 毫升即可。注意严格消毒。九、病原体的鉴定方法各种病原微生物通过分离培养后，最终都必须通过病原鉴定才能最后得出确诊或结论。 病原体的鉴定一般包括如下内容： 1．形态鉴定：病原细菌主要通过涂片，染色后用光学显微镜（即普通显微镜）的高倍 镜头（即油镜头）观察其形态大小、染色特性、有无荚膜、芽孢、鞭毛以及存在方式等，从 而做出初步鉴定。病料中的病原体形态观察，可用各种病料组织（肝、脾、淋巴组织、血液、 胆汁、气管分泌物、胃肠内容物等）涂片、干燥后，以瑞氏染色法、姬母萨染色法或美兰染 色法染色镜检。培养后病原细菌可用蒸馏水稀释，涂片后，以革兰氏染色法染色镜检。具体 染色方法和各种病原细菌的形态特征可参考后面有关章节内容。 病毒的形态特征鉴定目前主 要依靠电子显微镜观察，一般基层单位难以做到。 2．培养特性鉴定：对于细菌主要是检查其人工培养所适宜的培养基种类（普通培养基， 鉴别培养基及特殊培养基等） 、培养条件（ 温度、氧气及时间等） 、生长特性（菌落形态、 大小、色泽、粘度、光滑度、是否溶血、菌液是否混浊或有沉淀等、有无毒素产生以及噬菌 体类型等） 。对于病毒则主要是检查其生长繁殖所适宜的易感动物、细胞或禽胚、最佳生长 条件 （细胞的种类、 各种营养成份及特殊成份、 禽胚的种类及日龄、 温度等） 和生长特性 （细 胞是否产生病变、 复制周期长短及病毒滴度出现峰值的时间、 禽胚是否发生各种病变或死亡、 干扰作用、血细胞吸附作用，病毒复制的部位及方式等） 。具体鉴定方法可参照后面各有关 章节。 3．生化鉴定：此项内容主要是针对病原性细菌，包括各种糖类的发酵试验，某些特殊 物质的产生或利用试验等，具体方法可参考各章节有关内容。 4．理化特性鉴定：理化特性是病原微生物的基本特征，也是进行病原分类和鉴定的主 要依据之一。 理化特性主要包括核酸类型及存在方式、G＋C 含量、蛋白质多肽的含量及类型、酶的 种类及含量、脂质含量、碳水化合物（糖和多糖）含量以及其他成分的含量等。除此之外， 细菌还应包括抗原分析（表面抗原、鞭毛抗原、菌毛抗原、荚膜抗原、芽孢抗原、胞壁抗原 及胞浆抗原等） ，病毒则包括沉降系数、浮密度等。理化特性鉴定均需特殊条件。 5．生物学特性鉴定：主要包括感染谱、致病力、毒力、免疫性、血凝性、生物型、抵 抗力（对外界环境因素、物理化学因素、消毒药物及抗微生物药物的敏感性）等。 6．血清学鉴定：主要根据免疫学原理，利用特异免疫抗体对病原微生物进行鉴定。血 清学鉴定方法包括凝集反应（试管凝集和平板凝集）沉淀反应（试管沉淀和琼脂扩散沉淀反 应） 、血凝抑制反应、中和反应、间接血凝、免疫电泳、荧光抗体技术、酶标抗体技术、放 射免疫技术、补体结合反应、红细胞吸附及吸附抑制试验，免疫粘附血凝试验，协同凝集试 验及其他抗体标记技术等。 这些鉴定方法有的比较简便， 如凝集反应， 沉淀反应， 琼扩反应， 血凝抑制反应等， 在本教材各有关章节中均有介绍。 其他一些方法均较复杂或需一定试验条 件，可参考其他教材。 7．其他鉴定方法：随着分子生物学理论和技术的迅速发展，鉴定病原微生物的方法也 不断增加，而且更加特异和敏感，例如目前已进入实用阶段的核酸杂交（核酸探针）技术、 体外核酸扩增技术 （聚合酶链反应， PCR） 酶切图谱、 限制性酶切片段长度多态性分析 （RFLP） 和核酸序列测定技术等。当然，这些鉴定方法适合各种病原微生物，但一般只有在设备齐全 的实验室才能进行。17第二部分传染病实验室诊断技术一、鸡新城疫的诊断及免疫监测技术(一)鸡新城疫(ND)主要侵害鸡，其次是火鸡、珠鸡和野鸡，鸭鹅等水禽均不易感。本病 在流行上具有高度接触传染性，发病率和致死率很高。一年四季均可发病。但以春秋两季发 病较多，本病临床症状表现为体温升高到木 43～44℃，精神沉郁或闭眼嗜睡，病鸡腹泻呈 黄白色或绿色，有时带血，常摇头、嗳气，发出“咯咯”声，口和鼻中有多量粘液，嗉囊内 积液，病程稍长或呈慢性经过时，常有腿、翅麻痹或头、颈歪斜等神经症状。剖检特征病变 是腺胃的乳头突起部或粘膜上有点状或斑状出血， 有时形成溃疡， 尤其在腺胃与食道交界部 更为明显。 肌胃粘膜上有点状或不正形的出血斑点。 肠道、 尤其是盲肠扁桃体和小肠粘膜 （迥 言瓣部）以及直肠粘膜上出血和不同大小界限清楚、出血性纤维素坏死伪膜，其他各部位如 心、腹部脂肪及喉头、气管等处都有出血斑点。 （二）病毒分离 材料应采自早期病例， 慢性病例不适宜于分离禽病毒， 病鸡扑杀后应用无菌手术采取脾、 肾、肝、肺（通常有较高的病毒滴度） ，脑（病毒的存在时间较其它组织长）或骨髓（最不 易被细菌污染）等组织。生前可用灭菌棉拭子获取呼吸道或泄殖腔分泌物。将棉拭子浸出液 或经研磨的组织悬液制成 1:5～10 乳剂，每毫升加青、链霉素各
单位，以抑制 可能污染的细菌，置冰箱中作用 2～4 小时，然后离心沉淀，取其上清液作为接种材料。 鸡胚接种 常用 9～10 日龄的鸡胚，每份病料至少注入 5 个鸡胚，接种于绒毛尿囊膜或尿囊内，操 作方法如下。 1．照蛋，划出气室位置，在鸡胚胎面观看胚胎活动，选择无大血管处标一记号。 2．在气室顶部和标记处用碘酊和酒精消毒，并各钻一小孔。 3．用较干的碘酊棉球涂布小孔。 4．用 1 毫升注射器吸取上述处理过的材料，插入小孔内约 3mm，缓缓注入 0.1～0.2 毫 升，拔出针头。 5．用融化石腊封口，在蛋壳上标明日期。 6．置 37℃温箱培养，每天照蛋二次，至全部或大部分鸡胚发生死亡为止（24 小时内死 亡的胚弃之） 。 7．将死胚收藏于 4℃冰箱内，气室向上，6～24 小时获尿囊液。鸡胚接种诸途径188．收获尿囊液时，以碘酊涂擦气室和气室附近的蛋壳，用灭菌摄子将气室处蛋壳敲破， 剥去蛋壳，用另一灭菌小镊子剥去蛋壳膜，并撕破绒尿膜，暴露出清晰的尿囊液（混浊者已 污染，应弃去不收） ，以镊子将胚胎和胚膜压向一边，吸取尿囊液于灭菌瓶中，并加标签。 用透明而无菌者作血凝反应，可在 96 孔微孔板上进行，也可将尿囊液一滴与 1～2%鸡红细 胞悬液一滴在一块白瓷板上相混和， 如发生红细胞凝集， 即用已知抗鸡新城疫血清作血球凝 集抑制试验（HI） ，出现抑制反应，便可得到确诊。 组织培养（细胞培养） 鸡新城疫病毒能在禽源原代细胞， 一些哺乳动物的原代细胞和细胞系中生长繁殖， 因此 也可用细胞培养的方法来分离病毒。 最常用的是在玻璃和塑料容器内长成单层的鸡胚成纤维 细胞。操作时可将待检液作一系列十倍比的稀释（如 10-1 到 10-3） ，分别注入到鸡胚成纤维 细胞的培养管中，24 小时～48 小时出现细胞病变（细胞圆缩颗粒化，拉长呈蜘蛛网或干枝 梅样） 取培养液作 HA 和 HI 试验， ， 鉴定病毒。 也可在细胞培养中用已知血清进行中和试验， 作出鉴定结果，如将待检材料注入鸡胚成纤维细胞的平皿培养中（空斑试验） 。新城疫强毒 通常出现大而透明或大而红色蚀斑（2～4 毫米） 。根据蚀斑形成单位可测定病毒浓度。 （三）血清学检查 由于循环抗体产生后，病毒可从寄主的组织中迅带消失，所以慢性病例难于分离病毒， 应通过特异抗体的检查来间接诊断此病。通常中和抗体较血凝抑制（HI）抗体维持时间要 长些，但中和试验较费时花钱，而 HI 试验能在短时间内作大量测定，检出的抗体滴度一般 相当于中和滴度。因此常用 HI 试验来检查抗体。抗体滴度于感染后 5～7 天开始上升，15～ 20 天可达高峰且能维持较长时间，受强毒感染而耐过的鸡在体内产生极高的抗体水平，滴 度高达 11（Log2）以上。在感染群内出现高抗体的数量随鸡群原有的抗体水平而异，与鸡 的年龄也有关系，平均可达 30%，在只有少数出现症状，不断发生死亡的鸡群中，我们可 对活鸡进行抗体检测。如有较多高抗体鸡的出现，说明鸡群已受过新城疫野毒感染。免疫过 较长时间的鸡群持续保持高水平的抗体，可能是隐性感染或慢性感染的结果。 （四）鸡群血凝抑制抗体水平快速测定法 近年来养鸡业有较快发展。 但由于免疫失时， 免疫不当和疫苗失效等多种原因致使鸡新 城疫仍有流行，一些免疫力低落的鸡群，遇野外强毒侵袭时，有的引起急性爆发招致大批死 亡， 有的造成隐性感染而使野毒继续潜留。 这不仅给广大农户带来损失也威胁着养鸡业的进 一步发展。因此，在加强预防接种同时用一种快速、简单、可靠的监测手段来了解鸡群免疫 状态和有否野毒感染，以便掌握确切免疫时机，更有效地控制新城疫，是生产上急需解决的 问题。 由于血凝抑制（HI）试验比中和试验简单、方便。且 HI 抗体水平与攻毒保护有密切关 系。故 HI 试验仍是目前国内评价鸡群免疫状态最常用的血清学方法。但常规的试管全量法 比较麻烦，不适用于较多样品的测定。本文介绍的三种简易、快速的测定方法供生产上实际 应用。 β －微量法 器材 1．塑料微孔板：96 孔 V 型凝集板，使用前后充分清洗，晾干。 2．针管定量稀释器：以四支全量 0.25 毫升的注射器并联制成，可以定量，前端接塑料 滴头，每挤一下为 0.05 毫升。一次可同时稀释四个样品。然后更换干净的滴头再用。 （见图） 3．微型振荡器：专用于微量凝集后的混合。也可用手振荡混合。 4．塑料采血管：内径 2 毫米的聚乙稀塑料管，剪成 10～12 厘米长，备用。195．标准滴管：以静脉注射管连接磨去尖端的 18G 号针头，要求每滴 0.025 毫升。 试剂 1．磷酸缓冲盐水（PBS） ，用作稀释液。PH7.0～7.2，配方如下： 氯化钠 170.0 克 磷酸二氢钾 13.6 克 氢氧化钠 3.0 克 蒸馏水 1000.0 毫升 高压蒸气灭菌，4℃冰箱保存，用时作 20 倍稀释。 2．浓缩抗原：以含有 Lasota 系病毒的尿囊液经福尔马林灭灭，聚乙二醇浓缩制成，其 血凝价为 ，用聚乙烯塑料管小剂量分装，置 4℃冰箱保存备用。 （可在 4℃下保 存 10 个月以上，效价不变） 。 此抗原具有效价高、洗脱慢、耐长期保存和不散毒等优点，每次作血凝抑制试验按固 定比例稀释配制 4 个血凝单位浓度的抗原，抗原稀释倍数按下式计算： （稀释倍数=血凝效价/血凝单位数） 3．红血球悬液，采成年鸡血放入加有 8％柠檬酸钠抗凝剂的试管中或等量 Alsever 液中 （后者可在 4℃下保存 2 周） ，用 20 倍量的 PBS 洗涤血球，重复 3～4 次。每次 2000 转、分 离心 5 分钟， 最后一次离心 10 分钟， 吸取压积血球， PBS 配成 0.5％悬液， 用 或先配成 10％ 浓悬液（可在 4℃下保存 2～3 天）用时进行 20 倍稀释。 4．标准阳性血清：采自高度免疫的公鸡，经效价测定后分装小瓶，且在瓶签上标明 HI 价，0℃冰箱存放待用。 5． 待检血清：检测鸡群免疫水平时，每群随机采血 20～30 份血样，先用三棱针刺破 翅下静脉，随即用塑料管引流血液至 6～8 厘米长度。在酒精灯上将管一端烧融封口，或用 石蜡封口， 用胶布标明鸡号或群号，置 37℃温箱中．2 小时，待凝固拆出血清后以 1000 转／分离 心 5 分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中，如需较长时间保存，可在离心后将 凝血块一端剪去。滴融化石腊封口，冻存于 0℃冰箱内，用这种方法采血简易、快速、对鸡 损伤小，尤适于雏鸡采血，也便于采血后携带，存放和分离血清。 试验操作 1．微量血凝(HA)试验 (1)用定量稀释器于每孔中加 PBS0.05 毫升，共滴 4 排孔。 (2)以稀释器吸 1:5 稀释抗原于第一列孔，挤压 4～6 次混匀后吸至经二列孔，依次倍比 稀释，最后一列不加抗原作为对照。 (3)换去稀释器前端塑料管头，再吸 0.5％红血球悬液依次加入各孔，每孔 0.05 毫升。 (4)置微型振荡器上振荡 1 分钟，或以手平持血凝板绕圆圈混匀。 ’ (5)置室温下(18～20℃)30～40 分钟，根据血球凝集图象判定结果。 以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度，如用 2 为底的对数表示，则 1 代表第 1 个稀释度(5×21)，2 代表第 2 个稀度(5×22)，依次类推，其血凝滴度恰与板上出现 完全凝集的最高孔数一致，(为精确比较不同抗原的血凝滴度，可将最高凝集孔后一孔的不 全凝集状态：25％、50％、75％的凝集分别以对数 0.25、0.5、0.75 表示，作为前面整数的 尾数)。每次做四个重复以几何均值表示结果。 2．β ―微量 HI 试验 (1)在 96 孔 V 型微孔板上进行，用针管定量稀释器加样和稀释，一次可同时稀释四个样 品。 (2)先取 PBS0.05 毫升，放入第 l 孔和第 12 孔，再取浓度为 4 个血凝单位的抗原依次加20入 3～11 孔，每孔 0.05 毫升，第 2 孔加浓度为 8 个血凝单位的抗原 0.05 毫升。 (3)用稀释器吸待检血清 0.05 毫升于第 l 孔中(血清对照)挤压混匀后吸 0．05 毫升于第 2 孔依次倍比稀释至第 11 孔，最后弃去 0.05 毫升。 (4)置室温(18～20℃)下作用 20 分钟。 (5)用稀释器滴加 0.5％红血球悬液于各孔中，振荡混合后，室温下静置 30～40 分钟， 判定结果。 以完全抑制血球凝集的血清最大稀释度为该血清的 HI 滴度， 如用以 2 为底的对数(Log2) 表示，其 HI 滴度恰与板上出现完全抑制的最高孔数一致。(为精确比较不同样品的 HI 滴度， 可将最高抑制孔后一孔的不全抑制状态，25％、50％、75％的抑制分别以对数 0.25、0.5、 0.75 表示，作为前面整数的尾数)。 注意事项 1． 本法具有简易、 快速、 重复性好等优点， 测得的 HI 值比标准全量法平均高 0.65(Log2)。 2．血凝和血凝抑制试验虽简便、快速，但影响因素甚多，有时测得的结果不一致。因 此必须严格控制试验条件， 如准确配制红血球悬液和 4 单位浓度的抗原， 每次测定应有严格 的温度范围和作用时间等，鉴于影响因素广泛，可变，每次测定应设已知滴度的标准阳性血 清作对照。 3．攻毒试验表明，HI 滴度在 4(Log2)的鸡保护率为 50％左右，在 4(Log2)以上的保护率 达 90％～100％，在 4(Log2)以下的非免疫鸡保护率仅 9％，免疫过的鸡为 43％，鸡群的 HI 抗体水平以抽检样品的 HI 抗体几何均值表示。如平均水平在 4 （Log2）以上，表示该鸡群 为免疫鸡群。 4．当鸡群受到野外强毒侵袭时，总有一些个体能耐过感盛而存活，同时产生极高的抗 体水平，用微量法在鸡群中检测时，如有较多 11（Log2）以上的高抗体鸡出现，说明鸡群 已受新城疫强毒感染， 在必要时， 可利用检出的高抗体鸡的高免血清对那些刚发病或受到威 胁的鸡群进行紧急被动免疫，可以减少死亡，以利迅速控制流行。表5穴号微量血疑（HA）试验 54滴度 材料PBS（滴） （约 0.05ml） 抗原 （滴） 0.5％红血球 悬液（滴）15×2125×2235×2345×265768798109115×21112对照5×25×25×25×25×25×2101 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11弃去一滴111111111111全血平板法 主要材料 1． 器材： 白瓷板， 标准滴管(以静脉注射滴管连接磨去尖端的 18 号针头， 要求每滴 0.025 毫升)，三用血色素管、三棱针、酒精灯等。 2．抗原：以含有 Lasota 系病毒的尿囊液经福尔马林灭活、聚乙二醇浓缩制成。使用时 用 PBS 稀释至含 32～64 血凝单位的浓度。 10 毫升稀释抗原中滴入 10％柠檬酸钠 0.1～0.2 每 毫升。(稀释抗原能在 4℃下存放 4～5 天)。213．阴性鸡：未经任何免疫，用β 一微量法测定其 HI 滴度在 1:16 以下。 操作方法 先在白色瓷板上划好 4×4 厘米方格。以标准滴管加已稀释好的抗原于方格内，每格 4 滴(约 0.1 毫升)。然后刺破翅下静脉或鸡冠，用三用吸管吸取全血 10 微升于抗原液中充分搅 拌混合使之展开成直径 3 厘米大的液面。作用 1～2 分钟后判定。 结果判定 根据血球凝集程度记录结果： “2”表示 2 分钟内 100％凝集，血球凝集呈花斑状或颗粒 状，背景澄清，判为阴性(无抗体)。 “1”表示部分凝集。2 分钟内出现微量细小的凝集颗粒， 背景不全清亮。具有程度不一的流动血液，判为可疑。 “0”表示 2 分钟内不凝集。即 100％ 抑制，血液与抗原均匀一致，判为阳性(有抗体)。 注意事项 1．浓缩抗原一经稀释在野外条件下会受到阳光、温度、污染等多种因素影响，稳定性 降低，故抗原应现用现配，当天用完或一次稀释后存放 4℃冰箱中，使用时倾出少许，五天 内用完，在大批鸡检验前。需用标准阴性鸡预试，以保证抗原效价稳定，检查准确。 2．平板 HI 试验受温度影响，气温低于 9℃凝集缓慢，反应不充分；高于 30℃洗脱加 快，且易干燥，影响判定。本实验宜在 12～28℃下进行，反应比较稳定。 3．全血平板 HI 试验阴性鸡，其 HI 滴度相当于 1～3(Log2)，攻毒后多数不保护；阳性 鸡其 HI 滴度相当于 5(Log2)以上，攻毒后 90％以上保护；可疑鸡其 HI 滴度相当于 4(Log2) 左右，攻毒后半数左右保护。用平板法在现场监测鸡群免疫水平时，鸡免疫后一定时间的鸡 群随机检测 10～30 只鸡，如出现半数以上的阴性鸡时，表明其免疫水平已处于临界水平之 下，急需再次免疫以迅速提高鸡群抗体水平。平板法用于 HI 水平的定性测定，便于在技术 条件较差的中小鸡场和专业户小群养鸡现场应用，虽不如微量法精确，但操作简易快速。 卵黄 HI 试验 用卵黄测定 HI 抗体，方法简便，操作时先在蛋壳上打一蚕豆大孔，放尽蛋清，用 1 毫 升注射器(不带针头)插入卵黄中吸取 0.5 毫升于等量中性磷酸缓冲盐水或 8％构缘酸钠或 16％NaCl 液中，混合后即可按血清β 一微量法测定 HI 滴度，判定时为避免卵黄的影响，可 从微孔板反面观察凝集图形。由于凝集图型在卵黄液中洗脱较快；故应及时判定。 本法可利用破壳蛋、畸形蛋或无精蛋。尤适于蛋鸡、种鸡场应用。卵黄抗体与产蛋时 种鸡血清抗体一致，与同一时期入孵的雏鸡抗体相比平均高 1 个滴高，因此用卵黄测定 HI 抗体可避免捉鸡采血对鸡群的不良影响，还可通过测定同时了解种鸡和出壳雏鸡的抗体水 平；以预测雏鸡初次免疫最适时间。二、产蛋下降综合征的诊断及抗体检测、产蛋下降综合征(EDS～76)是近年来传入我国的一种新病，主要危害产蛋鸡。其病原是 一种腺病毒，来自于鸭，但只危害鸡。该病毒可凝集鸡，火鸡和鸭的红细胞，并在鸭胚尿囊 液或细胞培养液中有很高的血凝价，因此可用血凝(HA)试验和 HI 试验检测病毒及其抗体。 鸡感染本病毒后常无明显临床症状，仅表现突然产蛋下降，持续 3 周以上；产蛋下降幅度在 30～50％之间。同时产软壳蛋，蛋壳颜色变浅，畸形蛋可达 10％以上。一旦发病，产蛋率 很难达到高峰或恢复到发病前水平。本病亦无特征性病理变化，因很少发生死亡。因此本病 的诊断主要依靠血清学和病原学方法，同时结合流行病学和临床症状。 (一)血清学诊断：主要包括 HI 抗体和琼扩抗体的测定 1．血凝抑制试验(HI)：除了抗原用 EDS～76 病毒鸭胚尿囊液、阳性对照血清用 EDS76 疫苗高度免疫过的鸡血外，其它所用试剂和操作方法均与鸡新城疫的血清 HI 试验相同。当 被检鸡的 HI 价达 1:16 以上时即可判为阳性。222．琼扩试验：本法即可用于检查病原，又可用于测定抗体。检查病原时先将病料接种 于 10 日龄鸭胚，培养 96 小时后收取鸭胚尿囊液，然后与已知 EDS～76 阳性血清作琼扩反 应，检查抗体时用已培养好的病毒尿囊液作抗原，然后采待捡鸡的血清与抗原作琼扩反应， 琼扩试验时，应有巳知病毒抗原和阳性血清作对照，当对照孔出现沉淀线时，待检孔也出现 了沉淀线．则判为阳性。待检孔不出现沉淀线则为阴性。琼扩试验所用的其他物品及操作方 法与马立克氏病血清琼扩完全一样，可参考马立克氏病琼扩试验一节。 (二)病原学诊断方法：主要是病毒的分离和鉴定。取症状明显鸡的输卵管组织，研碎后 用生理盐水 1:10 稀释；加入青链霉素，然后接种 10 日龄鸭胚或鸡胚成纤维细胞，若鸡胚接 种需培养 96 小时左右，细胞培养则需 72 小时左右。连续盲传 2～3 代；然后作 HA 试验和 HI 试验或琼扩试验对病毒作出鉴定。三、鸡马立克氏病琼脂扩散试验鸡马立克氏病(MD)是由马立克病泡疹病毒引起的一种传染病，以淋巴细胞增生和肿瘤 形成为特征，在鸡的疾病中，马立克氏病是危害最大的疾病之一，鸡群受到感染后，陆续患 病，引起大批死亡．常常给养鸡业带来巨大的经济损失。 国内外用琼脂扩散试验检疫马立克氏病，实际应用表明该法简便易行、毋须特殊设备、 基层兽医单位， 鸡场及养鸡专业户均可采用， 是一种较为理想的诊断检疫马立克氏病的血清 学方法。其具体操作方法如下： (一)试验材料 试验用品 塑料采血管、三棱针、打孔器、滴管、平皿、玻璃棒、烧杯、镊子、蚊子、酒精灯和 带盖瓷盘、琼脂及含 8％氯化钠、PH7.2～7.4 的磷酸盐缓冲液等。 抗原 鸡马立克氏病羽囊抗原的制备：将病鸡皮肤呈现红肿感染处的羽毛从贴近皮肤处剪掉， 剪下带有羽囊的皮肤，称重，加入二倍量的 PH7.2 的磷酸缓冲盐水研磨。-20℃冰结后，再 经 37℃融化，如此反复冰融 4 次。rpm25000 离心 15 分钟，上清液加入 0.01％硫柳汞防腐。 置低温保存备用．马立克氏病羽囊抗原也可向生物药厂购买。 血清 鸡马立克氏病阳性血清的制备：用已知标准马立克氏病羽囊抗原或通过剖检和组织检 查确诊为马立克氏病病鸡群，自病鸡拔下新羽毛若干、剪下羽囊，约 5 毫米长为抗原。由病 鸡群挑选慢性病鸡或康复鸡采取血清。与羽囊抗原作琼脂扩散试验，如出现清晰沉淀线，则 为马立克氏病阳性血清，采血分离血清，加 0.01％硫柳汞防腐、冰结或 4℃保存备用。马立 克氏病阳性血清也可向生物药厂购买。 (二)操作 琼脂板的制备：用含有 8％氯化钠的磷酸缓冲液配制的 1％的琼脂溶液加热溶化后倒入 平皿中，制成 2～3 毫米厚的琼脂板，平置室温凝固。 打孔：用打孔器(直径 2～3 毫米金属小管)按座标纸上面好的七孔图案，照图案固定位 置打 7 个孔，中央打一个孔，孔径为 3 毫米，外围打 6 个孔，孔径为 2 毫米，孔与孔的距离 为 3～4 毫米，如直接以羽囊作试验，则无须打抗原孔。 抗原及血清的添加 l．用标准抗原检测未知抗体(被检鸡血清) (1)用带胶乳头滴管将受检血清顺序逐个地滴加于外周 2、3、5、6 孔内，加入阳性血 清于 1、4 孔内，每加一份受检血清前，必须把吸管充分洗净拭干。 (2)在外围孔滴加受检血清完毕后，用另一滴管向中央孔滴加标准抗原。23(3)加样完毕平板加盖，在室温静止片刻，待加样稍吸附下沉后平放在铺有数层湿纱布 的带盏瓷盘中，置 37℃条件下，进行反应，逐日观察三天，并记录结果。 2．用已知马立克氏病阳性血清检测未知抗原(被检鸡的羽囊） (1）羽囊琼脂扩散试验，用镊子镊取羽囊（约 5 毫米） 。尖端向下，插入抗原孔的位 置上，一处一根，一只鸡用 6 根(见图)；中央孔滴加已知阳性血清。 (2)孔囊浸液琼脂扩散试验：选拔受检鸡含羽囊丰满的羽毛 10 根以上，将带有羽髓的 毛根剪集于三分管内，每管加入 0.5 毫升磷酸缓冲盐水，用玻璃棒将羽毛根压集于管底，以 适当压力转动玻璃棒 10 多次，待浸提液混浊后，用吸管将其移入外周孔内，一个检样滴一 个孔，中央孔滴加巳知阳性血清。 加样完毕后其沉降作用同 1。 (三)判定 1．阳性：如果受检血清内含有马立克氏病特异抗体或受检羽髓内含有马立克氏病特异 抗原，则抗原和抗体孔之间或血清孔与羽囊之间出现一条清晰致密沉淀线，即为阳性，在羽 囊琼脂扩散试验中，一只鸡的 6 根羽囊如有一根出现沉淀线，即判为阳性在羽囊琼脂扩散 2．阴性：当抗原和抗体孔之间或血清与羽囊之间不形成沉淀线者，则判为阴性。 (四)注意事项 1．对剪集的雏鸡羽髓根或羽髓含量较少的羽根，需加少量磷酸缓冲盐水浸提。水量 不宜过多。以防由于稀释而影响反应结果。 2．在滴加已知材料或未知材料时，均以加至平满为宜；过少则降低反应效果；过多 则易出现加样连片。 3．琼脂板孔打毕后，将琼脂板底面在酒精灯上稍微加热封底。 4．在处理和滴加每份受检样品前，必须将玻璃棒和滴管彻底冲洗拭干。 5．处理或使用过的受校样品可放在普通冰箱内，以备必要时复检用，待判定结果无 误时废弃。 6．马立克氏病抗原和血清等诊断试剂需低温保存，以防降低效价。 (五)溶液配制 1． PH7.2 磷酸缓冲液 磷酸缓冲液原液 (1)磷酸二氢钾(KH2P04)9.078 克加蒸馏水至 1000 毫升。 取(1)液 27 毫升 (2)液 73 毫升 氯化钠 8克 2． PH7.2 磷酸缓冲生理盐水(PBS) 取(1)液 27 毫升 (2)液 73 毫升 氯化钠 0.8 克四、鸡传染性腔上囊病琼脂扩散试验鸡传染性腔上囊病（IBD）1957 年首次在美国特拉华洲甘布洛（Gumbro）城发现。 因此又称“甘布洛鸡” ，是鸡的一种病毒性传染病。病鸡表现腔上囊和肠道炎症以及肾脏病 变，主要侵害雏鸡幼龄鸡。本病世界各地均有流行，对雏鸡的培育威胁极大。我国近几年来 本病严重流行，并分离出了该病病毒。 目前，本病检疫诊断较为快速简易、准确特异的方法是琼脂扩散试验，操作方法介 绍如下：241．试验用品 塑料采血管、打孔器、滴管、平皿、烧杯、酒精灯、琼脂、带盖瓷盘、氯化钠、苯 酚、蒸馏水等。 2．抗原 对传染性腔上囊病抗原的制备： 用标准毒力的腔上囊病病毒株鸡体传代腔上囊， 1： 按 4 磷酸缓冲生理盐水（PBS）制成组织匀浆，经口和眼内感染 3～5 周龄易感鸡。每只约 0.2 毫升，接种鸡发病后采取 72 小时的病变腔上囊，加入 PBS 液制成匀浆，使细胞内病毒充分 释放出来。 再以冻融两次裂解， 1000 转/分离心 60 分钟， 取上清液加适量卡那霉素分装， -20℃ 保存，也可向生物药厂购买。 3．血清 检验用的鸡传染性腔上囊病阳性血清的制备：用标准毒株连续三次间隔 10～15 天接 种易感鸡（剂量和方法同上） ，待发病后的恢复期采血测定抗体效价，凡经 1:64 以上稀释仍 与抗原出现明显的沉淀线者为合格，感染鸡由心脏采血，分离血清，-20℃保存，也可向生 物药厂购买。 （二）操作 1．琼脂板的制备（也可用马立克氏病琼扩试验的琼脂板代替） ：琼脂 1 克，氯化钠 8 克，苯酚 0.1 毫升，蒸馏水或无离子水 100 毫升溶化后，用 5.6 NaHCO3 调至 PH6.8～7.2， 将溶化均匀的琼脂倒入干净的平皿，制成厚度 3 毫米的琼脂板，冷凝后加盖置普通冰箱，可 供一周内使用。 2．打孔：用打孔器（直径 2 毫米 和毫米薄壁圆型金属小管） ，在座标纸上画好七 孔图案，把座标纸放在带有琼脂的平皿下面，照图案在空位置打孔，将切下的琼脂吸出或用 针头挑出，外周孔径为 2 毫米，中央孔径为 3 毫米，孔间距 3 毫米，如图所示。 3．抗原及血清的添加：中央孔 7 加入抗原 0.02 毫升。1、4 孔加入阳性血清，2、3、 5、6 孔各加入受检血清，添加至孔满为止，待孔中液体吸干后将平皿倒置，在 37℃条件下 进行反应，逐日观察三天，并记录结果。 （三）判定 阳性：当检验用标准阳性血清和抗原之间有明显致密的沉淀线，或者阳性血清沉淀 线末端向毗邻的受检血清孔内侧偏弯者，此受检血清判为阳性。 阴性：受检血清与抗原之间不形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线向毗邻的受检血 清孔伸直或向其外侧偏弯者，此受检血清判为阴性。 （四）注意事项 1．对琼脂板打孔时，吸出或用针头挑出切下的琼脂，注意不要使琼脂与平皿脱离， 以防止加样后下面渗漏，若琼脂与平皿脱离可在酒精灯上稍稍加热封底。 2．溶化的琼脂倒入平皿时，注意不要产生气泡。 3．受检血清要求不腐败和不溶血，勿加防腐剂和抗凝剂。五、鸡传染性喉气管炎的诊断传染性喉气管炎（ILT）是由病毒引起的鸡的一种急性呼吸道传染病，其特征是病鸡 显现呼吸困难，咳嗽和咳出含有血液的渗出物。病变主要发生在喉头和气管部分，气管粘膜 肿胀，出血和形成糜烂，本病传播很快。死亡率也很高。急性的可以在几天内死亡。或是经 过较长的病程而痊愈。全国各地均有本病流行，危害严重，现将该病诊断方法介绍如下。 1．临床学诊断 临床学诊断对急性病例很有价值， 因为急性病例常有特征症状； 如鼻孔有分泌物和呼吸 时发出湿性罗音。继而咳嗽和喘气，严重病例呈现明显的呼吸困难。咳出带血的粘液，有时25死于窒息。检查口腔时，可见喉部粘膜上有黄色凝固物附着，不易擦去。另外病鸡眶下窦肿 胀，持续性鼻液， 分泌物增加和出血性眼结膜炎，病程继续发展，病鸡迅速消瘦，鸡冠发紫， 有时排绿色稀粪，衰竭死亡。病程 5～7 天或更长。 有些比较缓和的病例，其症状只限于生长迟缓，产蛋减少，流泪，结膜炎，临床不易诊 断。 2．病理学诊断 病鸡有特征病理变化；多见眼睑肿胀，发结膜充血、出血或溃疡，眶下窦肿胀，内有干 酪样物，鼻腔、鄂裂有黄色粘液或干酪样物，部分有出血性粘液；喉头、气管粘膜充血、出 血，有黄色粘液，气管内有条索状干酪样物，血凝块或鲜血，具有诊断意义。 3．检查核内包涵体 在疾病的早期（1～15 天） ，气管或眼结膜组织切片，姬姆萨氏染色，有 57%的病例可 以检查到核内包涵体，借此可以帮助诊断本病，注意在固定时须用较低的 PH 值。 4．动物接种试验 用病鸡的气管渗出物或组织悬浮液，气管内接种（或喉头涂擦接种）易感和免疫的两种 小鸡，假若易感小鸡发病，而免疫过的小鸡不发病，即可证明是本病。 5．鸡胚接种试验 取典型病鸡的喉头、 气管连同分泌物于乳钵内剪碎研磨， 并加 5～10 倍的灭菌生理盐水 稀释后，经灭菌棉花纱布过滤，按每毫升悬液加入青霉素、链霉素各 20000 单位，置冰箱内 作用 4 小时，然后接种于 9～12 日龄鸡胚的绒毛尿囊膜上。每胚 0.1～0.2 毫米，3～5 天鸡 胚死亡，剖检可见绒毛尿囊水肿，增厚，有灰白色的坏死斑和核内包涵体。 另外，将病毒接种于鸡胚肾细胞单层培养基上，24 小时内可检出多核细胞，核内包涵 体和坏死组织所组成的病例，此法也是重要的诊断方法。 6．琼扩试验 此方法具有检出率高、特异性强、快速等优点，方法如下： 高免血清的制备 （1）兔抗传染性喉气管炎高免血清：取六月龄体重五市斤以上健康家兔将差速离心提 纯的抗原液（即传染性喉气管炎病毒鸡胚肾细胞培养物）加等量弗氏完全佐剂抗原，第一次 1 毫升完全佐剂抗原，两后足掌各 0.2 毫升，腹股沟，腹下，颈下部两侧各 0.1 毫升，三周 后，追加差速离心提纯的水剂抗原 1 毫升，三天后再用 G200 提纯的抗原加强免疫，隔天一 次，每次 1.5 毫升，共五次，头两次皮下分点注射。后三次静脉注射，每兔于末次注射后 10 天心脏采血，分离血清分装。 抗血清非特异抗体的吸收： 为了除去非特异性抗体， 于抗血清中加入正常的鸡胚肾细胞 培养液为 3:1 加入，置 37℃水浴。每 10 分钟振摇一次，一小时后转入普通冰箱过夜，次日 以每分钟 4000 转离心沉淀 10 分钟，同法重复处理共二次。 （2）鸡抗传染性喉气管炎高免血清：取 56 日龄健康鸡，先用 G80 株弱毒疫苗作基础 免疫，12 天后气管接种 0.1 毫升毒价为 105 半数鸡胚感染量（EID50）/0.2ml 的 VINELAND 强毒。 四天}