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DNA测序建立甘肃当归、大黄种子rRNA基因图谱的研究
□ 张西玲 姬可平 李应东 陈彻 李啸红 刘丽莎
摘　要:目的：对甘肃地道性中药材当归、大黄种子中rRNA基因内转录间隔区进行碱基序列测定，以期建立从分子水平对中草药种子进行鉴定的一种新方法。方法：提取当归、大黄种子中核DNA，利用特异性引物对其rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增，并将扩增产物进行碱基序列测定。结果：经琼脂糖凝胶电泳证实：以上述方法可获得当归、大黄种子DNA中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物；并经测序后得到了当归、大黄种子rRNA基因内转录间隔区的碱基序列，且具有明显的差异和可对比性。结论：不同植物性中药材种子rRNA基因内转录间隔区碱基序列可做为从分子水平进行鉴定的标记。
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tRNA能碱基互补配对吗
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能,tRNA形成2级结构：三叶草形状就是依靠的分子内碱基互补配对的氢键维持,另外tRNA还可以靠 反密码子与 mRNA上的密码子互补配对,即是说RNA之间不管是分子内还是分子间亦可以互补配对
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16SrRNA序列分析及其在乳酸菌分类_鉴定中的应用_赵玉娟
2009, Vol. 30, No. 07食品科学 ※专题论述 300
因序列信息,与 16S rRNA 数据库中的序列数据或其他
数据进行比较,确定其在进化树中的位置,从而鉴定
样本中可能存在的乳酸菌的种类。
216S　rRNA 序列分析在乳酸菌分类、鉴定中的应用
2.116S rRNA基因直接测序
获得乳酸菌 16S rDNA 基因序列,不论是全长还是
部分,都可以提交到 GENBANK 采用 BLAST 程序与已
知序列进行相似性分析以及系统发育分析。当所测乳酸
菌的序列用于设计探针和确定新物种时,最好采用全长
测序。随着核酸测序技术日益完善以及测序成本的降
低,越来越多的乳酸菌进行了全基因组测序分析,到
目前为止,全球共有 49株乳酸菌完成了全基因组的测
定。目前,国内外用于扩增 16S rRNA 基因的部分 PCR
引物见表 1。
引物 序列 (5’ -3’ ) 适用范围
1 正向 GCTAATACCGCATAAGAAGAG
乳酸链球菌 [1]反向 GAGCAGAAGTGACAGGGTG
2 正向 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
乳球菌 [2]反向 AAGGAGGTGATCCAGCC
正向 CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTGATC 单核细胞增生
李斯特菌 [3]反向 CCCGGGATCCAAGCTTTACCTTGTTACGACTT
4 正向 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
乳酸菌 [4]反向 GGCTGCTGGCACGTAGTTAG
5 正向 CCGTTTATGCGGAACACCTA
植物乳杆菌 [5]反向 TCGGGATTACCAAACATCAC
6 正向 CTTGCACTGATTTTAACA
短乳杆菌 [6]反向 GGGCGGTGTGTACAAGGC
7 正向 GTTGTTCGCATGAACAACGCTTAA
发酵乳杆菌 [7]反向 CGACGACCATGAACCACCTGT
8 正向 AAGTOGTAACAAOGTAGCCGT
乳杆菌 [8]反向 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
正向 CCGAATTCGTCGACAAC 肠道细菌及其
相关细菌 [9]反向 AGAGTTTGATCATGGCTCAC
10 正向 CCCGGGATCCAAGCTT
肠道细菌 [9]反向 ACGGTTACCTTGTTACGACTT
表 1　　　16S　rRNA 基因　PCR　扩增引物
Table　1　　　PCR　amplification　primers　of　16S　rRNA　gene Matsuki 等 [10]以 16S rRNA序列为基础,制备了针对
不同种双歧杆菌的种特异性引物,可快速地鉴定人肠道 中的双歧杆菌。 Kullen 等 [11]利用细菌 16S rRNA V1和 V2 (保守区 )500bp 的序列快速准确地从人肠道混合物中鉴定 出嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus) 。 Woo- Patrick等 [12]通过 16S rRNA 序列分析的方法,从一位菌血症胆 囊炎患者体内检测到唾液乳杆菌 (L.salivarius ) 的存在。 Seto 等 [13]对 16S rRNA 序列特定长度片段进行分析,对
人体粪便样品中嗜酸乳杆菌的分布情况进行了检测。 Somer 等 [3]利用 PCR 扩增 16S rRNA序列的方法在 24h 内 检测出食物中的单核细胞增生李斯特氏菌 (L i s t e r i a monocytogenes ) ,且最小检出量为 1~5CFU/25g样品。 Mullie 等 [14]利用套式 PCR 扩增 16S rRNA的方法对人源 的 26株双歧杆菌进行了鉴定,指出不同年龄段人体内的 菌群各不相同,两歧双歧、短双歧和长双歧杆菌是婴 儿体内的优势菌群。 Bonjoch 等 [15]利用 16S rRNA序列设 计的双歧杆菌特异性引物,对人和动物粪便中的微生物 进 行 检 测 , 结 果 表 明 , 样 品 中 仅 存 在 青 春 双 歧 杆 菌 (Bifido b a cterium a d o lescen tis ) 和牙质双歧杆菌 (B. dentium ) ,且这种方法的灵敏度为 10CFU/ml。涂宏钢 等 [16]从标明含有嗜酸乳杆菌的活菌胶囊中分离到一株乳 杆菌,利用 BLAST 比对方法对其 16S rRNA全序列进行 了分析,结合传统分类、鉴定方法,将这株杆菌鉴定 为植物乳杆菌的新株系。
2.2寡核苷酸探针
寡核苷酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片 段,可以特异性地插入到目标核苷酸的互补碱基序列, 并与之杂交,形成双链。在合成探针之前,需通过实 验得出乳酸菌不同于其他细菌的特异性的保守序列,并 按此序列设计引物合成探针,通过 16S rRNA 种、属特 异性的探针与 PCR 产物杂交以期获得微生物组成信息。 此方法简单快速,主要应用于快速检测。
Ehrmann 等 [17]阐述了一种用地高辛 -dUTP 标记探针 的方法在种的水平对干酪、酸奶、香肠、泡菜等发酵 食品中存在的乳酸菌进行快速分类、鉴定,且这种方 法不需要对乳酸菌进行富集培养。 Castellanos 等 [18]以乳 酸菌 66~103位碱基这一高变区域的两端保守序列设计了 引物 OLb2,与引物 OLb1成功扩增了植物乳杆菌 (L. plantarum ) 、鼠李糖乳杆菌 (L. rhamnosus ) 、发酵乳杆 菌 (L. fermentum) 等三株益生乳杆菌菌株的 16S rDNA部 分序列,并且设计了种特异性引物 S 15/22和 S 24。 Yamamoto 等 [19]设计并合成出双歧杆菌属 5个种的特异性 寡核苷酸探针,包括两歧双歧杆菌 (B.bifidum ) 、青春双 歧杆菌 (B. adolescentis) 、婴儿双歧杆菌 (B.infantis ) 、短 双歧杆菌 (B. breve) 和长双歧杆菌 (B. longum) 。 Kaufmann 等 [20]利用双岐杆菌 16S rRNA基因的
V9(可变区 ) 的序列制 备成杂交探针 lm3,与 PCR 技术联用对从食物中分离的 双歧杆菌进行鉴定,效果明显。 Kao 等 [8]采用 PCR 技术 与杂交探针融解曲线的方法,快速、准确地区分干酪 乳杆菌 (L. casei ) 、鼠李糖乳杆菌 (L. rhamnosus ) 、副干 酪乳杆菌 (L. paracasei) 这三株亲缘关系较近的乳酸杆菌。 用于乳酸菌鉴定的寡核苷酸探针的序列组成见表 2[21]。
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新疆酸奶子中乳酸菌多样性分析赵蕊 ,霍贵成 ( 东北...1 乳酸菌生理生化鉴定结果 将测序所得序列及 Gene...中获得的参比菌 株的 16S rRNA 基因序列经 ...16SrRNA检测在新生儿化脓性脑膜炎诊断中的应用作者: 作者单位: 刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 张红爱, 祝撷英, 周南, 于淑群, 赵玉娟, ZHANG Hong-ai, ...赵玉娟, 牛春华, 张雪, 等. 16S rRNA 序列分析及其在乳酸菌分类、 鉴定中的应用[J]. 食品科学, ): 299-303. KIMMEL S A, ROBERT R F. ...干肠中优势蛋白质降解菌筛选及 16S rDNA 鉴定 --...赵玉娟 牛 ---汪敬健 温鲁 翁梁 吉 ---张建新...方面的应用 周耀斌 张辉 宁啸骏 湘西泡菜优质乳酸菌...若干技术在根际微生物研究中的应用_赵庆芳_生物学_...带的序列分析或与特异性探 针杂交 来分析鉴定群落...Teixeira L C 等[5]通过 使用 16S rRNA 基因复用...}