标准的 PCR 反应体系： 10×扩增缓冲液 4 种 dNTP 混合物 引物 模板 DNA Taq DNA 聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至 10ul 各 200umol/L 各 10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L 100ulPCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理 论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为 20bp 左右。 ②引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 ③引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最 好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生 非特异的扩增条带。 ⑤引物 3'端的碱基， 特别是最末及倒数第二个碱基， 应严格要求配对， 以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克 隆很有好处。 ⑦引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度 0.1～1umol 或 10～100pmol，以最低引物 量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且 可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2。5U(指总反应体积为 100ul 时)，浓度过高 可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP 的质量与浓度dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的 缓冲液将其 PH 调节到 7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中， dNTP 应为 50～200umol/L，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同 于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合， 使游离的 Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因 而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶 K 能水解 消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙 醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方 法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取 一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法， 要防止 RNase 降解 RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响， 在一般的 PCR 反应中， 各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时，Mg2+浓度为 1.5～2.0mmol/L 为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR 反应条件的选择 PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温 度点法，双链 DNA 在 90～95℃变性，再迅速冷却至 40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速 升温至 70～75℃， Taq DNA 聚合酶的作用下， 在 使引物链沿模板延伸。 对于较短靶基因(长度为 100～300bp 时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用 94℃变性，65℃左右退火 与延伸(此温度 Taq DNA 酶仍有较高的催化活性)。 ①变性温度与时间： 变性温度低， 解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。 一般情况下， 93℃～94℃ lmin 足以使模板 DNA 变性，若低于 93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影 响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失败。②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至 40℃～ 60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远 高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的 长度。对于 20 个核苷酸，G+C 含量约 50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复 性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm 值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm 值-(5～10℃) 在 Tm 值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高 PCR 反 应的特异性。复性时间一般为 30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ③延伸温度与时间：Taq DNA 聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150 核苷酸/S/酶分子 70℃ 60 核苷酸/S/酶分子 55℃ 24 核苷酸/S/酶分子 高于 90℃时， DNA 合成几乎不能进行。 PCR 反应的延伸温度一般选择在 70～75℃之间， 常用温度为 72℃， 过高的延伸温度不利于引物和模板 的结合。 PCR 延伸反应的时间， 可根据待扩增片段的长度而定， 一般 1Kb 以内的 DNA 片段， 延伸时间 1min 是足够 的。3～4kb 的靶序列需 3～4min；扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增 带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数 循环次数决定 PCR 扩增程度。PCR 循环次数主要取决于模板 DNA 的浓度。一般的循环次数选在 30～40 次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR 技术概论 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、 敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或 某一 DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚 至一个细胞中扩增出足量的 DNA 供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用 PCR 几小 时便可完成。PCR 技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR 技术简史 PCR 的最早设想 核酸研究已有 100 多年的历史，本世纪 60 年代末、70 年代初人们致力于研究基因的体外 分离技术， Korana 于 1971 年最早提出核酸体外扩增的设想： “经过 DNA 变性， 与合适的引物杂交， DNA 用 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆 tRNA 基因”。 PCR 的实现 1985 年美国 PE-Cetus 公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。 其原理类似于 DNA 的体内复制，只是在试管中给 DNA 的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板 DNA， 寡核苷酸引物，DNA 聚合酶，合适的缓冲体系，DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR 的改进与完善 Mullis 最初使用的 DNA 聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段，其缺点是：①Klenow 酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在 37℃下进行，容易 发生模板和引物之间的碱基错配，其 PCR 产物特异性较差，合成的 DNA 片段不均一。此种以 Klenow 酶 催化的 PCR 技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow 酶不耐热，在 DNA 模板进行 热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给 PCR 技术操作程序添了不少困 难。这使得 PCR 技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988 年初，Keohanog 改用 T4 DNA 聚合酶进行 PCR，其扩增的 DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种 DNA 片段。但每循环一 次，仍需加入新酶。1988 年 Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐 热 DNA 聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在 70℃下反应 2h 后其残留活性大于原来的 90%，在 93℃ 下反应 2h 后其残留活性是原来的 60%，在 95℃下反应 2h 后其残留活性是原来的 40%。②在热变性时不会 被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度 (2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶 I Klenow 片段 区别，将此酶命名为 Taq DNA 多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使 PCR 广泛的被应用。 PCR 技术基本原理 PCR 技术的基本原理 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93℃左右一定 时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为 下轮反应作准备；②模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55℃左右， 引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的 作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链 又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万 倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR 的反应动力学 PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增 量可用 Y＝(1＋X)n 计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数，X 表示平(Y)均每次的扩增效率，n 代表循环 次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增 长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活 性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR 扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链 5’ 端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以 一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的 DNA 为模板，引物是从 3’端开始延伸，其 5’端 是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模 板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的 5’端序列是固 定的，这就等于这次延伸的片段 3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以 内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术 倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得 PCR 的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯 DNA 片段供分析 与检测用。 PCR 反应体系与反应条件 标准的 PCR 反应体系： 10×扩增缓冲液 4 种 dNTP 混合物 引物 模板 DNA 10ul 各 200umol/L 各 10～100pmol 0.1～2ugTaq DNA 聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至2.5u 1.5mmol/L 100ulPCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理 论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为 20bp 左右。 ②引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 ③引物碱基： G+C 含量以 40-60%为宜， G+C 太少扩增效果不佳， G+C 过多易出现非特异条带。 ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体， 产生非特异的扩增条带。 ⑤引物 3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导 致 PCR 失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子 克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度 0.1～1umol 或 10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓 度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为 大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul 时)，浓度过高可 引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存 不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.0～7.5， 小量分装， -20℃冰冻保存。 多次冻融会使 dNTP 降解。 PCR 反应中， 在 dNTP 应为 50～200umol/L，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同 于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合， 使游离的 Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化 方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而 溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化 蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或 异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶 解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般 采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓 度为 200umol/L 时，Mg2+浓度为 1.5～2.0mmol/L 为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩 增，浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR 反应条件的选择 PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链 DNA 在 90～95℃变性，再迅速冷却至 40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快 速升温至 70～75℃，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为 100～ 300bp 时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用 94℃变性，65℃左右 退火与延伸(此温度 Taq DNA 酶仍有较高的催化活性)。 ①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下，93℃～ 94℃lmin 足以使模板 DNA 变性，若低于 93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性 有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失败。 ②退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。 变性后温度快速冷却至 40℃～ 60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远 高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的 长度。对于 20 个核苷酸，G+C 含量约 50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复 性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm 值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm 值-(5～10℃) 在 Tm 值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR 反 应的特异性。复性时间一般为 30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ③延伸温度与时间：Taq DNA 聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150 核苷酸/S/酶分子 70℃ 60 核苷酸/S/酶分子 55℃ 24 核苷酸/S/酶分子 高于 90℃时， DNA 合成几乎不能进行。 PCR 反应的延伸温度一般选择在 70～75℃之间， 常用温度为 72℃， 过高的延伸温度不利于引物和模板 的结合。 PCR 延伸反应的时间， 可根据待扩增片段的长度而定， 一般 1Kb 以内的 DNA 片段， 延伸时间 1min 是足够的。3～4kb 的靶序列需 3～4min；扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带 的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数 循环次数决定 PCR 扩增程度。PCR 循环次数主要取决于模板 DNA 的浓度。一般的循 环次数选在 30～40 次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR 反应特点 特异性强 PCR 反应的特异性决定因素为： ①引物与模板 DNA 特异正确的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合 酶合成反应的忠实性及 Taq DNA 聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下 进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守 性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 灵敏度高 PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克 (ug=10-6g)水平。能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU(空 斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为 3 个细菌。 简便、快速 PCR 反应用耐高温的 Taq DNA 聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在 DNA 扩增液和水浴 锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在 2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同 位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板。可 直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的 DNA 扩增检测。 PCR 扩增产物分析 PCR 产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结 论。PCR 产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 凝胶电泳分析：PCR 产物电泳，EB 溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR 产物片段的 大小应与预计的一致，特别是多重 PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。 琼脂糖凝胶电泳： 通常应用 1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科 研及检测分析。 酶切分析：根据 PCR 产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此 法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。 分子杂交：分子杂交是检测 PCR 产物特异性的有力证据，也是检测 PCR 产物碱基突变的有效方法。 Southern 印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针， PCR 产物杂交。 与 此法既可作特异性鉴定， 又可以提高检测 PCR 产物的灵敏度， 还可知其分子量及条带形状， 主要用于科研。 斑点杂交： 将 PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑 点，主要用于 PCR 产物特异性鉴定及变异分析。 核酸序列分析：是检测 PCR 产物特异性的最可靠方法。 PCR 常见问题总结 PCR 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR 循环 条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有 Taq 酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是 染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量 好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定 的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需 注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥 散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对 称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼 脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物 无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释 引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变 质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，浓度过 低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul，应用多大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，一定要模索条 件，否则容易失败。 物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火 温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。 有时还有必要用标准的温度计， 检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、 退火和延伸温度， 这也是 PCR 失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与 模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。 假阳性 出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假 阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 ②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 ③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染， 这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假 阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致， 或大或小， 或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增 带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现 非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设 计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高 退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。 出现片状拖带或涂抹带 PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP 浓度 过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。 ②减少 dNTP 的浓度。③适当降低 Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。 PCR 污染与对策 PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染 即可造成假阳性的产生。 污染原因 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染， 或标本放置时， 由于密封不严溢于容器外， 或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染; 有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 (二)PCR 试剂的污染:主要是由于在 PCR 试剂配制过程中， 由于加样枪、 容器、 双蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染. (三)PCR 扩增产物污染:这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题，因为 PCR 产物拷贝量 大(一般为 1013 拷贝/ml)，远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的 PCR 产物污染，就可造成假阳就可形 成假阳性。 还有一种容易忽视，最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气 溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染. 据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题. (四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室， 这个问题也 比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活 细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。污染的监测 一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止 和消除污染。 对照试验 1.阳性对照:在建立 PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设有 PCR 阳性对照，它是 PCR 反应是否成 功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性 好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100 个拷贝以下)，但阳性 对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一 PCR 试剂经 自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。 2.阴性对照:每次 PCR 实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血 清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。 ②试剂对照:在 PCR 试剂中不加模板 DNA 或 RNA，进行 PCR 扩增，以监测试剂是否污染。 3.重复性试验 4.选择不同区域的引物进行 PCR 扩增 防止污染的方法 (一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制 PCR 反应液、PCR 循环扩增及 PCR 产物的鉴定等步骤分区或分 室进行，特别注意样本处理及 PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR 反应液制备区;③PCR 循环扩增区;④PCR 产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用 紫外线消毒以破坏残留的 DNA 或 RNA。 (二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是 一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次 抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 (三)预混和分装 PCR 试剂:所有的 PCR 试剂都应小量分装，如有可能，PCR 反应液应预先配制好，然后小 量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR 试剂，PCR 反应液应与样品及 PCR 产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。 (四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。 (五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注 意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对 照。 (六)减少 PCR 循环次数，只要 PCR 产物达到检测水平就适可而止。 (七)选择质量好的 Eppendorf 管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管 盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。PCR 常见问题总汇(一） PCR 产物的电泳检测时间 ??一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规则甚致消失。 ??假阴性， 不出现扩增条带 ?? PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的 质量及， ④PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 ??模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有 Taq 酶抑制剂，③模板中蛋白 质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多， 或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有 可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的 消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 ??酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失 或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。 ??引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩 增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条 引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一 个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂 糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一 条引物有条带，一条引物无条 带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位 协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③ 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物 变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。 ?? Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特 异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增 条带。 ??反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul，应用多 大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定， 在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 ??物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极 有可能出 现假阴性;退火温度过低， 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准 的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 PCR 失败的原因之一。 ??靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因 靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。 ??假阳性 ??出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致， 有时其条带更整齐， 亮度更高。 ??引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增 时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短， 容易出现假阳 性。需重新设计引物。 ??靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大 片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小 心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的 物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性 使用。③必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核 酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源 性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生， 可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。 ??出现非特异性扩增带 ?? PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异 性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序 列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过 低，及 PCR 循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现 非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 其对策有：①必要时重新设计引 物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低 引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。④适当提高退火温度或采用二温度 点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。 ??出现片状拖带或涂抹带 ?? PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。 其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引 起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少 dNTP 的浓度。③适 当降低 Mg2+浓 度。④增加模板量，减少循环次数。 ?? PCR 常见问题总汇(二） PCR 产物 ?? 1)克隆 PCR 产物的最优条件是什么？ ??最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比， 摩尔数比 1：8 或 8：1 也行。应测定比值范围。连接用 5ul 2X 连接液, 50ng 质 粒 DNA,1Weiss 单位的 T4 连接酶，插入片段共 10ul。室温保温 1 小时，或 4oC 过夜。在这 2 种温度下，缺 T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温 1 小 时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需 4oC 过夜。 ?? 2)PCR 产物是否需要用凝胶纯化？ ??如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可 能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高 比例的带有引物二聚体的克隆， 而非目的插入片段。 为此需在克隆前做凝胶纯化。 ?? 3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？ ?? A）涂布未转化的感受态细胞。 ??如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型 的菌落。 ?? B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。 ??例如，将 1ug/ul 质粒 1:100 稀释,1ul 用于 100ul 感受态细胞转化。用 SOC 稀释到 1000ul 后，用 100ul 铺板。培养过夜，产生 1000 个菌落。转化率为： 产 生菌落的总数/铺板 DNA 的总量。??铺板 DNA 的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用 10ngDNA，用 SOC 稀释到 1000u 后含 10 ng DNA，用 1/10 铺板，共用 1 ng DNA。转化 率为： ?? 1000 克隆 X10（3 次方） ng /铺板 1 ng DNA ug=10（6 次方）cfu/ ug ??转化 pGEM-T 应用 10（8 次方）cfu/ ug 感受态细胞 ??如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。 ?? C）如用 pGEM-T 正对照，或 PCR 产物，产生&20-40 蓝斑（用指定步骤 10（8 次方）cfu/ ug 感受态细胞） ，表明载体失去 T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA 连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来 源的 T4 DNA 连接酶替换。 ?? D）用 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 载体，连接 pGEM-T 正对照，转化高频率感受 态细胞（10（8 次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得 100 个菌落，其中 60%应为白斑，如产生&20-40 蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。 ?? 4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？ ?? A）连接用室温保温 1 小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需 4oC 过夜。 ?? B）插入片段带有污染，使 3`-T 缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将 插入片段和 pGEM-T 正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需 纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 载体 3`-T 缺失。 ?? C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受 UV 过度照射，时 有发生。UV 过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA 必需重新纯化。 ?? D）带有修复功能的耐热 DNA 聚合酶的扩增产物末端无 A，后者是 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 载体克隆所需。加 Taq DNA 聚合酶和核苷酸可在末端加 A。详情 查 pGEM-T pGEM-T Easy 载体技术资料（TM042） 。 ?? E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片 段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如 SURE 细胞PCR 常见问题总汇(三） PCR 反应体系与反应条件 ??标准的 PCR 反应体系：?? ?? ?? ?? ?? ?? ??10×扩增缓冲液 4 种 dNTP 混合物 引物 模板 DNA Taq DNA 聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至10ul 各 200umol/L 各 10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L 100ul?? PCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模 板和 Mg2+ ??引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模 板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列， 就能按其设计 互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。 ??设计引物应遵循以下原则： ??①引物长度： 15-30bp，常用为 20bp 左右。 ??②引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜， 特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 ??③引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易 出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成 串排列。 ??④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3'端的互补， 否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ??⑤引物 3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以 避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。 ??⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切 位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ??⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物 量： 每条引物的浓度 0.1～1umol 或 10～100pmol，以最低引物量产生所需要的 结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二 聚体的机会。 ??酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需 酶量 2。5U(指总反应体积为 100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过 低则合成产物量减少。 ?? dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应 配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.0～7.5， 小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中，dNTP 应 为 50～200umol/L，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中 任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降 低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。 ??模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度， PCR 成败与否的关键环节 是之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主 要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并 解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶 K 能水解消化蛋 白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它 细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。 一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染 色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰 酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。 ?? Mg2+浓度 Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR反应中， 各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时， Mg2+浓度为 1.5～2.0mmol/L 为宜。 Mg2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶 的活性，使反应产物减少。 ?? PCR 反应条件的选择 ?? PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。 ??温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度 点。在标准反应中采用三温度点法，双链 DNA 在 90～95℃变性，再迅速冷却至 40 ～60℃， 引物退火并结合到靶序列上， 然后快速升温至 70～75℃， Taq DNA 在 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为 100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用 94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度 Taq DNA 酶仍有较高的催化活性)。 ??①变性温度与时间： 变性温度低， 解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。 一般情况下，93℃～94℃lmin 足以使模板 DNA 变性，若低于 93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失败。 ??②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。变性 后温度快速冷却至 40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引 物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。 退火温度与时间， 取决于引物的长度、 碱基组成及其浓度， 还有靶基序列的长度。 对于 20 个核苷酸，G+C 含量约 50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为 理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： ?? ?? Tm 值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm 值-(5～10℃)??在 Tm 值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特 异性结合， 提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为 30～60sec，足以使引物 与模板之间完全结合。 ??③延伸温度与时间：Taq DNA 聚合酶的生物学活性： ?? ?? ?? ?? 70～80℃ 150 核苷酸/S/酶分子 70℃ 60 核苷酸/S/酶分子 55℃ 24 核苷酸/S/酶分子 高于 90℃时， DNA 合成几乎不能进行。?? PCR 反应的延伸温度一般选择在 70～75℃之间，常用温度为 72℃，过高的 延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的 长度而定，一般 1Kb 以内的 DNA 片段，延伸时间 1min 是足够 的。3～4kb 的靶 序列需 3～4min；扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增 带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。PCR 应用中存在的问题开展 PCR 应具有一定的条件。需要一个正规的 pCR 实验室，采集标本、核 酸提取、扩增及产物分析应在不同的房间进行；需有严密的防污染措施、假阳性 和假阴性结果的质控等。实验者应具有一定的分子生物学理论知识及实验技能， 能够及时发现和纠正实验中的问题。目前，我国在 PCR 应用中尤其是在临床诊 断中存在问题较多，主要表现为： PCR 试剂的考核、审查工作薄弱，许多单位 实验条件不符合要求，部分操作人员的理论和实验知识水平较低。 PCR 的应用 范围过宽等，因此造成 PCR 实验结果的可靠性差，出现较多的假阳性、假阴性 结果。 ??一、假阳性： ??实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。 如果一次实验中的几个 阴性对照中出现一个或几个阳性结果， 提示本次实验中其它标本的检测结果可能 有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染 等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、 DNA 抽提 仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。预防措施：(1)工作区隔离。(2)改进 实验操作，如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用前高压处理、试剂分 装成小份一次使用后弃去等。(3)操作程序合理化，如后加阳性对照等。 ??交叉污染的处理方法： 交叉污染指扩增产物对将要扩增的样品或反应管的 污染。由于 PCR 的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应 管即可出现假阳性。交叉污染的处理方法包括 [1] ： ?? 1 ．在 DNA 模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的 PCR 产物。一般选用波长 254nm 照射 30min （ Nature ， 1990 ， 34:27 ） ?? 2 ． PCR 实验中使用 dUTP ，而不用 dTTP 。在扩增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase （尿嘧啶糖基化酶）处理可降解交叉污染的 PCR 产物，而不降解 基困组 DNA 模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应（ Gene ， 1990 ， 93 ： 125 ） 。美国 PE 公司提供此类试剂盒（ PCR carry-over preventionkit 。 ?? 3 ．在 PCR 反应前加入一种光化学试剂，反应完成后激活该试剂，光化学 试剂可交联 DNA 链，使之不能再扩增（ Nucleic Acids Res ， 1991 ， 19 ： 99 ） 。 ??二、假阴性：??如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果， 提示本次实验中可能有假 阴性结果。但这里应注意，许多国产 PCR 试剂盒中阳性对照采用质粒 DNA ，和 标本相比来说，不需纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取步骤 有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可能有假阴性。 ??造成假阴性的原因包括: (1) DNA 抽提过程不当。 (2) DNA 样品中含有 Taq 聚合酶抑制剂，如尿素、 DMSO 、 SDS 等物质，可抑制 Taq 酶活性， DNA 样 品中的蛋白质和重金属离子等亦影响 Taq 酶活性，尤其是含有较多脓液或分泌 物的标本，其中虽有待查菌，但却因标本处理不当而出现假阴性 [2] 。 ??设置内对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中加入内对照，若 内对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。 ??三、PCR 产物的鉴定 ?? PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳可判断其长度是否为预期的长度，但只有通 过杂交试验或序列分析等才能判断其特异性。严格说来， PCR 产物均应通过实 验证实其特异性。在我国一些科研论文和临床检测中缺乏这一环节。 ??综上所述， PCR 具有其优点，但也有不足之处，它是一种很好的科研手段， 但作为常规诊断方法尚需进一步改进和提高 [9] 。目前的关键问题是如何正确 应用 PCR 。虽然 PCR 尚未在包括美国等发达国家作为常规诊断方法，但如果具 备开展 PCR 需要的条件， PCR 是可作为辅助诊断手段使用的。目前，只有针对 PCR 应用中存在的问题，采取措施，正确应用 PCR ，才能使这一技术在科研和 临床工作中发挥应有的作用。PCR 实用技巧 增加 PCR 的特异性： ?? 1. primers design ??这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退 火的引物要符合下面的 一些条件 ?? a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样 会降低特异性,并且降低产量 ?? b. GC% 40%~~~~60%c. 5'端和中间序列要多 GC,以增加稳定性 ?? d. 避免 3'端 GC rich, 最后 3 个 BASE 不要有 GC,或者最后 5 个有 3 个不要 是 GC ?? e. 避免 3'端的互补, 否则容易造成 DIMER f. 避免 3'端的错配 g. 避免内部形成二级结构 ?? h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到 5'端, 在算 Tm 值时不算, 但在检测互补和二级结构是要加上它们 ?? i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在 3' 端使用兼并引物,并使用 较高的引物浓度(1uM-3uM) ?? j. 最好学会使用一种 design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.??* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm） 。这是当 50％的引物和互补序列 表现为双链 DNA 分子时的温度.Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的。在理想状态 下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以 减少非特异性结合。合理的退火温度从 55℃到 70℃。退火温度一般设定比引物 的 Tm 低 5℃。 ?? 设定 Tm 有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于 18 碱 基的引物。 ?? 有的是根据 GC 含量估算 Tm。确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法。这 种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算 机程序使用近邻分析法。 ??根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm 会差异很大。因为大部分公式提 供一个估算的 Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提 高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的 Tm5℃，以 2℃为增量，逐步 提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。 ?? 为获得最佳结果，两个引物应具有近似的 Tm 值。引物对的 Tm 差异如果超 过 5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果 两个引物 Tm 不同，将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5℃??或者为了提高特异性， 可以在根据较高 Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环， 然后在根据较低 Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件 下可以获得目的模板的部分拷贝。 ?? 2. stability of primers ??定制引物的标准纯度对于大多数 PCR 应用是足够的。 ??引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。 最好在 TE 重溶引物，使其最终浓度为 100μM。TE 比去离子水好，因为水的 pH 经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和 溶解的引物储存在-20℃。 以大于 10μM 浓度溶于 TE 的引物在 -20℃可以稳定保 存 6 个月，但在室温（15℃到 30℃）仅能保存不到 1 周。干粉引物可以在-20℃ 保存至少 1 年，在室温（15℃到 30℃）最多可以保存 2 个月。 ?? 3. optimize reactants concentration ?? a. magnesiom ions ?? Mg 离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用 并能影响 Polymerase 的活性，一般的情况下 Mg 的浓度在 0.5-5mM 之间调整，同样要记住的是在调整 了 dNTPs 的浓度后要相应的调整 Mg 离子的浓度，对实时定量 PCR，使用 3 到 5mM 带有荧光探针的镁离子溶液 ?? b. 其他的离子 ?? NH4+ K+都会影响 PCR，增加 K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基 团的负电荷而退火的温度,从而降低了 PCR 的 严谨性(stringency)， NH4+也有相 同的作用. MBI 公司的 TAQ 酶就提供了两种 BUFFER, 一种是加 Mg 的一种是已经 混合了(NH4)2SO4 的，当然, 过高的阳离子浓度(KCL&0.2M)时, DNA 在 94 度根本 不会发生变性, 当然也就无从谈起 PCR 了. ?? c. polymerase ??不同公司的酶效有所不同,需要 operator 自己掌握适合的酶的浓度， 一些高 保真没的效率要远远低于 Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情况下, 变性的温度可以使用 90~92 度, 变性的时间也可以缩短, 从而保证 polymerase 的活性 ?? d. template?? 50ul PCR SYSTEM ??================================ ?? human gDNA 0.1ug-1ug ?? E.Coli 10ng-100ng ?? LamadaDNA 0.5ng-5ng ?? Plasmid DNA 0.1ng-10ng ??================================ ?? 4. termperature ?? a. denaturation ??常规是 94 度 5 分钟, GC Rich 的摸板是 95 度 5 分钟 ??除了 GC Rich 外, 常规的 APPLICATIONS 可以将这部分时间缩短到 1 到 2 分 钟, 或者在 CYCLE 1 时给予较长的时间,而取消开始的 denaturation ?? b. annealing ??重点到了：一般情况下, 是从 55 度开始.根据情况配合以 Mg 离子浓度进行 调整. 有条件的可以做 gradient pcr. 退火的时间在 30-60S, 时间短一些可以 得到更好的效果. 因为, polymerase 在 annealing temp.时也会有一些活性. 所以在 A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险，另外,在对于一些 困难户, 比如从 gDNA 里扩增大片段, 还可使用 two step PCR. ?? 5. touchdown PCR ??原理很简单,但的确是一个很有用的方法。举个例子，ANNEALING TEMP. 55 度 ?? 94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s ?? 72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s ?? 51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s ?? 72 1min 20cycles 72 5min ?? 6. hot start PCR ?? 热启动 PCR 是除了好的引物设计之外， 提高 PCR 特异性最重要的方法之一。 尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此， 在进行 PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引 物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如 site-directed 突变、表达克隆 或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动 PCR 尤为有效。 ?? 限制 Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR 反应液，并将其置 于预热的 PCR 仪。这种方法 简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不 能完全消除非特异性产物的扩增。 ?? 热启动通过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成，直到 PCR 仪达到变性温度。 包括延缓加入 Taq DNA 聚合 酶，在反应体系达到 90 度时，PAUSE，将温度保持 在 70 度以上，手工加入 polymerase，但这个方法 过于烦琐， 尤其是对高通量 应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本 成分，入 镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在 热循环时， 因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这 样的酶。 ??======================= ?? ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer) ?? Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega) ?? Magnesium wax beads (Stratagene). ??========================= ??象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通 量应用。 ??还有一种方法是使用 inactive DNA Polymerase. polymerase 被抗体抑制失 活，当变性温度超过 70 度时，抗体也变性了，这样 polymerase 又被激活了。 ?? 7. Booster PCR ??我们知道 1ug human genomic DNA 大约在 3X10 5 幂个模板分子,这样的模 板分子数目可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,比如低于 100 个 分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体. 这样就有来了个 booster PCR 我一直找不到合适的词来翻译这个 booster. ??具体是这样的.开始几个 cycles 保持 primer 的低浓度,保证 primer:template 的 molar ratio 在 10 7~ 10 8. 以确保开始扩增的准确性.然后 booste Primer 的浓度到正常的水平 ?? 8. 循环数和长度 ?? 确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数. 因为过多的循环数容易造 成 ERRORS 和非特异性产物的积累 产物的量不够, 优 化的方法有: ?? 1. 增加 TEMPLATE ?? 2. 增加循环数 ?? 如何确定循环数,有一个方法. ?? 做一个 PCR 体系,40 循环,50ul, 分别在 20,25,30,35 循环时从体系中取 5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数 ??另一个会影响 PCR 特异性的是 PCR cycling 时在两个温度间变化的速率 (ramping rate).当然是越高 越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台 PCR 仪,也没有多少挑选的余地 ?? 9. thermal cycler ?? PCR 仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整 PCR 仪,以保证 其能够到达正确的温度.现在的 PCR 仪基本上都有自检功能(self-diagnosis). ?? 10. PCR additives ?? 附加物或者说 enhancer 实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反 应退火效率的化学因子, DNA 结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加 引物退火特异性,减少错配, 增加产物的长度和产量. ??在 GC Rich 情况中, additive 可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩 增的效率.而在另一种情况下,additive 由于造成错配的 primer-template 复合 物的极大的不稳定, 而提高了扩增的忠实性.要注意的是,没有万能的 enhancer 全部通用,需要你根据自己的情况,最好结合 gradient pcr 选择最优条件.聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的 PCR 由（1）高 温变性模板； （2） 引物与模板退火； （3） 引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的 DNA 得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板 DNA 置高温下（通常为 93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷 酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合， 两个引 物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的 DNA 聚合酶（Taq 酶）在 72℃将单核苷酸从引物的 3’端开始掺入，以目的基因为模板从 5’→3’方向延 伸，合成 DNA 的新互补链。 ?? PCR 能快速特异扩增任何已知目的基因或 DNA 片段，并能轻易在皮克（pg） 水平起始 DNA 混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性 DNA 片段。因此，PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。 它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组 体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断， 肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR 在分子克隆和 DNA 分析中有 着以下多种用途： ??(1) 生成双链 DNA 中的特异序列作为探针； ??(2) 由少量 mRNA 生成 cDNA 文库； ??(3) 从 cDNA 中克隆某些基因； ??(4) 生成大量 DNA 以进行序列测定； ??(5) 突变的分析； ??(6) 染色体步移； ??(7) RAPD、AFLP、RFLP 等 DNA 多态性分析等。 ??一、试剂准备 ?? 1. DNA 模版 ?? 2．对应目的基因的特异引物 ?? 3．10×PCR Buffer ?? 4．2mM dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM ?? 5．Taq 酶 ??二、操作步骤 ?? 1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌 0.5ml 离心管中。 ?? 10×PCR buffer 5 μl?? dNTP mix （2mM） 4 μl ?? ?? 引物 1（10pM） 2 μl 引物 2（10pM） 2 μl?? Taq 酶 （2U/μl） 1 μl ?? DNA 模板（50ng-1μg/μl） ?? 加 ddH2O 至 50 μl ?? 视 PCR 仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 ?? 2． 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置 PCR 仪上，执行扩 增。 一般： 93℃预变性 3-5min， 在 进入循环扩增阶段： 93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环 30-35 次，最后在 72℃ 保温 7min。 ?? 3． 结束反应，PCR 产物放置于 4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 ?? 4．PCR 的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用 100μl 氯仿进行抽提 反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取 5-10μl 电泳检测。 ??三、PCR 反应体系的组成与反应条件的优化 ?? PCR 反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer） 、脱氧核苷三磷酸底物 1 μl（dNTPmix） 、耐热 DNA 聚合酶（Taq 酶） 、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2） 、 靶序列（DNA 模板）五部分组成。各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。 ?? 1． 反应缓冲液：一般随 Taq DNA 聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl， 10mM Tris-HCl（pH8.3 室温） ，1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产 量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各 种单核苷酸浓度为 200μM 时，Mg2+为 1.5mM 较合适。若样品中含 EDTA 或其它螯 合物，可适当增加 Mg2+的浓度。在高浓度 DNA 及 dNTP 条件下进行反应时，也必 须相应调节 Mg2+的浓度。据经验，一般以 1.5-2mM（终浓度）较好。 ?? 2． dNTP ：高浓度 dNTP 易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过 低，将降低反应产物的产量。PCR 中常用终浓度为 50-400μM 的 dNTP。四种脱氧 三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时 （偏高或偏低） ，就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延 伸反应。此外，dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。因此，dNTP 的浓 度直接影响到反应中起重要作用的 Mg2+浓度。?? 3． Taq DNA 聚合酶酶：在 100μl 反应体系中，一般加入 2-4U 的酶量，足 以达到每 min 延伸
个核苷酸的掺入速度。 酶量过多将导致产生非特异 性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对 PCR 反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积 时（如 20μl 或 50μl） ，一般酶的用量仍不小于 2U，否则反应效率将降低。 ?? 4． 引物：引物是决定 PCR 结果的关键，引物设计在 PCR 反应中极为重要。 要保证 PCR 反应能准确、特异、有效地对模板 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵 循以下几条原则： ??? 引物的长度以 15-30bp 为宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］ 。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分 布应表现出是随机的。 ??? 引物的 3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两 个引物在 3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大 程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于 5 个，引物自身配 对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过 3 个由于影响引物设计的因素比较 多，现常常利用计算机辅助设计。 ??? 人工合成的寡聚核苷酸引物需经 PAGE 或离子交换 HPLC 进行纯化。 ??? 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体 （primer-dimer） ，二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生 非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一 般用 0.25-0.5pM/μl 较好。 ??? 引物一般用 TE 配制成较高浓度的母液（约 100μM） ，保存于-20℃。使 用前取出其中一部分用 ddH2O 配制成 10μM 或 20μM 的工作液。 ?? 5． 模板：PCR 对模板的要求不高，单、双链 DNA 均可作为 PCR 的样品。虽 然 PCR 可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的 DNA）作为摸板，但为了保 证反应的特异性，一般还宜用μg 水平的基因组 DNA 或 104 拷贝的待扩增片段作 为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可 用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白，将可能干扰 PCR 反应。?? 6． PCR 循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特 异性。 ??四、注意事项 ??１．PCR 反应应该在一个没有 DNA 污染的干净环境中进行。最好设立一个专 用的 PCR 实验室。 ??２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够 得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。 ??３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 ??４．PCR 试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用 0.22μm 滤膜过滤除 菌或高压灭菌。 ??５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使 用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。 ??６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿 应洗涤干净并高压灭菌。 ??７．PCR 的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。增加 PCR 特异性 1、 引物设计 细心地进行引物设计是 PCR 中最重要的一步。 理想的引物对只同目的序列两 侧的单一序列而非其他序列退火。 设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序 列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： ?? 1.典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并 降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于 24 核苷的引物并不意 味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而 且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 ?? 2.选择 GC 含量为 40％到 60％或 GC 含量映像模板 GC 含量的引物。 ?? 3.设计 5'端和中间区为 G 或 C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目 的序列杂交的稳定性。 ?? 4.避免引物对 3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。?? 5.避免 3'末端富含 GC。 设计引物时保证在最后 5 个核苷中含有 3 个 A 或 T。 ?? 6.避免 3'末端的错误配对。 3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 ?? 7.避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。 ??目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引 物 5'端而不影响特异性。当计算引物 Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其 进行互补性和内部二级结构的检测。 ??有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序 列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性 的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物 的碱基使用偏好，减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退 火温度。不要在引物的 3'端使用兼并碱基，因为 3'端最后 3 个碱基的退火足以 在错误位点起始 PCR。使用较高的引物浓度（1μM 到 3μM） ，因为许多兼并混合 物中的引物不是特异性针对目的模板。 ?? 2、引物退火温度 ?? 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm） 。这是当 50％的引物和互补序列 表现为双链 DNA 分子时的温度。Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的。在理想 状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高， 以减少非特异性结合。合理的退火温度从 55℃到 70℃。退火温度一般设定比引 物的 Tm 低 5℃。 ?? 设定 Tm 有几种公式。表 4 列出确定引物 Tm 最常用的两种方法。第一个 公式来源于高盐溶液中的杂交， 适用于小于 18 碱基的引物。 第二个公式根据 GC 含量估算 Tm。确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级 结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。 大部分计算机程序使用近邻分析 法。 ?? 根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm 会差异很大。因为大部分公式 提供一个估算的 Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步 提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的 Tm5℃，以 2℃为增量，逐 步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为 引物对的 Tm 差异如果超过 5℃， 获得最佳结果， 两个引物应具有近似的 Tm 值。就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。 如果两个引物 Tm 不同，将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5℃。或者为了提高特异性，可以 在根据较高 Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环，然后在根据较低 Tm 设计的退 火温度进行剩余的循环。 这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷 贝。 ?? 3、递减 PCR ?? 递减 PCR 通过在 PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循 环开在比估算的 Tm 高大约 5℃的退火温度下开始， 然后每个循环降低 1℃到 2℃， 直到退火温度低于 Tm 5℃。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物 在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。递减 PCR 对 于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法较为有用，如 AFLP DNA 指纹 分析。 ?? 4、引物浓度 ?? 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在 0.1 到 0.5μM。较高的 引物浓度会导致非特异性产物扩增。 ?? 为了确定引物浓度，可以在 260nm（OD260）测量光密度值。然后使用光 吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD） ，通过 Beers 法则（公式 1）计算引物 浓度。微摩消光系数可以使用公式 2 计算。与大分子双链 DNA 可以使用平均消 光系数不同， 确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。 这是因为引物较短， 碱基组成差异很大。在 Gibco/BRL 定制引物的质检报告中包含了消光系数（OD/ μmol）和消光系数的倒数（μmol/OD） 。另外，不要使用寡聚核苷酸作为标准， 在 EB 染色的胶上估算引物浓度，因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差 异很大。 ?? 5、引物纯度和稳定性 ?? 定制引物的标准纯度对于大多数 PCR 应用是足够的。 因脱盐而除去的苯甲 酰基和异丁酰基很少，因此不会干扰 PCR。部分应用需要纯化，以除去在合成 过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为 DNA 合成化学的效率不 是 100％。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使 DNA 从 3'到 5'合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于 50 个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。 ?? 引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。 Life Technologies 以一个最 小 OD 单位确保总寡核苷的产量。定制引物以干粉形式运输。最好在 TE 重溶引 物，使其最终浓度为 100μM。TE 比去离子水好，因为水的 pH 经常偏酸，会引 起寡核苷的水解。 ?? 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大 于 10μM 浓度溶于 TE 的引物在-20℃可以稳定保存 6 个月，但在室温（15℃到 30℃）仅能保存不到 1 周。干粉引物可以在-20℃保存至少 1 年，在室温（15℃ 到 30℃）最多可以保存 2 个月。 ?? 6、热启动 ?? 热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之 一。尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72℃，聚合酶在室温仍然有活性。 因此，在进行 PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火 温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。 在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如 site-directed 突变、表 达克隆或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动 PCR 尤为有效。 ?? 限制 Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR 反应液，并将其 置于预热的 PCR 仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并 不能完全消除非特异性产物的扩增。 ?? 热启动通过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成， 直到 PCR 仪达到变性温度。 包括延缓加入 Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是 对高通量应用。 其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分， 入镁离子或酶， 包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因 蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层 法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。 ?? Platinum DNA 聚合酶对于自动热启动 PCR 来说方便高效。Platinum Taq DNA 聚合酶的成分为复合有抗 Taq DNA 聚合酶单克隆抗体的重组 Taq DNA 聚 合酶。 抗体在 PCR 配制， 以至于在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。 DNA Taq 聚合酶在变性步骤的 94℃保温过程中被释放到反应中，恢复了完全的聚合酶活性。 同经化学修饰用于热启动的 Taq DNA 聚合酶相比， Platinum 酶不需要在 94℃ 延时保温 （10 到 15 分钟） 以激活聚合酶。 使用 PlatinumTaq DNA 聚合酶， 94℃ 在 进行 2 分钟就可以恢复 90％的 Taq DNA 聚合酶活性。 ?? 7、镁离子浓度 ?? 镁离子影响 PCR 的多个方面，如 DNA 聚合酶的活性，这会影响产量；再 如引物退火，这会影响特异性。dNTP 和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需 要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是 包含 200μM dNTP 的典型 PCR 起始浓度是 1.5mM（注意：对实时定量 PCR， 使用 3 到 5mM 带有荧光探针的镁离子溶液） 。较高的游离镁离子浓度可以增加 产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从 1mM 到 3mM，以 0.5mM 递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使 用 Platinum Taq DNA 聚合酶。Platinum Taq DNA 聚合酶能够在比 Taq DNA 聚合 酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化. ?? 8、促进 PCR 的添加剂 ?? 退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性 的扩增，但是，某些模板，包括高 GC 含量的模板，需要其他的措施。影响 DNA 熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。 为获得最好的 结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR 添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及 PCRx Enhancer Solution 可以 增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助 DNA 聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution 还有其他优点。在同 Platinum Taq DNA 聚合酶和 Platinum Pfx DNA 聚合酶一起使用时，仅需很少的镁离子优化。 这样，将 Platinum 技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制 Taq DNA 聚合酶的 DMSO，甲酰胺和甘油。 ??增加 PCR 特异性（五） ?? 9、巢式 PCR ?? 使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是 15 到 20 个循环的标准扩增。 将一小部分起始扩增产物稀释 100 到 1000 倍加入到第二轮扩增中进行 15 到 20 个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进 行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶 序列结合。巢式 PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物 都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的三、 扩增产物拖尾 有时扩增产物电泳后出现一个个萤光团 （Smear 现象） 或出现一连串的条带， 这些种现象主要与以下几种因素有关： ⒈ 扩增系统不完善：这种现象表明出现非特异性扩增， 而产生非特异性扩增与扩增系统中镁离子 浓度、引物浓度、DNTP 浓度有密切关系，需认真调整以期避免这种现象出现。 另外也可以适当提高退火温度，从而提高扩增特异性。 ⒉ 模板处理方法不完善：PCR 扩增技术的原理虽然非常简单，但这一技术的合理应用是极其复杂的， 如对 PCR 主要成分之一 DNA 聚合酶的影响因素很多， 这些因子是怎样作用于聚合 酶，其作用机制至今仍不清楚，因此对样本处理不当不妥可能抑制扩增，也可能 导致非特异扩增。一般分泌物样本，应取脱落细胞为主，避免采集过多的脓性分 泌物，痰液样本一定要充分液化，等等。 ⒊ 引物设计不合理：引物设计应遵循以下几个原则。首先，引物一般应由 15-30 个 BP 组成；其 次，引物中碱基应是随机分布，不能有一串相同碱基或出现其它不常见结构；第 三， 碱基含量应在 45-55％左右； GC 第四， 两个引物在 3′未端不能出现同源性。 其中以引物与基因组之间的同源性是产生非特异性扩增的最主要原因， 而我们一 般在设计引物时往往只了解其基因组中的某一段序列， 因此我们必须充分利用这 些资料巧妙地设计出一组合理的引物，并通过反复比较、证实，最后才能确定其 能否用于检测。 四、 产物电泳单萤光带及多萤光带一般 PCR 扩增后，对扩增结果的判断最 简单的方法是， 琼脂糖电泳， 溴乙淀染色， 320nm 的紫外激发观察其萤光条带， 在如果有明显和特异性扩增产物， 就会在电泳平板预期的位置出现一条清晰的萤光 亮带，按标准扩增系统配制的反应液，其引物浓度在 0.1-0.5mM，一般经 30 个 循环扩增后，仍有相当数量的游离引物存在，因此在电泳平板就有一条 20BP 左 右（电泳速度较快）的淡淡的引物萤光带，这样每次电泳结果就有两条荥光带， 一条在前面的，每个点样样本都有的引物带。 引物设计相当重要，由于基因组有庞大数量的 DNA 序列，除了特异性的扩增 外，往往很容易产生非特异性产物。如果引物与基因组存在较广泛的同源性，那 么就会出现严重的非特异性扩弗，引物不仅与特异性的扩增区域结合，而且也与 其它区域发生一系列非特异性结合，而选择引物时，常须考虑敏感性问题，特别 是临床检验试剂盒，为了能把少至几个病原体检出，我们大都采用在病原体基因 组中重复出现的 DNA 序列设计引物，如果这些重复序列没有严格的同源性，就在 可能出现不同长度的扩增产物而出现多条带扩增。 病原体变异，与前面所述一样，我们为得高敏感性经常使用具有重复序列的 基因作为引物设计的区段，在有些病原体，比如结核杆菌在治病过程中，会发生 严重畸变，也包括其遗传物质的变化，出现染色体的缺失、不等位交换、其它序 列的插入等。如果这些缺失与不等位交换正好发生在我们所选择的扩增序列上， 也会出现不同长度的扩增产物，从而产生多条扩增产物带。 PCR 基因扩增技术简单易行，应用日趋广泛，但其影响因素很多，在实践 过程中时常现现这样或那样的问题，甚至得不到预期的结果，或出现无法解释的 现象。诚然，近年来在大量科学工作者的共同努力下，取得了许多宝贵的经验， 使这一技术日趋完善，毕竟 PCR 是一项近几年才出现的新技术，许多问题至今 仍然不能得到很好地解释或解决。想信随着对 PCR 的深入研究，在 PCR 的应用 过程中不断总结经验，PCR 这一新技术将会为人类的发展作出更大的贡献。在 PCR 的优化开始阶段，应用新的 DNA 模板，引物或热稳定 DNA 聚合酶等材 料建立的 PCR 方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种 PCR 反应通常要求尽量 抑制非特异性扩增和（或）增加目的 DNA 产物的产率。表 1 列举了一些通常遇到 的问题和对 PCR 反应进行优化的一些推荐方法。??表 1 PCR 扩增的疑难解析 ??问题 解释 补救措施 ??目的产物条带在两种阳性对照管与试验管内部呈现明显的非常模糊的带型。 目的产物条带有时呈不清晰的成片条带， 条带在凝胶中扩散到较期望分子量更小 的 DNA 分子量的区域内。 无效引导或无效延伸 通过建立两个引物不同浓度的 PCR 系列试验，从中发现两个引物的最适浓度；通过建立降落 PCR 系列试验，摸 索最佳镁离子浓度的水平。 ??应用 GC-Melt（Clonte-CH）PCR 反应混合液。 ??应用尽可能低的复性温度（即退火温度）考虑添加佐剂，如在反应体系中加 牛白蛋白（0.2~0.6mg/ml），二甲基亚砜（5%）或甘油（5%） ??目的产物条带在阳性对照管 2 与试验管内呈现非常模糊的带型， 而在阳性对 照管 1 内却又很强的条带。 模板 DNA 不纯。 重新纯化模板 DNA，用酚：氯仿抽 提两次，乙醇沉淀回收。纯化后的 DNA 样品溶解于水中（不含 EDTA）。 ??在阴性对照管扩增出目的条带。 盛模板 DNA 的塑料器具溶解模板 DNA 的溶 液污染所致。 重新配置新的试剂。 ??扩增产物呈现明显的分子质量错误的条带。 根据一条或两条引物的非特异 性引导。 缩短复性时间或增加复性温度。 ??扩增目的产物 DNA 呈现模糊的广泛的成片条带。 要么为引物二聚体所致的 扩增；要么为模板 DNA 过量。 检查引物是否均一及模板 DNA 序列内是否具有高 度重复序列存在。优化每条独立引物的浓度。 ??应用降落 PCR 和（或）热启动 PCR。降低模板 DNA 的量。 ?? ??对可能发生在 PCR 过程中的主要问题的解析 ??表 2 描写在 PCR 扩增反应中可能遇到的一些问题以及提供怎样解决这些问题 的一些方法。 ??表 2 多种 PCR 扩增过程的一些疑难问题的诊断与解决方法 ??症状 可能原因 补救措施 ??扩增的目的产物条带较弱或不能检测到相应的条带。 试剂不合格；PCR 仪 有故障；扩增程序设置错误。 在两台不同的 PCR 仪上用新鲜购买的试剂与老的试剂分别进行 PCR，比较其扩增产物结果。 ??复性条件不是最合适的。 重新计算引物 Tm；应用降落 PCR，最好再结合热 启动 PCR。 ??验证引物浓度， 如果必要可优化引物的浓度； 若引物显然是问题的症结所在， 重新设计合成新的引物。 ??被复性结合到模板上的引物不适合延伸。 优化 MgCl2、模板 DNA 和 dNTP 的 浓度；试验此 PCR 的 pH 值的范围；考虑用 N-三甲基甘氨酸、N,N-二羟乙基甘氨 酸或 EPP 等具有更低温度变异系数的化学物质替代 Tris（Cheng et al. 1994）。 ??应用新鲜制备的热稳定 DNA 聚合酶。 ??重新纯化模板 DNA 以去除抑制物。 ??在恒定复性温度（55℃）条件下增加 PCR 循环数。 ??如果问题依然存在，添加增强剂（如 10%二甲基亚砜，5% PEG6000 或 10%甘 油）。 ??如果问题依然存在，用首次扩增的 PCR 产物进行 1：100 稀释后作为模板， 再加入新的 PCR 缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行 30 个循环的第二次 PCR 扩增；或者进行嵌套式 PCR 扩增。 ??应用 GC-Melt（CLONTECH）PCR 反应混合液。 ??变性不完全。 增加变性的时间或者设置更高的变性温度。 ??两个引物之间的距离太大。 应用那些能够扩增大 DNA 片段的热稳定 DNA 聚 合酶。 ??多种扩增产物条带 应用降落 PCR，最好再结合热启动 PCR 或加强 PCR （booster PCR）。 ??优化 MgCl2、模板 DNA、热稳定 DNA 聚合酶及 dNTP 的浓度。 ??用首次扩增的 PCR 产物进行 1：100 稀释后作为模板，再加入新的 PCR 缓冲 液与引物在恒定复性温度条件下进行 30 个循环的第二次 PCR 扩增；或者进行嵌 套式 PCR 扩增；或者从凝胶上切割目的条带作模板重新进行 PCR 扩增。 ??确证引物的浓度，如果必要，可优化引物的浓度；若问题仍然存在，重新设 计合成引物。??引物二聚体过量 应用降落 PCR，最好再结合热启动或加强 PCR（booster PCR）；若问题仍然存在，重新设计合成引物，要特别注意引物 3’末端的序列。反向 PCR 方法程序 描述一种大聚合酶链反应(PCR)应用的方法，使在已知序列的核心区边侧的 未知 DNA 成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的 DNA，以产生适 合于 PCR 扩 增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR 的引物 同源于环上核心区 的末端序列，但其方向性，使链的延长经过环上的未知区而 不是分开引物的核心区。 这种反向 PCR 方法可用于扩增本来就在核心区旁边的 序列，还可应用于制备未知序列 探针或测定边侧区域本身的上、下游序列}