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设计一种从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌的试验方案,并解释主要步骤的基本原理.
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C源用淀粉然后用高温培养(不能让淀粉糊化) 1.C源用淀粉选择只能利用淀粉的微生物(其中就含淀粉酶)2 高温 选择出能在高温下利用淀粉的可能还有细节 不过大体思路就是这样的
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设计一种从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌的实验方案，并解释主要步骤
设计一种从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌的实验方案，并解释主要步骤的基本原理
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答5.6 菌种筛选方法 所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。 为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。因为诱变育种中的筛选工作最复杂，所以，本节主要讨论诱变育种的筛选方法，这些方法也为其它育种方法的筛选提供了借鉴。 5.6.1菌种筛选方案 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。 5.6.2 菌种筛选的手段 筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求，对于初筛，要力求快速、简便，对于复筛，应该做到...
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工业微生物产生菌的分离筛选（一）
工业微生物产生菌的分离筛选（一）
来源：互联网
点击次数：3598
菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。在实验工作中，为使筛选达到事半功倍的效果，总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选：（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。（3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多。一、从土壤中采样土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）&放线菌（107）&霉菌（106）&酵母菌（105）&藻类（104）&原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。（一）根据土壤特点1. 土壤有机质含量和通气状况一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比5～25cm土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样最好的土层是5～25cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅，约5～10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。2. 土壤酸碱度和植被状况土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤（pH7.0～7.5）环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。由于植物根部的分泌物有所不同，因此，植被对微生物分布也有一定的影响。如番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌。葡萄或其他果树在果实成熟时，其根部附近土壤中酵母菌数量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌数量比其他植被下占优势。3. 地理条件南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多，特别是热带和亚热带地区的土壤。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方土壤中筛选出来。原因是南方温度高，温暖季节长，雨水多，相对湿度高，植物种类多，植被覆盖面大，土壤有机质丰富，造成得天独厚的微生物生长环境。4. 季节条件不同季节微生物数量有明显的变化，冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少。到了春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加。但就南方来说，春季往往雨水多，土壤含水量高，通气不良，即使有微生物所需的温度、湿度，也不利于其生长繁殖。随后经过夏季到秋季，约有7～10个月处在较高的温度和丰富的植被下，土壤中微生物数量比任何时候都多，因此，秋季采土样最为理想。（二）采样方法用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25处的土样10～25，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取3～4撒到试管斜面上，这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。
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DXY All Rights Reserved.毕业论文—淀粉酶产生菌的产酶动力学研究（一月的心血A）
对枯草芽孢杆菌种子培养阶段生长量变化研究表明：用于发酵的菌液应取44h左右时种子培养菌液，此时菌种数最多，且处于对数生长期，生长最快速。液体发酵生产淀粉酶过程中各阶段的微生物动力学行为进行研究表明：该出发菌种的最适产酶时间为63h,,此时酶合成量最大。产酶的最适pH为7.2，糖含量与溶氧量总体存下降趋势。菌种的酶生物合成模式为中期合成型，即酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入平衡期后，酶的合成也随之停止。
关键词：枯草芽孢杆菌；液体发酵；产酶动力学；淀粉酶
Known for producing some of the bacteria amylase seed
cultivation stage study showed that the growth of change: for
fermented bacilli should take 44 hours or so, seed cultivation
bacilli, the largest number of species at this time, and in the
logarithmic phase, growth the most rapid. Amylase liquid
fermentation production stages of the process of microbial dynamics
behavior study shows that: The strain of the optimum enzyme
production time is 63 h,, the largest amount of this enzyme.
Producing the optimum pH of 7.2, sugar content and dissolved oxygen
content of the overall downward trend. The strain of biosynthesis
of type model for the medium-term, that is, in the synthesis of
cell growth only after a certain period of time, and enter the
balance period in the cell, the enzyme synthesis also will be
第一章 &前
1　淀粉酶的概况：
淀粉酶(amylase)一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC3．2．1．1．）与β-淀粉酶（EC3．2．1．2．）。（1）α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α－1，4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）；（2）β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α－1，4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α－1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。从上述的α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用方式，分别提出α－1，4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶（α－1，4－glean
4-glucanohydrolase）和 α－1，
4-葡聚糖-麦芽糖水解酶（α-1，4－glean
maltohydrolase）的名称等而被使用[1]。
2　淀粉酶的应用
众所周知，酶是一种生物催化剂，具有效率高，专一性，多样性等特点。所以现在越来越受到人们的青睐。淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称[2]。淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。它们广泛存在于动植物体和生物界。广泛应用于食品、发酵、纺织及造纸业等。从真菌中分离的淀粉酶是第一个用于工业化生产的酶。在学粉加工厂中微生物淀粉酶可以成功的取代化学水解。如果酶制备成适合的性状，它可以应用于制药和精细化工中。
酶工程的迅猛发展，酶在生物工程、生物传感器、环保、医药的应用日益扩大，可以说酶已成为国民经济中不可缺少的一部分。
3　淀粉酶发酵生产存在的问题[1]：
虽然淀粉酶的来源广泛，但是要获得可以进行工业化生产的菌株也不是容易的事情，菌株的挑选对于淀粉酶的生产是最重要的因素。有时，一种单独的菌株可以产生一种酶以上，比如α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。淀粉酶的工业化生产分几个步骤进行，特别要考虑到环境因素，根据所需生产的酶不同，设计微生物生长最适条件，这些动力条件包括：添加的营养成分，培养基的酸碱度，渗透关系，通气量，温度以及发酵过程中对污染的确控制。保持培养基的纯度也是非常重要的因素。特别是发酵在通气的条件下进行时，虽然不同的生产厂家所采用的发酵方法的一些细节不同。但总的来说，淀粉酶的生产主要有经济上和工程上的优点，因此人们常采用这种方法生产淀粉酶。在工厂的应用中，耐热性也是大部分酶的一个特点，耐热的微生物可以生产耐热的酶。近来已经开始的研究热稳定酶。特别是α-淀粉酶，集中在酶的温差电堆和最大温度电堆。在耐热的和喜温的微生物中存在非常少的共同性及非常大的未开发的兼性耐热性。兼性耐热菌通常可以生长在温性温度范围。虽然它们的最适生物中生长温度为45℃。但是在更高的温度下，它们生长得更好，因此，这种菌具有喜温和耐热的性能。但是，人们对酶在这种生物中的生产了解的并不多。通过对这种菌的结构和生物化学特性的分析可以提供一些信息来解释耐热淀粉酶的高温承受能力的分子基础。
4　发展趋势
从目前国内淀粉酶发展以及研究报道来看，我国淀粉酶的研究总体水平来说仍处于一个较低阶段。大量研究表明，采用基因工程与传统的微生物育种方式结合来提高菌种产酶量是一条有效的发展途径。综合过去取得的成绩以及在研究中存在的问题，今后发展的方向主要有以下几个方面：1
继续通过基因工程与传统的微生物育种技术进一步提高微生物产酶能力。2
采用酶体外定向技术改变酶的底物特异性与适应性，如底物亲和力、pH适应性、耐热性以及耐氧化性等等。为开拓酶的新应用领域做出贡献。3
继续寻找产淀粉酶新的菌种，特别是极端微生物源淀粉酶显得尤为重要。4
在应用方面，继续开发酶的应用领域，同时，积极开展理论与应用研究，为酶在食品与其它行业的发展做出贡献[5]。
5　淀粉酶的研究目的[5]
淀粉酶存在于所有生活中有机体中，因此可以从动物、植物、微生物中获得淀粉酶。但是目前工业用酶主要来源于微生物，这是因为：（1）微生物来源广，土地就是微生物的大本营，我们可以通过筛选得到我们所需要的菌株，生活繁殖快，几个小时或者十多个小时就是一代。易变异，可以通过一系列手段得到我们所要的菌种，（2）所利用的培养基成本低，大多数为工农业废物。（3）可选用作为工业生产的淀粉酶的微生物种类多，同时可利用诱变技术将其菌种改良。
目前生产淀粉酶多采用枯草芽孢杆菌来发酵生产，微生物发酵过程中控制条件对酶的生产有着决定作用，因此，对淀粉酶产生菌产酶动力学研究显得尤其重要。我们采用枯草芽孢杆菌为出发菌株，在以玉米粉，黄豆粉等工业上常用的粗原料作为生产淀粉酶的碳氮源的固体培养基中，对菌体生长规律与产物生成规律作了初步研究，以求弄清菌体生长及淀粉酶产生的一些动力学特性。以求用最好的方法控制产酶能力达到最佳。
材料和方法
1.1　菌株:Bacillus
subtilis，由生化实验室提供。
1.2　培养基[6]
1.2.1　斜面培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3.0g ,蛋白胨10.0g
,NaCl 5.0g, 琼脂20.2g ,自来水,1000ml, pH=7.2～7.4.）
　种子培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基（牛肉膏3.0g ,蛋白胨10.0g ,NaCl
5.0g,自来水,1000ml, pH=7.2～7.4.）
1.2.3　发酵培养基：黄豆粉1.5g/100ml,玉米粉1.5g/100ml,NaCl
1g/100ml,k2HPO4 0.01g/100ml,
kH2PO4 0.01g/100ml ,CaCl2
0.4g/100ml, pH=7.2～7.4.
1.3& 主要仪器
-9140A型电热恒温鼓风干燥箱　　上海精宏实验设备有限公司
高压蒸汽灭菌锅&&&&&&&&&&&
上海申安医疗器械厂
高性能无菌实验台&
&&&&&&&&上海瑞仰净化装备有限公司
空气浴振荡器&&&&&&
哈尔滨市东明医疗仪器厂
-0.8A离心机&&&&&&&&&&
北京医用离心机厂
分光光度计&&&&&&
北京瑞利分析仪器有限公司
生化培养箱HPS-250&&&&&&&&&
哈尔滨市东明医疗仪器厂
1.4& 主要试剂
蛋白胨&&&&&&&&&&&&
北京奥博星生物技术责任有限公司
牛肉膏&&&&&&&&&&&&
北京奥博星生物技术责任有限公司
NaCl&&&&&&&&&&&&&&
汕头市光华化学厂
H2PO4&&&&&&&&&&&&&&
长沙分路口塑料化工厂
NaOH&&&&&&&&&&
天津市大茂化学试剂厂
KCl&&&&&&&&&&&&&&&
天津博迪化工有限公司
Na2CO3&&&&&&&&&
&&&&AR&&&&&&&
无锡市民丰试剂厂
Na2HPO4&&&&&&&&&
&&&AR&&&&&&&
汕头市光华化学厂
NaH2PO4&&&&&&&&&
&&&AR&&&&&&&
汕头市光华化学厂
KH2PO4&&&&&&&&&
&&&&AR&&&&&&&
天津博迪化工有限公司
K2HPO4&&&&
&&&&&&&&&AR&&&&&&&
汕头市光华化学厂
H2NCONH2&&&&&&
&&&&&AR&&&&&&&&
汕头市西陇化工厂
KNO3&&&&&&&&&&&
&&&AR&&&&&&&&
长沙分路口塑料化工厂
4HCO4&&&&&&
&&&&&AR&&&&&&&&
天津博迪化工有限公司
NaNO3&&&&&&&&&&&
&&AR&&&&&&&&&
成都金山化工试剂厂
HCl&&&&&&&&&&&&&
&&AR&&&&&&&&
天津市大茂化学试剂厂
可溶性淀粉&&&&&&
&&AR&&&&&&
&&天津市大茂化学试剂厂
&&AR&&&&&&&&
天津北方天医化学试剂厂
柠檬酸三钠&&&&&&&
&AR&&&&&&&&
湖南化学试剂厂
柠檬酸&&&&&&&&&&&&
AR&&&&&&&&&
湖南化学试剂厂
&3，5-二硝基水杨酸&
AR&&&&&&&&&
长沙分路口塑料化工厂
酒石酸钾钠&&&&&&&&
AR&&&&&&&&&
长沙分路口塑料化工厂
CaCl2&&&&&&&&&&&
&&AR&&&&&&&
&长沙分路口塑料化工厂
4)2SO4&&&&&
&&&&AR&&&&&&&&
天津市大茂化学试剂厂
玉米粉，豆粕粉，米糠&&&&&&&&
注：CR(Chemical range，化学级)；AR(Analytic
range，分析级)；BR(Biochemical range，生化级).
培养方法[9]
菌种活化：将枯草芽孢杆菌取一环于斜面培养基,再于恒温培养箱37℃,24h.
摇瓶种子培养：用接种环取培养好的新鲜斜面菌苔一环,接种于盛有150ml灭菌过的新鲜种子培养基的300ml摇瓶内,
并将其放在水浴振荡培养床37℃，200rpm的条件下培养48h。
&发酵培养：从种子培养基取一定浓度的实验菌种液在无菌条件下加入到5升发酵罐（已对其培养基进行严格灭菌），开始进行发酵。
2.2 物理化学参数测定方法
&pH值：&&&&
pH电极读取& &
2.2.2& 温度：
&&&&温度电极读取（发酵过程控制温度为37℃）
2.2.3& 溶氧量[10]
：溶氧电极读取
搅拌速度：电机转速直接显示值（转速为200rpm）
生物量的测定方法(比浊法)
取过滤后的发酵样液迅速用VIS-7220
分光光度计在590nm下测其吸光度。
粗酶液（实验样液）获得方法
待发酵一段时间后，定时的从发酵罐中取样，经四层纱布过滤，将过滤后发酵液放入离心机，在4000rpm离心5min，取上清液，取粗酶液用于研究。
淀粉酶酶活力测定方法[3]
2.5.1　DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸)的制备
精确称取3，5-二硝基水杨酸1g，溶于20ml 12mol／L
NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊，可过滤后使用。
2.5.2　葡萄糖标准曲线的绘制&
取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表33-1加入试剂。
&制作麦芽糖标准曲线配方表 ：
葡萄糖标准液(ml)
蒸馏水(ml)
葡萄糖含量(mg)
3,5-二硝基水杨酸(ml)
摇匀，置沸水中浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以葡萄糖糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。
2.5.3　淀粉酶活力测定方法
(1)取20ml刻度试管2支，分别加入0.05ml待测酶液（或稀释10倍再取0.5ml）,各补蒸馏水0.5ml,
一支作反应管，另一支作对照管。
(2)对照管加0.5ml 1mol/l
NaoH灭酶活，反应管加pH5.6&
0.05mol/l乙酸缓冲液，两管同时加0.5 1%淀粉溶液作反应底物。
(3 )40℃恒温水浴准确反应5min。
(4)反应管加入0.5ml
1mol/lNaoH灭酶活，两管加显色剂2.0ml，沸水反应5min，反应后迅速冷却定容至20ml。
(5)用VIS-7220
分光光度计在540nm处比色，用对照管消零，测得OD540值。
(6)测得未知样的OD540通过标准曲线方程即可得出淀粉酶所水解产生的葡萄糖的量，设40℃下，每分钟催化可溶性淀粉水解生成为0.1mg葡萄糖所需要的酶量为一个酶活力单位（U/ml），从而得出淀粉酶的活力。
残糖的测定方法（DNS法）
(1)取取20ml刻度试管2支，两管加显色剂DNS试剂3.0ml后，一支加入0.5ml过滤后的待测发酵液，另一支加入0.5ml蒸馏水。作空白清零。
(2)置沸水中浴中反应5min，反应后迅速冷却定容至20ml。用VIS-7220
分光光度计在540nm处比色，测得OD540值。用加0.5ml蒸馏水的试管作空白消零。
(3)根据葡萄糖标准曲线y = 0.091x -
0.1024计算并记录残糖量。
蛋白质含量测定方法[3]
2.7.1　考马斯亮兰（Bradford）的制备
称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml
95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2.7.2　牛血清清蛋白(BSA)标准曲线的绘制&
称取牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
标准液蛋白质(ml)
0．9%Nacl(ml)
考马斯亮兰(ml)
蛋白质浓度(ug/ml)
加完试剂3～5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。
以1号管作为空白调零点，在595nm波长下比色测定。以蛋白质浓度含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制蛋白质标准曲线。
2.7.3　蛋白质的含量测定方法
（1）将取样过滤后发酵液倒入离心管，于4000rpm离心机中离心15分钟。
（2）取4支试管，标号1、2、3、4，1号做空白管，在里面加入1ml的蒸馏水。在2、3、4号试管里加入1ml的上清夜，再在4根试管里面加入5ml的考马氏亮蓝试剂。
（3）摇匀反应5分钟后就在A595处测定。
（4）测得未知样的OD595,通过蛋白质标准曲线方程y = 0.1633x
- 0.2087计算并记录蛋白质含量。&
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