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　　RNA聚合酶Ⅱ转录生成hnRNA和mRNA，是真核生物中最活跃的RNA聚合酶。
　　RNA聚合酶Ⅲ转录的产物都是小分子量的RNA，tRNA的，5SrRNA的和snRNA。
　　RNA聚合酶Ⅰ转录产物是45SrRNA，生成除5SrRNA外的各种rRNA。
　　下面小结真核生物的RNA聚合酶，见表。
　　（三）启动子及终止信号
　　1?启动子
　　启动子或启动部位是指在转录开始进行时，RNA聚合酶与模板DNA分子结合的特定部位。这特定部位在转录作用的调节中是有作用的。每一个基因均有自己特有的启动子。
　　（1）原核生物的启动子。 原核生物的启动子大约有55个碱基对长，其中包含有转录的起始点和两个区——结合部位及识别部位。
　　起始点是DNA模板链上开始进行转录作用的位点，标以+1，转录是从起始点开始向模板键的5′末端方向即编码链3′末端方向进行。在DNA模板上，从起始点开始顺转录方向的区域称为下游；从起始点逆转录方向的区域称为上游。
　　结合部位是指在DNA分子上与RNA聚合酶核心酶紧密结合的序列。结合部位的长度大约是7个碱基对，其中心位于起始点上游的-10bp处。因此将此部位称为-10区。多种启动子的-10区具有高度的保守性和一致性；它们有一个共有序列或共同序列，为5′TATAAT－3′。又称为Pribnow盒。由于在Pribnow盒中碱基组成全是A－T配对，缺少G－C配对；而前者的亲和力只相当于后者的十分之一，所以Tm值较低。因此此区域的DNA双链容易解开，利于RNA聚合酶的进入而促使转录作用的起始。
　　在DNA分子上还有一段识别部位，是RNA聚合酶的σ因子识别DNA分子的部位。识别部位约有6个碱基对，其中心位于上游-35bp处。所以称为-35区，其共有序列5′-TTGACA-3′。其示意图见图。
　　（2）真核生物的启动子。
　　一个真核基因按功能可分为两部分，即调节区和结构基因。结构基因的DNA序列指导RNA转录；如果该DNA序列转录产物为mRNA，则最终翻译为蛋白质。调节区由两类元件组成，一类元件决定基因的基础表达，又称为启动子；另一类元件决定组织特异性表达或对外环境及刺激应答；两者共同调节表达。
　　RNA聚合酶Ⅱ识别的启动子与原核生物的启动子相似，也具有两个高度保守的共有序列。其一是在－25附近的一段AT富集序列，其共有序列是TATAA，称为TATA盒。TATA盒与原核的Pribonow盒相似，是转录因子与DNA分子结合的部位。其二是在多数启动子中，-70附近共有序列CAAT区，称为CAAT盒。除以上两个区域外，有些启动子上游中含有GC盒，此GC盒与CAAT盒多位于-40～110之间，它们可影响转录起始的频率。另外，有少量基因缺乏TATA盒，而由起始序列（Inr）与RNA聚合酶Ⅱ直接作用启动基础转录的开始。启动子决定了被转录基因的启动频率与精确性，同时启动子在DNA序列中的位置和方向是严格固定的，是由5′到3′方向。其示意图见图。
　　增强子：增强子是长约100～200bp的序列，它们与启动子不同，可以位于转录起始位点的上游，也可位于其下游。有些增强子和静息子在DNA序列中的方向是严格由5′到3′方向排列，而另外一些则是自3′向5′方向排列。增强子和静息于与其他调节元件的DNA序列是互相重叠的。
　　增强子具有增加启动子的作用，与启动子都可视为基因表达调控中的顺式作用元件，可与转录因子和RNA聚合酶结合，启动并调节基因转录。
　　RNA聚合酶Ⅰ催化转录作用生成的18S、5．8S及 28SrRNA前体，它所识别的启动子与RNA聚合酶Ⅱ所识的启动子相比，有较大的差异。
　　RNA聚合酶Ⅲ催化高度保守的 tRNA、5S rRNA及一些小核RNA。它识别的启动子比较特殊，启动子不位于编码基因的上游，而在编码基因的转录区内。
　　2?终止信号
　　DNA分子中停止转录作用的部位，称为终止信号。终止部位在结构上有些特点，终止部位中有一段GC富集区，随之又有一段AT富集区。在GC区内有一段是反向重复序列，以致转录作用生成的mRNA在其相应序列中有互补形成的发卡式结构。对于DNA分子的AT富集区，转录生成的mRNA的3′末端中相应的有一连串U序列。
　　还有一种蛋白质ρ因子，它对于RNA聚合酶识别终止信号有辅助作用，又称为终止蛋白。
　　（四）转录过程
　　转录作用过程可以分为三个阶段：起始、延长及终止。
　　1?起始
　　RNA聚合酶的σ因子识别DNA启动子的识别部位，RNA聚合酶核心酶则结合在启动子的结合部位。在与RNA聚合核心酶结合的Pribonow盒附近，双链暂时打开约17个碱基对长度，展示出DNA模板链，有利于RNA聚合酶进入转录泡，催化RNA聚合作用。
　　转录作用开始时，根据DNA模板链上的核苷酸的序列，NTP根据碱基互补原则依次进入反应体系。在RNA聚合酶的催化下，起始点处相邻的前两个NTP以3′、5′一磷酸二酯键相连接。
　　随后，σ因子从模板及RNA聚合酶上脱落下来，于是RNA聚合酶的核心酶沿着模板向下游移动，转录作用进入延长阶段。脱落下的σ因子可以再次与核心酶结合而循环使用。
　　2?延长
　　在RNA聚合酶的催化下，核苷酸之间以3′、5′一磷酸二酯键相连接进行着RNA的合成反应，合成方向为5′→3′。在延长过程中，局部打开的DNA双链、RNA聚合酶及新生成转录本RNA局部形成转录泡。随RNA聚合酶的移动，转录泡也行进，贯穿于延长始终。
　　3?终止
　　在RNA延长进程中，当RNA聚合酶行进到DNA模板的——终止信号时，RNA聚合酶就不再继续前进，聚合作用也因此停止。由于终止信号中有由GC富集区组成的反向重复序列，在转录生成的mRNA中有相应的发卡结构。此发卡结构可阻碍RNA聚合酶的行进，由此而停止了RNA聚合作用。在终止信号中还有AT富集区，其转录生成的mRNA3′末端有多个U残基。
　　二、转录后的加工过程
　　转录作用产生出的mRNA、tRNA及rRNA的初级转录本全是前体RNA，而不是成熟的RNA，它们没有生物学活性，还要在酶的作用下，进行加工才能变为成熟的，有活性的RNA。
　　RNA的加工过程主要是在细胞核内进行，也有少数反应是在胞质中进行。
　　RNA加工的类型有：
　　剪切及剪接：剪切就是剪去部分序列；剪接是指剪切后又将某些片段连接起来。
　　末端添加核苷酸：例如tRNA的3′-末端添加-CCA。
　　修饰：在碱基及核糖分子进行化学修饰。
　　RNA编辑：某些RNA，特别是mRNA自DNA模板上所获得的遗传信息，在转录作用后又发生了变化。
　　（一）mRNA前体的加工
　　1．mRNA生成的特点
　　(1)原核生物mRNA的生成。原核生物转录作用生成的mRNA属于多顺反子。即几个结构基因，利用共同的启动子及共同的终止信号，经转录作用生成mRNA分子，所以此mRNA分子可编码几种不同的蛋白质。
　　原核生物中，细胞内没有核膜，染色质存在于胞质中，所以转录与翻译进行的场所没有明显的屏障。在转录尚未完成时，翻译就已开始了。而且，mRNA的寿命十分短暂。
　　（2）真核生物mRNA生成。真核生物转录作用生成的mRNA为单顺反子，即一个mRNA分子只编码一种蛋白质。
　　真核生物的结构基因中包含有具有表达活性的编码蛋白质序列，称为外显子；还含有无表达活性的序列，称为内含子。由于内含于是插在外显子之间，所以又称为插入序列。转录生成的mRNA前体中有来自外显子部分的，也有来自内含子部分的。在加工时，前体要进行剪接作用。
　　2．mRNA前体的加工
　　原核生物转录生成的初级转录本mRNA不需经过复杂的加工就表现有活性。唯一的加工作用是多顺反子mRNA在RNaseⅢ的催化下，裂解为单独的顺反子。
　　真核生物转录生成的mRNA要经过较复杂的加工过程。包括①5′末端加帽②3′端加尾③剪接去除内含子并连接外显子④核苷酸编辑⑤甲基化修饰。
　　(1)5′末端帽子的生成。步骤
　　①mRNA5′末端pppNp在磷酸酶作用下脱Pi，形成ppNp?-。②在鸟苷酸转移酶作用下，与Gppp反应形成GpppNp?-。③在甲基转移酶作用下，由腺苷蛋氨酸(SAM)提供甲基，在鸟嘌呤的N-7上甲基化，然后在连接于鸟苷酸的第一个（或第二个）核苷酸2－OH上又进行甲基化，最后成为m7GpppNmp，这就是帽子生成。
　　（2）3′末端多聚A尾的生成。多聚A尾的生成是多聚A聚合酶的催化下，由ATP聚合而成。但多聚A尾形成并不是简单地加入A，而是先要在mRNA前体的3′末端11～30核苷酸处有一段AAUAA保守序列，在U7－snRNP的协助下识别，由一种特异的核酸内切酶催化切除多余的核苷酸。随后，在多聚A聚合酶催化下，发生聚合反应形成了3′末端多聚A尾。
　　（3）剪接作用。
　　在转录时，外显子及内含子均转录到hnRNA中。在细胞核中，hnRNA进行剪接作用，首先在核酸内切酶作用下剪切掉内含子；然后在连接酶作用下，将外显子各部分连接起来，成为成熟的mRNA，这就是剪接作用。
　　一个相同的初级转录本，在不同的组织中由于剪接作用的差异可以产生具有不同编码的mRNA，导致翻译生成不同的蛋白质产物。
　　在剪接作用过程中有如下一些共同的特点：
　　1）mRNA前体的剪切部位是在内含子末端的特定序列。内含子的序列中起始为GU；而终止于AG。
　　在内含子3′末端剪接点的上游20～50核苷酸范围内，还有一个在剪接中有重要作用的位点，其序列中含有A，称为分支部位。
　　内含子如果其中发生部分丢失，不一定会对剪接产生影响。3′末端或分支部位发生变异，则会导致错误的剪接。
　　2）套索的形成及剪除。
　　mRNA前体剪接过程中，先剪切下内含子，然后连接外显子。剪接的过程分两步反应进行：①内含子序列中分支部位中腺苷酸残基（A）的2′－OH攻击内含子5′末端与外显子1连接的磷酸二酯键，剪下了外显子1，而腺苷酸原来已有以3′、5′-磷酸二酯键相连的两个相邻的核苷酸残基，加上此2′、5′-磷酸二酯键的连接后，形成了“套索”中间产物。②已被剪切下的外显子1的3′末端-OH攻击内含子3，末端与外显子2之间的3′、5′磷酸二酯键，链断裂，内含子以套索形式被剪切下来，同时外显子1与外显子2连接起来。 ③剪接体的生成。 在mRNA前体剪接过程去除内含子时，还有多种成分的RNA-蛋白质复合体的参与，其大小为60S，是由几种非特异的小核核糖核蛋白(UsnRNP)与mRNA前体结合而成，称为剪接体。（UsnRNA)是一族snRNA，参与剪接作用的有多种UsnRNPs。
　　U1snRNP识别外显子的5′末端剪接序列，并与其互补而结合。 U5snRNP，识别并结合于内含于3′末端剪接点。U2snRNP识别并结合于A序列的分支点。还有U4及U6snRNP也参加到剪接体中，起配合作用。
　　(4)RNA编辑
　　在转录产物中插入、删除或取代一些核苷酸残基，生成具有正确翻译功能的模板，此即所谓RNA的编辑作用。 编辑过程由一个或多个小分子的“指导RNA”提供mRNA的编辑信息，并作为模板指导其进行编辑，在编辑体的帮助下进行编辑。
　　(5)甲基化修饰
　　原核生物mRNA分子中不含有稀有碱基，但真核生物的mRNA中则含有甲基化核苷酸，除了在hnRNA的5′端帽子结构中含有2－3个甲基化核苷外；在分子内部还会有l－2个m?6A存在于非编码区。在序列中，m6A总是位于胞苷之后，形成了…NCm6AN序列。m6A的生成是在hnRNA的剪接作用之前发生的。
　　（二）tRNA前体的加工
　　①在核酸内切酶RNaseP作用下，从5′末端切除多余的核苷酸。
　　②在核酸外切酶RNaseD作用下，从3′末端切除多余的核苷酸。
　　③核苷酸转移酶催化，3′末端加CCA-OH，为tRNA加I特有反应。
　　④核酸内切酶催化进行剪切反应，剪掉内含子，由连接酶连接外显子部分。
　　⑤ 化学修饰作用，如甲基化、脱氨基、还原反应。
　　（三）rRNA前体的加工
　　原核生物有 16S、23S及 5S三种 rRNA，这三种rRNA均存在于30S的rRNA前体中。转录作用完成后，在RNaseⅢ催化下，将rRNA前体切开产生16S、25S及 5S rRNA的中间前体。进一步在核酸酶的作用下，切去部分间隔序列，产生成熟的 16S、23S及5S rRNA，还有成熟的 tRNA。并对16S rRNA进行甲基化修饰，生成稀有碱基。与4S rRNA加I变化不大。
　　真核生物的核蛋白体中有18S、5．8S及5S rRNA。 5SrRNA自己独立成体系，在成熟过程中加工甚少，不进行修饰和剪切。 45S rRNA前体中包含有 18S、5．8S及 28SrRNA。在加工过程中，分子广泛地进行甲基化修饰，主要是在28S及18S中。甲基化作用多发生于核糖上，较少在碱基上。随后45 S rRNA前体经核酸酶顺序剪切下生成18S、5.8S、28S rRNA。
　　三、核酶
　　对于具有催化活性的RNA现称为“核酶”。
　　核酶作用方式较简单，归纳起来主要有以下几种类型：①剪切型，这类核酸能催化自身RNA或异体RNA分子剪掉一段核苷酸片段，其催化功能相当于内切核酸酶的作用。②剪接型，这类核酶催化自身RNA进行化学反应，首先切去自身RNA内一个核苷酸片段，再将剩余的两个片断连接起来；相当于内切核酸酶及连接酶的联合作用。③其他类型，如核苷酸转移，脱磷酸作用。
　　核酶的酶活性种类：①核苷酸转移作用。②磷酸二酯键水解作用。③磷酸转移反应催化作用。④脱磷酸作用。⑤限制性内切酶作用。
　　核酶的意义：①RNA可作为生物催化剂。②打破了只有蛋白质才能有酶催化作用。③为进化先有核酸、先有RNA提供证据。④可用于制药和临床治疗。
　　四、RNA的复制
　　病毒RNA进入宿主细胞后，还可进行复制，即在RNA指导的RNA聚合酶催化进行RNA合成反应。
　　RNA复制酶催化的合成反应是以RNA为模板，由5′向3′方向进行RNA链的合成。RNA复制酶缺乏校对功能的内切酶活性，因此RNA复制的错误率较高，RNA复制酶只是特异地对病毒的RNA起作用，而宿主细胞的RNA一般并不进行复制。
　　病毒RNA复制的几种方式
　　（1）含正链RNA(+)的病毒(例如，噬菌体Q)：(+)RNA充当mRNA，合成蛋白
　　(+)RNA为模板，复制，合成(-)RNA，再以(-)RNA为模板合成(+)RNA组装成病毒颗粒。
　　（2）含负链RNA(-)的病毒(例如狂犬病)：由(-)RNA合成(+)RNA，再由(+)RNA合成蛋白质、(-)RNA，组装成病毒。
　　（3）含双链RNA的病毒(例如呼肠孤病毒)：以(-)RNA为模板合成(+)RNA，以(+)RNA为模板合成(-)RNA和蛋白，组装病毒颗粒。
　　（4）逆转录病毒(例如白血病毒)：由RNA反转录为DNA，以DNA为模板合成RNA，翻译蛋白质。
　　mRNA生成后，遗传信息由mRNA传递给新合成的蛋白质，此时mRNA分子中的遗传信息被翻译成为蛋白质的氨基酸排列顺序，因此蛋白质的合成过程也被称为翻译。
　　一、蛋白质合成体系
　　参与蛋白质合成的物质，除作为原料的氨基酸外，还有mRNA、tRNA、核蛋白体、有关的酶(氨基酰tRNA合成酶)，以及ATP、CTP等供能物质与必要的无机离子等。
　　（1）mRNA的作用原理
　　mRNA中每3个核苷酸组成1个密码子，体现一个氨基酸的信息。
　　在mRNA中，每3个相互邻接的核苷酸，其特定排列顺序，在蛋白质生物合成中可被体现为某种氨基酸或合成的终止信号者称为密码子，统称遗传密码。遗传密码具有简并性、通用性、方向性、不间断性和不重叠性。
　　UAA、UAG、UGA为肽链的终止信号，不代表任何氨基酸。密码子AUG不仅代表一定氨基酸，而且位于mRNA启始部分，AUG又是肽链合成的启始信号。
　　mRNA上的启动信号到终止信号的排列是有一定方向性的。启动信号总是位于mRNA的5′末端的一边，而终止信号总是在mRNA的3′末端一边。
　　（2）tRNA的作用原理
　　不同的氨基酸有其特定的tRNA，同一种氨基酸常有数种tRNA。在ATP和酶存在的条件下，tRNA与对应氨基酸结合成为氨基酰tRNA。
　　tRNA上有由3个核苷酸组成的反密码子，与mRNA上的密码子按碱基互补配对原则结合，氨基酰tRNA才能准确的在mRNA上对号入座。但tRNA的反密码子中的核苷酸与mRNA的第三个核苷酸配对时，并不严格遵循碱基互补配对原则，此种配对称不稳定配对。
　　（3）核蛋白体的作用原理
　　核蛋白体相当于装配体，由大亚基(原核为50S，真核为60S)和小亚基(原核为30S，真核为40S)组成。大亚基具有转肽酶的活性，可使核蛋白体上的肽链转移到新进入核蛋白体的tRNA所携带的氨基酸上，使其缩合成肽。所以，当核蛋白体在mRNA上每向前移动一个密码子的位置，肽链上即增加一个新的氨基酸，直至终止信号。
　　二、蛋白质合成的过程
　　蛋白质生物合成的具体步骤包括：①氨基酸的活化；②活化氨基酸的转运；③活化氨基酸在核蛋白体上的缩合。
　　(一）氨基酸的活化转运
　　氨基酸的活化过程及其活化后与相应tRNA的结合过程，都是由氨基酰tRNA合成酶来催化的，反应方程(见原书),以氨基酰tRNA形式存在的活化氨基酸，即可投入氨基酸缩合成肽的过程。氨基酰tRNA合成酶存在于胞液中，具有高度特异性。它们既能识别特异的氨基酸，又能辨认携带该种氨基酸的特异tRNA分子。在体内，每种氨基酰tRNA合成酶都能从多种氨基酸中选出与其对应的一种，并选出与此氨基酸相应的特异tRNA。这是保证遗传信息准确翻译的要点之一。
　　（二）核蛋白体循环
　　tRNA所携带的氨基酸，是通过“核蛋白体循环”在核蛋白体上缩合成肽，完成翻译过程的。以原核生物中蛋白质合成为例，将核蛋白体循环人为地分为启动、肽链延长和终止三个阶段进行介绍。
　　1．启动阶段
　　在蛋白质生物合成的启动阶段，核蛋白体的大、小亚基，mRNA与一种具有启动作用的氨基酸tRNA共同构成启动复合体。这一过程需要一些称为启动因子的蛋白质以及GTP与镁离子的参与。
　　原核生物中的启动因子有3种，IF1辅助另外两种启动因子IF2、IF3起作用。
　　启动阶段的具体步骤如下：
　　(1)30S亚基在IF3与IF1的促进下与mRNA的启动部位结合，在IF2的促进与IF1辅助下与甲酰蛋氨酰tRNA以及GTP结合，形成30S启动复合体。
　　30S启动复合体由30S亚基、mRNA、fMet-tRNAfMet?及IF1、IF2、IF3与GTP共同构成。
　　（2）30S启动复合体一经形成，IF3即行脱落，50S亚基随之与其结合，形成了大、小亚基，mRNA，fMet－tRNAfMet?及IF1、IF2与GTP共同构成的70S启动前复合体。
　　（3）70S启动前复合体的GTP水解释出GDP与无机磷酸的同时，IF2和IF1随之脱落，形成了启动复合体。至此，已为肽链延长作好了准备。
　　启动复合体由大、小亚基，mRNA与fMet－tRNAfMet?共同构成。
　　已知核蛋白体上有两个位置，分别称为“给位”与“受位”，启动复合体中mRNA的启动信号相对应的fMet－tRNAfMet亦即处于核蛋白体的给位。
　　2．肽链延长阶段
　　这一阶段，根据mRNA上密码子的要求，新的氨基酸不断相应的被特异的tRNA运至核蛋白体受位，形成肽键。同时，核蛋白体从mRNA的5′端向3′端不断移位推进翻译过程。肽链延长阶段需要数种称为延长因子的蛋白质、GTP与某些无机离子的参与。
　　(1)进位
　　受位上mRNA密码子相对应的氨基酸tRNA进入受位，生成复合体V。此步骤需要GTP、Mg2+和称为肽链延长因子EFTu与EFTs的蛋白质因子。
　　（2）转肽
　　50S亚基的给位有转肽酶的存在，可催化肽键形成。此时在转肽酶的催化下，将给位上tRNA所携的甲酰蛋氨酰（或肽酰）转移给受位上已特异性进入的氨基酸tRNA，与其所带的氨基酸的氨基结合形成肽键。此酶需要Mg2+与K2+存在。
　　（3）脱落
　　原在给位上的脱去甲酰蛋氨酰后的tRNAfMet，从复合物上脱落。
　　（4）移位
　　核蛋白体向mRNA的3′端挪动相当于一个密码子的距离，使下一个密码子准确定位在受位，同时带有肽链的tRNA由受体移至给位，此步需有肽链延长因子EFG、GTP与Mg2+?。 以后肽链上每增加一个氨基酸残基，就按①进位（新的氨基酸tRNA进入“受位”）②转肽（形成新的肽键）③脱落（转肽后“给位”上的tRNA脱落）④移位（核蛋白体挪动的同时，原处于“受位”带有肽链的tRNA随之转到“给位”）。
　　3．终止阶段
　　当多肽链合成已完成，并且“受位”上已出现终止信号（UAA），此后即转入终止阶段。终止阶段包括已合成完毕的肽链被水解释放，以及核蛋白体与tRNA从mRNA上脱落的过程。这一阶段需要一种起终止作用的蛋白质因子——终止因子的参与。
　　终止因子使大亚基“给位”的转肽酶不起转肽作用，而起水解作用。在转肽酶的作用下，“给位”上tRNA所携带的多肽链与tRNA之间的酯键被水解，并从核蛋白体及tRNA上释出。
　　从mRNA上脱落的核蛋白体，分解为大小两个亚基，重新进入核蛋白体循环。核蛋白体的解体需要IF3的参与。
　　下面小结参与原核生物蛋白质合成的一些因子，见表。
作用阶段& & & & 因子& & & & 作用
起动& & & & IF１& & & & 使带氨基酰的tRNA与小亚基结合
& & & & IF2& & & & 同上，并具有GTP酶活性
& & & & IF3 & & & & 促进小亚基与mRNA特异结合，在终止阶段促使已脱落的核蛋白体解离为亚基
延伸& & & & EFTu、EFTs& & & & 促进氨基酰tRNA进入核蛋白体的“受体”?具有GTP酶的活性
& & & & EFG& & & & 具有GTP酶的活性，使转肽后，失去肽链(或蛋氨酰)的tRNA，从“给位”上脱落，并促进移位
终止& & & & RF& & & & 识别终止信号，使大亚基团转肽酶将“给位”上已合成的多肽链水解释放
　（ 三）真核生物与原核生物蛋白质合成的异同
　　1?mRNA
　　真核生物的mRNA前体在细胞核内合成，合成后需经加工，才成熟为mRNA，从细胞核输入胞浆，投入蛋白质合成；而原核生物的mRNA常在合成尚未结束时，已开始翻译。真核生物mRNA含有7甲基三磷酸鸟苷形式的“帽”，有由多聚腺苷酸形成的“尾”，为单顺反子，只含一条多肽链的遗传信息，合成蛋白质时只有一个合成的启动点，一个合成的终点；而原核生物的mRNA为多顺反子，含有蛋白质合成多个启动点和终止点，且不带有类似“帽”与“尾”的结构。在5′端方向启动信号的上游存在富含嘌呤的SD区段。真核生物的mRNA则无此区段。真核生物的mRNA代谢较慢，哺乳类动物mRNA的半衰期为4～6h，而细菌的mRNA半衰期仅在1～3min。此外真核生物的mRNA前体常含有插入顺序，即内含子，需要在加工时切除。
　　2?核蛋白体
　　真核生物的核蛋白体（80S）大于原核生物。小亚基为 40S含有一种 rRNA(18S rRNA)；大亚基为60S，含有 3种rRNA（28S rRNA、5．5S rRNA和 5S rRNA），所含的核蛋白体蛋白质亦多于原核生物。原核生物小亚基16SrRNA的3′末端有一富含嘧啶的区段，可与其mRNA启动部位富含嘌呤的SD区互补结合。在真核生物相应的rRNA（18S rRNA）中，无此互补区。
　　3?tRNA
　　真核生物起着启动作用的氨基酸tRNA为不需要甲酰化的Met－tRNAfMet而原核生物中为fMet-tRNAfMet，系Met－tRNAfMet经蛋氨酰tRNA转甲酰基酸催化后的产物。
　　4?合成过程
　　（1）启动。真核生物的启动因子（eIF）有9-10种，真核生物核蛋白小亚基先与Met－tRNAfMet结合，再与mRNA结合，此时需要一分子ATP。
　　（2）肽链延长。真核生物中催化氨基酸tRNA进入受体的延长因子只有一种（EFT1）。催化肽酰tRNA移位的因子称为EFT2，可为白喉毒素所抑制。
　　（3）终止。真核生物只需一种终止因子（RF），此终止因子可识别3种终止密码子，并需要三磷酸鸟苷。原核生物的终止因子有3种。
　　此外，哺乳动物类等真核生物线粒体中，存在着自DNA到RNA及各种有关因子的蛋白合成体系，以合成线粒体的某些多肽。该体系类似原核生物蛋白合成体系。
　　（四）翻译后加工
　　从核蛋白体释放的多肽链，不一定具备生物活性。肽链从核蛋白体释放后，经过细胞内各种修饰处理过程，成为有活性的成熟蛋白质，称为翻译后加工。
　　1.高级结构的修饰
　　肽链释放后可自行根据其一级结构的特征折叠、盘曲成高级结构。此外，高级结构的修饰还包括：
　　（1）折叠：蛋白立体构象的生成需要折叠，有分子伴侣，二硫键异构酶及肽链顺反异构酶等参与。
　　（2）亚基聚合。具有四级结构的蛋白质由两条以上的肽链通过非共价键聚合，形成寡聚体，各亚基虽自有独立功能，但又必须相依存，才得以发挥作用。
　　（3）辅基连接。蛋白质分为纯蛋白及结合蛋白两大类，糖蛋白、脂蛋白及各种带有辅酶的酶，都是常见的重要结合蛋白质。
　　辅基（辅酶）与肽链的结合是复杂的生化过程。
　　2?一级产物的修饰
　　（1）去除N-甲酰基或N-蛋氨酸。在蛋白质合成过程中，N-端氨基酸总是fMet（甲酰蛋氨酸），其α-氨基是甲酰化的。但天然蛋白质大多数不以蛋氨酸为N端第一位氨基酸。细胞内的脱甲酰基酶或氨基肽酶可以除去N-甲酰基，N-末端蛋氨酸或N-末端的一段肽。
　　（2）个别氨基酸的修饰。有些蛋白质还需经一定的修饰才能成熟而参与正常的生理活动。例如精蛋白的前体需要带上糖链，胶原蛋白的前体在细胞内合成后，需经羟化并带上糖链。
　　在结缔组织的蛋白质内常出现羟脯氨酸、羟赖氨酸，这两种氨基酸并无遗传密码、反密码子及tRNA引导入肽链，是脯氨酸、赖氨酸残基经过羟化而出现的。
　　（3）水解修饰。通过水解修饰，一条肽链可能分为多个不同的活性肽段。无活性的酶原转变为有活性的酶，常需要去掉一部分肽链。例如胰岛素原变为胰岛素时，尚需去掉部分肽段。
　　3?蛋白质合成的靶向输送
　　蛋白质合成后，定向地到达其执行功能的目标地点，称为靶向输送。分泌性蛋白的合成过程实际是和其他蛋白质基本一样的。但其mRNA往往要有一段疏水氨基酸较多的肽编码，这段肽称为信号肽，其作用是把合成的蛋白质转移到内质网，剪切下信号肽，然后把合成的蛋白质送出胞外。
　　三、蛋白质生物合成的干扰和抑制
　　（一）抗菌素（抗生素）
　　（1）四环素族，包括土霉素等，能抑制氨基酰?tRNA与原核细胞的核蛋白体小亚基结合，抑制细菌的蛋白质生物合成。
　　（2）氯霉素，能与原核生物的核蛋白体大亚基结合，阻断翻译延长过程。高浓度时，对真核生物线粒体内的蛋白质合成也有阻断作用。
　　（3）链霉素，和卡那霉素能与原核生物蛋白体小亚基结合，改变其构象，引起读码错误，结核杆菌对这两种抗生素特别敏感。
　　（4）嘌呤霉素，结构与酪氨酸tRNA相似，从而可取代一些氨基酸tRNA进入翻译中的核蛋白体受位，当延长的肽链转入此异常受位时，容易脱落，终止肽链合成。嘌呤霉素对原核、真核生物的翻译过程均有干扰作用。
　　（5）放线菌素，抑制核蛋白体转肽酶，只对真核生物有特异性作用。
　　（二）干扰蛋白质生物合成的生物活性物质
　　白喉毒素，可对真核生物的EFT?２起共价修饰作用，从而使EFT?2失活。 干扰素，对病毒有两方面的作用：其一是干扰素在双链RNA存在下，可以诱导一种蛋白激酶，由蛋白激酶使eIF2发生磷酸化，从而抑制病毒蛋白质的生物合成；干扰素还可诱导生成一种罕见的寡核苷酸，可活化一种称为RNase L的核酸内切酶，由 RNase L降解病毒 RNA。
　　蓖麻蛋白，与真核生物大亚基(60S)的蛋白结合，间接抑制EFT?２的作用，阻碍肽链延长。
　　天花粉蛋白，具有RNA N-糖苷酶活性，使真核大亚基(60S)失活。
　　一、概述
　　（一）基因表达的概念
　　一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因，称为基因组。
　　基因表达就是基因转录及翻译的过程。在一定调节机制控制下，大多数基因经历基因激活、转录及翻译等过程，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子，但并非所有基因表达过程
　　都产生蛋白质，tRNA、rRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达。
　　（二）基因表达的时间性及空间性
　　基因表达的时间、空间特异性由特异基因的启动子（序列）和（或）性强子与调节蛋白相互作用决定。
　　1?时间特异性
　　按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，这是基因表达的时间特异性。 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性。
　　2?空间特异性
　　在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，这就是基因表达的空间特异性。又称细胞特异性或组织特异性。
　　（三）基因表达的方式
　　1?组成性表达
　　某些基因产物对生命全过程是必需的或必不可少的。这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因。管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。这类基因表达视为基本的或组成性基因表达。
　　2?诱导和阻遏表达
　　与管家基因不同，另有一些基因表达极易受环境变化影响。在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因是可诱导的，称为诱导。相反，如果基因对环境信号应答时被抑制，基因表达产物水平降低的，称为阻遏。 诱导和阻遏是同一事物的两种表现形式，在生物界普遍存在，也是生物体适应环境的基本途径。
　　在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为协调表达。这种调节称为协调调节。
　　（四）基因表达调控的生物学意义
　　1?适应环境、维持生长和增殖。
　　2?维持个体发育与分化。
　　二、基因表达调控的基本原理
　　（一）基因表达的多级调控
　　基因的结构活化、转录起始、转录后加工及转运、mRNA降解、翻译及翻译后加工及蛋白质降解等均为基因表达调控的控制点。可见，基因表达调控是在多级水平上进行的复杂事件。其中转录起始是基因表达的基本控制点。
　　四个基本的调控点：
　　（1）基因结构的活化。DNA暴露碱基后RNA聚合酶才能有效结合。活化状态的基因表现为：1.对核酸酶敏感；2.结合有非组蛋白及修饰的组蛋白；3.低甲基化。
　　（2）转录起始。最有效的调节环节，通过DNA元件与调控蛋白相互作用来调控基因表达。
　　（3）转录后加工及转运。RNA编辑、剪接、转运。
　　（4）翻译及翻译后加工。翻译水平可通过特异的蛋白因子阻断mRNA翻译翻译后对蛋白的加工、修饰也是基本调控环节。
　　（二）基因转录激活调节基本要素
　　1．DNA序列
　　原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。操纵子通常由2个以上的编码序列与启动序列、操纵序列以及其他调节序列在基因组中成簇串联组成。启动序列是RNA聚合酶结合并起动转录的特异DNA序列。多种原核基因启动序列特定区域内，通常在转录起始点上游-10及-35区域存在一些相似序列，称为共有序列。大肠杆菌及一些细菌启动序列的共有序列在-10区域是TATAAT，又称Pribnow盒（PribnowBox），在-35区域为 TTGACA。这些共有序列中的任一碱基突变或变异都会影响RNA聚合酶与启动序列的结合及转录起始。因此，共有序列决定启动序列的转录活性大小。操纵序列是原核阻遏蛋白的结合位点。当操纵序列结合阻遏蛋白时会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或使RNA聚合酶不能沿DNA向前移动，阻遏转录，介导负性调节。原核操纵子调节序列中还有一种特异DNA序列可结合激活蛋白，使转录激活，介导正性调节。
　　顺式作用元件就是指可影响自身基因表达活性的DNA序列。在不同真核基因的顺式作用元件中会时常发现一些共有序列，如 TATA盒、CCAAT盒等。这些共有序列就是顺式作用元件的核心序列，它们是真核RNA聚合酶或特异转录因子的结合位点。顺式作用元件通常是非编码序列。顺式作用元件并非都位于转录起点上游（5′端）。根据顺式作用元件在基因中的位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式，可将真核基因的这些功能元件分为启动子、增强子及沉默子等。
　　2．调节蛋白
　　原核调节蛋白分为三类：特异因子、阻遏蛋白和激活蛋白。特异因子决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列的特异性识别和结合能力。阻遏蛋白可结合操纵序列，阻遏基因转录。激活蛋白可结合启动序列邻近的DNA序列，促进RNA聚合酶与启动序列的结合，增强RNA聚合酶活性。
　　真核调节蛋白又称转录因子。绝大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，通过与特异的顺式作用元件相互作用（DNA-蛋白质相互作用）反式激活另一基因的转录，故称反式作用因子。有些基因产物可特异识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因的开启或关闭，这就是顺式作用。具有这种调节方式的调节蛋白称为顺式作用蛋白。
　　3．DNA-蛋白质、蛋白质和蛋白质相互作用
　　DNA-蛋白质相互作用指反式作用因子与顺式作用元件之间的特异识别及结合。这种结合通常是非共价结合。
　　绝大多数调节蛋白结合DNA前需通过蛋白质-蛋白质相互作用形成二聚体或多聚体。所谓二聚化就是指两分子单体通过一定的结构域结合成二聚体，它是调节蛋白结合DNA时最常见的形式。由同种分子形成的二聚体称同二聚体，异种分子间形成的二聚体称异二聚体。除二聚化或多聚化反应，还有一些调节蛋白不能直接结合DNA，而是通过蛋白质一蛋白质相互作用间接结合DNA，调节基因转录。
　　4．RNA聚合酶
　　DNA元件与调节蛋白对转录激活的调节最终是由RNA聚合酶活性体现的。启动序列／启动子的结构，调节蛋白性质对RNA聚合酶活性影响很大。
　　(1)启动序列或启动子与RNA聚合酶活性：原核启动序列或真核启动子是由转录起始点、RNA聚合酶结合位点及控制转录的调节组件组成。会影响其与RNA聚合酶的亲和力，而亲和力大小则直接影响转录起始频率。
　　（2）调节蛋白与RNA聚合酶活性：一些特异调节蛋白在适当环境信号刺激下在细胞内表达，随后这些调节蛋白通过DNA-蛋白质相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用影响RNA聚合酶活性，从而使基础转录频率发生改变，出现表达水平变化。
　　三、原核基因表达调控
　　（一）原核基因调节特点
　　1?σ因子决定mRNA识别特异性 原核生物细胞仅含有一种RNA聚合酶，核心酶参与转录延长，全酶司转录起始。在转录起始阶段，σ亚基（又称σ因子）识别特异启动序列；不同的σ因子决定特异基因的转录激活，决定tRNA、mRNA和rRNA基因的转录。
　　2?操纵子模型的普遍性
　　3?阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性
　　（二）乳糖操纵子调节机制
　　1?乳糖操纵子的结构
　　大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶、透酶、乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因Ⅰ。Ⅰ基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白CAP结合位点，由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成LAC操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
　　2?阻遏蛋白的负性调节
　　在没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻遏状态。此时，Ⅰ基因列在P启动序列操纵下表达的乳糖阻遏蛋白与O序列结合，故阻断转录启动。阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对，偶有阻遏蛋白与O序列解聚。因此，每个细胞中可能会有寥寥数分子β半乳糖苷酶、透酶生成。
　　当有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经透酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数β-半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，使β-半乳糖苷酶分子增加 1000倍。
　　3?CAP的正性调节
　　分解代谢物基因激活蛋白CAP是同二聚体，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点。当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在乳糖启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA转录活性，使之提高50倍；当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。
　　由此可见，对乳糖操纵子来说CAP是正性调节因素，乳糖阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节乳糖操纵子的表达。
　　4?对调节机制的解释
　　大肠杆菌根据碳源性质选择代谢方式。
　　倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。葡萄糖通过降低cAMP浓度，阻碍cAMP与CAP结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。
　　在没有葡萄糖而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与O序列解聚，CAP结合cAMP后与乳糖操纵子的CAP位点，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源。
　　四、真核基因表达调控
　　（ 一）真核基因组结构特点
　　1?真核基因组结构庞大
　　哺乳类动物基因组DNA长达3×109个bp。
　　2?单顺反子
　　真核基因转录产物为单顺反子，即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条多肽链。
　　3?重复序列
　　在原核、真核DNA中都有重复出现的核苷酸序列，但在真核更普遍。根据重复频率可将重复序列区分为高度重复序列（106次)、中度重复序列（103～104)及单拷贝序列。单拷贝序列在整个基因组中只出现一次或很少的几次。
　　4?基因不连续性
　　真核结构基因两侧存在不被转录的非编码序列，往往是基因表达的调控区。在编码基因内部尚有一些不为蛋白质所编码的间隔序列，称内含子，而编码序列称为外显子，因此真核基因是不连续的。
　　（二）真核基因表达调控特点
　　1?RNA聚合酶
　　真核RNA聚合酶有三种，即RNA polⅠ、Ⅱ、Ⅲ，分别负责三种RNA转录。TATA盒结合蛋白为三种聚合酶所共有。
　　2?活性染色体结构变化
　　（1）对核酸酶敏感。
　　（2）DNA拓扑结构变化。 天然状态的双链DNA以负性超螺旋的构象存在。当基因活化时，RNA聚合酶前方的转录区DNA拓扑结构为正性超螺旋，后面的DNA则为负超螺旋，正性超螺旋不仅阻碍核小体结构形成，而且促进组蛋白 H2A•H2B二聚体的释放，有利转录。（3）DNA碱基修饰变化。 在真核DNA有约5％的胞嘧啶被甲基化为5甲基胞嘧啶，甲基化范围与基因表达程度是反比关系。处于转录活化状态的基因CpG序列一般是低甲基化的。
　　（4）组蛋白变化。 ①H1样组蛋白减少。②H2A•H2B二聚体不稳定性增加。③组蛋白修饰：最常见的修饰有乙酰化、泛素化，修饰后使核小体结构变得不稳定。④H3组蛋白巯基暴露。
　　3?正性调节占主导
　　提高了蛋白-DNA相互作用的指导性，经济有效。
　　4?转录与翻译间隔进行
　　真核细胞有细胞核及胞浆等区间分布，转录与翻译在不同亚细胞结构中进行。
　　5?转录后修饰、加工
　　（三）真核基因转录激活调节
　　1?顺式作用元件
　　顺式作用元件是特异转录因子的结合位点，按功能特性，真核基因顺式作用元件分为启动子、增强子及沉默子。
　　（1）启动子。
　　真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，每一组件含7－20bp的DNA序列。启动子包括至少一个转录起始点，以及一个以上的功能组件。在这些功能组件中最具典型意义的就是TATA盒，TATA盒通常位于转录起始点上游-25至30bp，控制转录起始的准确性及频率。典型的启动子由TATA盒及上游的CCAAT盒和（或）GC盒组成，这类启动于通常具有一个转录起始点及较高的转录活性。然而，还有很多启动子并不含TATA盒，这类启动子分为两类：一类为富含GC的启动子，最初发现于一类管家基因，这类启动于包括一个或数个分离的转录起始点；另一类启动子既不含TATA盒，也没有GC富含区，这类启动子可有一个或多个转录起始点，但多数转录活性很低或根本没有转录活性，而是在胚胎发育、组织分化或再生过程中受调节。
　　（2）增强子。所谓强子就是远离转录起始点、决定基因的时间、空间特异性表达、增强启动子转录活性的DNA序列，其发挥作用的方式通常与方向、距离无关，可位于转录起始点的上游或下游。从功能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用。
　　（3）沉默子。某些基因含有负性调节元件——沉默子，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。
　　2?转录调节因子
　　（1）转录调节因子分类。转录因子，分为两类：①基本转录因子是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组因子，为所有mRNA转录起动共有②特异转录因子为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达，包括转录激活因子和抑制因子。
　　（2）转录调节因子结构。所有转录因子至少包括两个结构域：DNA结合域和转录激活域；此外，很多转录因子还包含一个介导蛋白质-蛋白质相互作用的结构域，最常见的是二聚化结构域。①DNA结合域通常由60－100个氨基酸残基组成。最常见的DNA结合域结构形式是锌指结构和碱性α螺旋。类似的碱性DNA结合域多见于碱性亮氨酸拉链和碱性螺旋-环-螺旋。②转录激活域——由30-100个氨基酸残基组成。根据氨基酸组成特点，转录激活域又有酸性激活域、谷氨酰胺富含区域及脯氨酸富含区域。③介导二聚化的结构域——二聚化作用与亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋结构有关。
　　3?mRMA转录激活及其调节
　　真核RNA聚合酶Ⅱ不能单独识别、结合启动子，而是先由基本转录因子TFⅡD组成成分TBP识别TATA盒或启动元件，并有TFⅡA参与结合，形成TFⅡD-启动子复合物；继而在TGⅡAF等参与下，RNA聚合酶Ⅱ与TFⅡD、TFⅡB聚合，形成一个功能性的前起始复合物。在几种基本转录因子中，TFⅡD是唯一具有位点特异的DNA结合能力的转录因子，在上述有序的组装过程起关键性指导作用。这样形成的前起始复合物尚不稳定，也不能有效启动mRMA转录。然后由结合在增强子上的转录激活因子直接或间接与TFⅡD结合，从而影响前起始复合物的形成、稳定性以及RNA聚合酶的活性。
　　重组DNA技术相关概念
　　1?克隆与克隆化
　　所谓克隆就是指同一副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化。为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合，即为分子克隆。
　　2?DNA克隆
　　DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。
　　3?工具酶
　　在重组DNA技术中，常需要一些基本工具酶进行基因操作。
　　小结：重组DNA技术常用工具酶
　　（1）限制性内切酶：识别特异序列，切割DNA
　　（2）DNA连接酶：催化DNA中相邻的5′磷酸基与3′羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合，连接DNA片段
　　（3）DNA聚合酶Ⅰ：a.合成双链cDNA中第二条链。?
　　& && && && && && &b.缺口平移制做探针。?
　　& && && && && && &c.DNA序列分析。?
　　& && && && && && &d.填补3′末端。
　　（4）Taq酶 催化PCR反应，聚合DNA
　　（5）反转录酶 a.合成cDNA。b.替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析
　　（6）多聚核苷酸激酶 催化DNA 5′羟基末端磷酸化，或标记探针
　　（7）碱性磷酸酶 切除DNA5′末端磷酸基
　　（8）末端转移酶 在3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾。
　　（9）DNA酶：切割DNA
　　（10）RNA酶：切割RNA
　　在所在工具酶中，限制性核酶内切酶具有特别重要的意义。所谓限制性核酸内切酶就是识别DNA的特异序列，并在识别点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。根据酶的组成，所需因子及裂解DNA方式的不同，可将限制性核酸内切酶分为三类。重组DNA技术中常用的限制性核酸内切酶为Ⅱ类酶，大部分Ⅱ类酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构。
　　下面小结限制性内切酶，见表。
Ⅰ类& & & & 需Mg2+、SAM及ATP& & & & 识别位点复杂，特异性差，切割位点距识别点远。
Ⅱ类& & & & 仅需Mg2+& & & & 识别切割特异性强，切割发生在识别位点。
Ⅲ类& & & & 需Mg2+及ATP& & & & 切割位点在识别位点周围，酶活性不单一。
　　4.目的基因
　　有时应用重组DNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物——蛋白质。目的DNA有两种类型：cDNA和基因组DNA。cDNA是指在体外经反转录合成的、与RNA（通常指mRNA）互补的单链DNA，经聚合反应，单链cDNA进而合成双链cDNA。基因组DNA是指包含一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。
　　5?基因载体
　　或称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。
　　二、重组DNA的基本原理
　　一个完整的DNA克隆过程应包括：①目的基因的获取，②基因载体的选择与构建，③目的基因与载体的拼接，④重组DNA分子导入受体细胞，⑤筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。
　　（一）目的基因的获取
　　目前获取目的基因大致有如下几种途径或来源。
　　1．化学合成法：如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。
　　2．基因组DNA：采用物理方法(剪切或超声波)或限制性内切酶将染色体DNA切割成许多片段，继而将它们与适当克隆载体结合，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全部信息，即基因文库。建立基因文库后，结合适当筛选方法从众多的转化子菌株中选出含某一基因的菌株，扩增分离得到目的基因。
　　3． cDNA：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cDNA文库。用适当方法cDNA文库中就可以筛选分离到目的基因。
　　4．聚合酶链反应：在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合成，使目的基因按指数增长。
　　（二）克隆载体的选择与改建
　　1.质粒：存在于细菌染色体外，小型闭合环状双链DNA分子，可独立自主进行复制，含筛选标记，含多种限制性内切酶的单一切割位点，可插入目的基因。
　　2.噬菌体：eg λ噬菌体、MB载体
　　3.柯斯质粒与酵母人工染色体载体：用于插入大DNA片段。
　　4.病毒载体。
　　（三）外源基因与载体的连接
　　即DNA的体外重组。这种DNA重组是靠DNA酶将外源DNA与载体共价连接的。
　　1．粘性末端连接
　　(1)同一限制酶切割位点连接 由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。那么，当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。
　　(2)不同限制酶切割位点连接 由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的粘性末端，即配对末端，也可以进行粘性不同末端连接。
　　2．平端连接
　　3．同聚物加尾连接
　　同聚物加连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下，在DNA片段制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。
　　4．人工接头连接
　　（四）重组 DNA导入受体细胞
　　根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染和感染等不同手段。
　　1.感受态细胞。经一定方法处理(如CaCl2处理)后具备接受外界DNA能力的大肠杆菌。受体菌应为安全无毒菌株，且为限制酶缺陷型及重组缺陷型。
　　2.转化、转染及感染。本定义不涉及真核细胞，只针对大肠杆菌。
　　转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载体DNA导入受体细胞。
　　转染：以噬菌体为载体，用DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受体菌。
　　感染：以噬菌体为载体，在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，使其感染受体菌。
　　（五）重组体的筛选
　　1．直接选择法
　　直接法是针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法，其特点是直接测定基因表型。
　　（1）抗药性标志选择：如果克隆载体携带有某种抗药性标志基因，则只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌药物的培养板上幸存并形成菌落。
　　（2）标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救筛选。
　　（3）分子杂交法
　　2．免疫学方法
　　应用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选，属非直接选择法。特异性强、灵敏度高，适用于选择不为宿主菌提供任何标志的基因。
　　（六）克隆基因的表达
　　1．原核表达体系
　　大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下述标准：①含大肠杆菌适宜的选择标志②具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子③含适当的翻译控制序列和翻译起始点等④含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。
　　大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：①由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA②由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理④很难表达大量的可溶性蛋白。
　　2．真核表达体系
　　与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA；将表达载体导入真核细胞的过程称转染，常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。
　　三、重组DNA技术与医学的关系
　　1?疾病基因的发现
　　通过对基因研究认识疾病分子机制的一个典型例子是脆性X综合症。
　　2?发展生物制药
　　3? DNA诊断
　　DNA诊断是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。
　　4?基因治疗
　　所谓基因治疗就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补充基因缺陷，从而达到治疗的目的。
　　5?遗传病的预防
　　(1)产前诊断。
　　（2）携带者测试。
　　（3）症候前诊断。
　　（4）遗传病易感性。
　　细胞间的信号传递：
　　特定细胞释放信息物质→信息物质经扩散或血循环到达靶细胞→与靶细胞的受体特异性结合→受体对信号转换并启动靶细胞内信使系统→靶细胞产生生物学功能
　　一、信息物质
　　（一）细胞间信息物质
　　凡由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质统称为细胞间信息物质。
　　分为如下三大类：
　　1．局部化学介质。如生长因子、细胞生长激素、一氧化氮和前列腺素等。不进入血液循环，而是通过扩散作用到达附近的靶细胞。
　　2．激素。由特殊分化的内分泌细胞释放，如胰岛素、甲状腺素和肾上腺素等，它们通过血液循环到达靶细胞，大多数对靶细胞的作用时间较长。
　　3．神经递质。由神经元突触前膜释放，如乙酰胆碱和去甲肾上腺素等，其作用时间较
　　（二）细胞内信息物质
　　在细胞内传递细胞调控信号的化学物质称为细胞内信息物质。包括无机离子，如Ca2+?；脂类衍生物，如二脂酰甘油(DAG)、N—脂酰鞘氨醇(Cer)；糖类衍生物，如三磷酸肌醇(IP?3)；核苷酸，如cAMP，cGMP；信号蛋白分子，如Ras和底物酶。底物酶主要为酪氨酸或丝/苏氨酸蛋白激酶，但它们本身又是其他酶的底物，如JAK、Raf等。通常将Ca2+?、DAG、IP?3、Cer、cAMP、cGMP等这类在细胞内传递信息的小分子化合物称为第二信使。
　　二、受体
　　受体是细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进而引起生物学效应的特殊蛋白质，个别是糖脂。能与受体呈特异性结合的生物活性分子则称为配体。其中，位于细胞浆和细胞核中的受体称为胞内受体，它们全部为DNA结合蛋白。存在于细胞质膜上的受体则称为膜受体，它们绝大部分是镶嵌糖蛋白。
　　（一）受体的分类、一般结构及功能
　　1．膜受体
　　（1）环状受体：配体依赖性离子通道。它们主要受神经递质等信息物质调节。当神经递质与这类受体结合后，可使离子通道打开或关闭，从而改变膜的通透性。这类受体主要在神经冲动的快速传送中起作用。
　　（2）七个跨膜α螺旋受体：一条肽链的糖蛋白，其N端在细胞外侧，C端在细胞内，中段形成七个跨膜螺旋结构和三个细胞外环与三个细胞内环。这类受体的特点是其胞浆面第三个环能与鸟苷酸结合蛋白G蛋白相偶联，从而影响腺苷酸环化酶或磷脂酶C活性，使细胞内产生第二信使。其信息传递可以归纳为：激素→受体→G蛋白→酶→第二信使→蛋白激酶→酶或功能蛋白→生物学功能。此类受体主要参与细胞物质代谢调节和基因转录调控。
　　G蛋白是一类和GTP或GDP相结合、位于细胞膜胞浆面的外周蛋白，G蛋白有两种构象，一种以αβγ三聚体存在并与GDP结合，为非活化型；另一种构象是α亚基与GTP结合并导致βγ二聚体的脱落，此型为活化G蛋白，G蛋白有许多种。常见的有激动型G蛋白（Gs），抑制型G蛋白（Gi）和磷脂酶C型G蛋白（Gp）。不同的G蛋白能特异地将受体和与之相适应的效应酶偶联起来。
　　（3）单个跨膜α螺旋受体 分为有酪氨酸蛋白激酶受体型和非酪氨酸蛋白激酶受体型。前者为催化型受体，它们与配体结合后即有酪氨酸蛋白激酶活性，既可导致受体自身磷酸化，又可催化底物蛋白的特定酪氨酸残基酸化；后者（如生长激素受体、干扰素受体）与配体结合后，可与酪氨酸蛋白激酶偶联而表现出酶活性。此类受体全为糖蛋白，且只有一个跨膜螺旋结构。
　　2胞内受体
　　胞内受体多为反式作用因子，当与相应配体结合后，又与DNA的顺式作用元件结合，调节基因转录。能与此型受体结合的信息物质有类固醇激素、甲状腺素和维甲酸等。胞内受体通常为单体蛋白质，包括四个区域。
　　(1)高度可变区 位于N末端，具转录激活作用。
　　（2）DNA结合区 富含半胱氨酸并有锌指结构，它能顺DNA螺旋转并与之结合。
　　（3）激素结合区 位于C末端，其作用包括①与配体结合；②与热休克蛋白结合；③使受体二聚化；④激活转录。
　　（二）受体作用的特点
　　受体与配体的结合有以下特点：
　　(1)高度专一性。
　　（2）高度亲和力。
　　（3）可饱和性。
　　(4)可逆性。
　　（5）特定的作用模式 受体在细胞内的分布，从数量到种类，均有组织特异性，并出现特定的作用模式，提示某种受体与配体结合后能引起某种特定的生理效应。
　　（三）受体的调节
　　若受体的数目减少和（或）对配体的结合力降低与失效，称之为受体下调，反之则称为受体上调。常见机制有：
　　(1)磷酸化和脱磷酸化的作用，例如胰岛素和表皮生长因子的受体酪氨酸磷酸化后才能与配体结合。
　　（2）膜磷脂代谢的影响。
　　（3）酶促水解作用。?—有些膜受体可通过内化方式被溶酶体降解。
　　（4）G蛋白的调节。G蛋白可在多种活化受体与腺苷酸之间起偶联作用，当一个受体系统被激活而使cAMP水平升高时，就会降低同一细胞受体对配体的亲和力。
　　三、信息的传递途径
　　（一）膜受体介导的信息传递
　　膜受体介导的信息传递至少存在五条途径，这五条途径之间相互独立又存在一定联系。
　　1?cAMP—蛋白激酶途径
　　该途径以靶细胞内cAMP浓度改变和激活蛋白激酶A(PKA)为主要特征，是激素调节物质代谢的主要途径。
　　（1）cAMP的合成与分解 胰高血糖素、肾上腺素和促肾上腺皮质激素与受体结合，形成激素—受体复合物而激活受体。活化的受体可催化Gs的GDP与GTP交换。导致Gs的α亚基与βγ解离，蛋白释放出αs－GTP。αs－GTP能激活腺苷酸环化酶（AC），催化ATP转化成cAMP，使细胞内cAMP浓度增高。
　　少数激素，如生长激素抑制素、胰岛素和抗血管紧张素Ⅱ等，它们受体活化后催化抑制性G蛋白解离，导致细胞内AC活性下降，从而降低细胞内cAMP水平。
　　cAMP在细胞中的浓度除与腺苷酸环化酶活性有关外，还与降解cAMP的磷酸二酯酶活性有关。一些激素，如胰岛素，能激活磷酸二酯酶，加速cAMP降解。
　　(2)cAMP的作用机制 cAMP对细胞的调节作用是通过激活蛋白激酶A(PKA)系统来实现的。PKA是一种由四聚体（C2R2）组成的别构酶。其中C为催化亚基，R为调节亚基。每个调节亚基上有2个cAMP结合位点，催化亚基具有催化底物蛋白质某些特定丝／苏氨酸残基磷酸化的功能。调节亚基与催化亚基相结合时，PKA呈无活性状态。当4分子cAMP与2个调节亚基结合后，调节亚基脱落，游离的催化亚基具有蛋白激酶活性。
　　（3）PKA的作用 PKA被cAMP激活后，能在ATP存在的情况下使许多蛋白质特定的丝氨酸和（或）苏氨酸残基磷酸化，从而调节细胞的物质代谢和基因表达。
　　1）对代谢的调节作用：以肾上腺素的作用机制为例，肾上腺素与质膜上的受体结合后，通过激动型G蛋白使AC激活。AC催化ATP生成cAMP，后者能进一步激活PKA。PKA一方面使无活性的磷酸化酶激酶b磷酸化而转变成有活性的磷酸化酶激酶a。同时，PKA也可使有活性的糖原合成酶的特定丝／苏氨酸磷酸化而失去活性，从而调控糖原代谢。
　　2）对基因表达的调节作用：在基因的转录调控区中有一类cAMP应答元件(CRE)，它可与cAMP应答元件结合蛋白（CREB）相互作用而调节此基因的转录。当PKA的催化亚基进入细胞核后，可催化CREB中特定的丝氨酸和（或）苏氨酸残基磷酸化。磷酸化的CREB形成同源二聚体，与DNA上的CRE结合，从而激活受CRE调控的基因转录。
　　PKA还可使核内组蛋白、酸性蛋白以及胞浆内的核蛋白体蛋白、膜蛋白、微管蛋白及受体蛋白等磷酸化，从而影响这些蛋白的功能。
　　2．Ca2+依赖性蛋白激酶途径
　　当细胞外液的 Ca2+通过钙通道进入细胞，或者亚细胞器内储存的 Ca2+释放到胞浆时，都会使胞浆内Ca2+水平急剧升高，随之引起某些酶活性和蛋白功能的改变，从而调节各种生命活动。
　　(1)Ca2+ 磷脂依赖性蛋白激酶途径
　　1）三磷酸肌醇(IP3)和二脂酰甘油(DAG)的生物合成和功能：促甲状腺素释放激素、去甲肾上腺素和抗利尿激素等作用于靶细胞膜上特异性受体后，通过特定的 G蛋白（Gp）激活磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI－PLC)，则水解膜组分——磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP２）而生成DAG和IP３。
　　DAG生成后仍留在质膜上，在磷脂酰丝氨酸和Ca2+?的配合下激活蛋白激酶C(PKC)。
　　IP３生成后，从膜上扩散至胞浆中与内质网和肌浆网上的受体结合，促进钙储库内的 Ca2+?释放，使胞浆内的 Ca2+浓度升高。 Ca2+能与胞浆内的 PKC结合共聚集至质膜，在DAG和膜磷脂共同诱导下，PKC被激活。
　　2）PKC的生理功能：
　　①对代谢的调节作用：PKC被激活后可引起一系列靶蛋白的丝氨酸和（或）苏氨酸残基发生磷酸化反应。靶蛋白包括质膜受体、膜蛋白和多种酶。PKC能催化质膜的 Ca2+通道磷酸化，促进 Ca2+流入胞内，提高胞浆Ca2+浓度；PKC也能催化肌浆网的Ca2+—ATP酶磷酸化，使钙进入肌浆网，降低胞浆的Ca2+浓度。由此可见，PKC能调节多种生理活动，使之处于动态平衡。
　　②对基因表达的调节作用：PKC对基因的活化过程可分为早期反应和晚期反应两个阶段。PKC能使立早基因的反式作用因子磷酸化，加速立早基因的表达。立早基因多数为细胞原癌基因（如 c—fos、AP1/jun），它们表达的蛋白质具有跨越核膜传递信息之功能，因此称为第三信使。第三信使受磷酸化修饰后，最终活化晚期反应基因并导致细胞增生或核型变化。
　　（2）Ca2+?，钙调蛋白依赖性蛋白激酶途径（Ca2+? CaM激酶途径）
　　钙调蛋白（CaM）为一条肽链的单体蛋白，有4个Ca2+结合位点，当Ca2+浓度达到一定高度时，CaM与Ca2+结合导致构象改变，激活Ca2+—CaM激酶。 Ca2+－CaM激酶的底物非常广，可以磷酸化许多蛋白质的丝氨酸和（或）苏氨酸残基，使之激活或失活。例如Ca2+—CaM激酶既能激活腺苷酸环化酶又能激活磷酸二酯酶，即它既加速cAMP的生成又加速cAMP的降解，使信息迅速传至细胞内，又迅速消失。从而能够调节PKC的激活和抑制。
　　3．cGMP—蛋白激酶途径
　　cGMP由GTP在鸟苷酸环化酶（GC）的催化下经环化而生成，经磷酸二酯酶催化而降解。 GC的激活间接地依赖 Ca2+。 Ca2+通过激活磷脂酶C和磷脂酶A2使膜磷脂水解生成花生四烯酸，花生四烯酸经氧化生成前列腺素而激活GC。
　　激素（如心房分泌的心钠素等）与靶细胞膜上的受体结合后，即能激活鸟苷酸环化酶，后者再催化GTP转变成cGMP。cGMP能激活cGMP依赖性蛋白激酶（蛋白激酶G），从而催化有关蛋白或有关酶类的丝／苏氨酸残基磷酸化，产生生物学效应。例如一氧化氮（NO）在平滑肌细胞中可激活鸟苷酸环化酶，使cGMP生成增加，激活蛋白激酶G，导致血管平滑肌松弛。
　　4．酪氨酸蛋白激酶途径细胞中的酪氨酸蛋白激酶(TPK)
　　包括两大类，第一类，位于细胞质膜上称为受体型TPK，如胰岛素受体、表皮生长因子受体及某些原癌基因（erb—B、kit、fmS等）编码的受体，它们均属于催化型受体第二类位于胞浆中，称为非受体型TPK，如底物酶JAK和某些原癌基因（src、yes、ber—abl等）编码的TPK，但它们常与非催化型受体偶联而发挥作用。
　　当配体与单跨膜螺旋受体结合后，催化型受体大多数发生二聚化，二聚体的TPK被激活，彼此可使对方的某些酪氨酸残基磷酸化，这一过程称为自身磷酸化；而非催化型受体的某些酪氨酸残基则被非受体型TPK磷酸化。
　　细胞内存在一些连接物蛋白I它们具有SH2结构域，SH2结构域能识别磷酸化的酪氨酸残基并与之结合。磷酸化的受体通过连接物蛋白可偶联其他效应蛋白，这些效应物蛋白本身具酶活性，故可逐级传递信息并将效应级联放大。
　　受体型TPK和非受体型TPK虽都能使底物酪氨酸残基磷酸化，但的信息传递途径有所不同：
　　（1）受体型TPK—Ras—MAPK途径 催化型受体与配体结合后，发生自身磷酸化并磷酸化中介分子——Grb2和SOS，使其活化，进而激活Ras蛋白。由于Ras蛋白为多种生长因子信息传递过程所共有，因此又称为Ras通路。
　　Ras蛋白是由一条多肽链组成的单体蛋白，由原癌基因ras编码而得名。它的性质类似于G蛋白中的Ga亚基，它的活性与其结合GTP或GDP直接有关，Ras与GDP结合时无活性，但磷酸化的SOS可促进GDP由Ras脱落，使Ras转变成GTP结合状态而活化。活化Ras蛋白可进一步活化Raf蛋白。Raf蛋白具有丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶活性，它可激活有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）系统。MAPK系统包括MAPK、MAPK激酶(MAPKK)、MAPKK激酶（MAPKKK）。它们是一组酶兼底物的蛋白分子。其中，MAPK催化细胞核内许多反式作用因子（如转录因子）的Ser／Thr残基磷酸化，导致基因转录或关闭。 受体型TPK活化后还可通过激活腺苷酸环化酶、多种磷脂酶（如PI－PLC、磷脂酶A和鞘磷脂酶）等发挥调控基因表达的作用。
　　（2）JAKs－STAT途径 一部分生长因子、大部分细胞因子和激素，生长激素、干扰素、红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子和一些白细胞介素等，其受体分子缺乏酪氨酸蛋白激酶活性，但它们能借助细胞内的一类具有激酶结构的连接蛋白JAKs完成信息转导。JAKs家族成员包括JAK1、JAK2、JYK2和JYK3，分子内均有SH2结构域。配体与非催化型受体结合后，能活化各自的JAKs。JAKs再通过激活STAT而最终影响到基因的转录调节。故将此途径又称为JAK-STAT信号转导通路。
　　由于在FAK-STAT通路中,激活后的受体可与不同的JAKs和不同的STAT相结合，因此该途径传导信号更具多样性和灵活性。
　　5．核因子kB途径
　　核因子kB(NF—kB)体系主要涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和调亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递。
　　在多数细胞类型，NF－kB在胞浆与抑制性蛋白质结合形成无活性的复合物。当肿瘤坏死因子等作用于相应受体后，可通过第二信使Cer等激活此系统，而病毒感染、脂多糖、活性氧中间体、佛波酯、双链RNA以及前述信息传递途径中活化的RKC、PkA等则可直接激活NF－kB。激活过程是通过磷酸化抑制性蛋白使其构象改变而从NF－kB脱落，使得NF－kB得以活化。活化的NF－kB进入细胞核，与DNA接触，并启动或抑制有关基因的转录。
　　（二）胞内受体介导的信息传递
　　通过经胞内受体调节的激素有糖皮质激素、盐皮质激素、雄激素、孕激素、雌激素、甲状腺素等，上述激素除甲状腺素外均为类固醇化合物。细胞内受体可分为核内受体和胞浆内受体，如雄激素、孕激素、雌激素和甲状腺素受体位于细胞核内，而糖皮质激素的受体位于胞浆中。
　　类固醇激素与核内受体结合后，受体的构象改变，暴露出DNA结合区。在胞浆中形成的类固醇激素—受体复合物以二聚体形式进入核内。在核内，激素—受体复合物作为转录因子与特异基因的激素反应元件结合，从而使特异基因易于（或难于）转录。
　　四、信息传递途径的交互联系
　　细胞内众多的信息传递途径并非毫无联系，而是交联对话，形成错综复杂的网络，共同协调机体的生命活动。信息传递途径的交联对话表现为：
　　（1）一条信息途径的成员，可参与激活或抑制另一条信息途径。如促甲状腺素释放激素与膜受体结合后，通过Ca2+磷脂依赖性蛋白激酶系统激活PKC，同时Ca2+浓度增高会激活腺苷酸环化酶，生成cAMP，进而激活PKA。
　　（2）两种不同的信息途径可共同作用于同一种效应蛋白或同一基因调控区而协同发挥作用。如糖原磷酸化酶，其α，β亚基可被PKA磷酸化而使酶活化，σ亚基可与Ca2+磷脂依赖性蛋白激酶系统通路产生的Ca2+?结合而使酶活化。上述两条途径在核内可使转录因子cREB的Ser133激酶磷酸化而活化，进而调控多种基因表达。
　　(3）一种信息分子可作用几条信息传递途径。如胰岛素与膜受体结合后，可通过受体底物激活，PLC产生IP3和PAG，激活PKC；另外也可激活Ras途径。
　　一、血浆蛋白质
　　按血浆蛋白质的来源，可以将血浆蛋白质分为两大类，一类是血浆功能蛋白质，对于血浆的功能必不可少。另一类血浆蛋白是在细胞组织更新或遭到破坏时漏入血浆的。
　　（一）血浆功能蛋白质具有以下几个共同特点
　　1．按重量计算，血浆蛋白质大部分是在肝合成的，少数由内皮细胞合成。
　　2．血浆蛋白质一般在粗面内质网的多核蛋白体上合成，先以蛋白前体形式出现，后经翻译后修饰加工，如去信号肽、糖基化、磷酸化。
　　3．血浆蛋白质大多是糖蛋白，含有N或O连接的寡聚糖键，清蛋白是主要的例外。
　　4．各种血浆蛋白质都有其特征性的循环半寿期。
　　5．许多血浆蛋白质有多态性。最典型的是ABO血型物质。
　　（二）血浆蛋白的功能
　　1.维持血浆胶体渗透压。
　　2.维持血浆正常PH值。
　　3.运输作用。
　　4.免疫作用。
　　5.催化作用。
　　6.营养作用。
　　7.凝血、抗凝血和纤溶作用。
　　(三)血浆蛋白的分类
种类& & & & 举例
载体蛋白& & & & 清蛋白、脂蛋白、运铁蛋白、铜蓝蛋白
免疫防御系统蛋白& & & & IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和补体C１～9等
凝血和纤溶蛋白& & & & 凝血因子、凝血酶原、纤溶酶原等
酶& & & & 卵磷脂：胆固醇酰基转移酶
蛋白酶抑制剂& & & & α1抗胰蛋白酶、α2巨球蛋白等
激素& & & & 促红细胞生成素、胰岛素等
参与炎症的蛋白& & & & C-反应蛋白、a&2酸性糖蛋白等
　　二、红细胞的代谢特点
　　成熟红细胞除质膜和胞浆外，无其他细胞器，其代谢比一般细胞单纯。
　　（一）糖代谢
　　1．糖酵解
　　血循环中的红细胞每天大约从血浆摄取约30g葡萄糖。绝大部分经糖酵解通路和2，3-二磷酸甘油酸旁路进行代谢。糖酵解是红细胞获得能量的惟一途径，每1mol葡萄糖经酵解生成2mol乳酸的过程中，产生2molATP和2mol NADH+H+。
　　红细胞的糖酵解途径还存在侧支循环——2，3-二磷酸甘油酸旁路。2，3-二磷酸甘油酸旁路仅占糖酵解的15％-50％，由于2，3-二磷酸甘油酸(2、3-、BPG)的生成大于分解，造成红细胞内2，3-BPG升高。红细胞内2，3-BPG虽然也能供能，但主要功能是调节血红蛋白的运氧功能。
　　2．磷酸戊糖途径
　　红细胞内少量葡萄糖经由磷酸戊糖途径代谢。红细胞内磷酸戊糖途径的代谢过程与其他细胞相同，主要功能是产主NADPH和H+。
　　3．红细胞内糖代谢的生理意义
　　(1)ATP的功能。
　　①维持红细胞膜上钠泵（Na+-K+－ATPase）的正常运转。钠泵通过消耗ATP，将Na+泵出、K+泵入红细胞以维持红细胞的离子平衡以及细胞容积和双凹盘状形态。②维持红细胞膜上钙泵（Ca2+－ATPase）的正常运行，将红细胞内的 Ca2+泵入血浆以维持红细胞内的低钙状态。③维持红细胞膜上脂质与血浆脂蛋白中的脂质进行交换。缺乏ATP时，脂质更新受阻，红细胞的可塑性降低，易于破坏。④用于谷胱甘肽、NAD?+的生物合成。⑤用于葡萄糖的活化，启动糖酵解过程。
　　（2）2，3-BPG的功能。2，3-BPG是调节血红蛋白（Hb）运氧功能的重要因素，可与血红蛋白结合。2，3-BPG的负电基团与β亚基的带正电基团形成盐键从而使血红蛋白分子的T构象更趋稳定，降低血红蛋白与O2亲和力，当血流经过PO2较高的肺部时，2，3-BPG的影响不大，而当血流经过PO2较低的组织时，红细胞中2，3-BPG的存在则显著增加O2释放，以供组织需要。在PO2相同条件下，随2，3-BPG浓度增大，HbO2释放的O2增多。人体能通过改变红细胞内 2，3-BPG的浓度来调节对组织的供氧。
　　（3）NADH和NADPH的功能。
　　NADH和NADPH是红细胞内重要的还原当量，它们具有对抗氧化剂、保护细胞膜蛋白、血红蛋白和酶蛋白的巯基等不被氧化，从而维持红细胞的正常功能。
　　磷酸戊糖途径是红细胞产生NADPH的唯一途径。红细胞中的NADPH能维持红细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）的含量，使红细胞免遭外源性和内源性氧化剂的损害。反应方程(见原书）。
　　由于氧化作用，红细胞内经常产生少量高铁血红蛋白（MHb），MHb中的铁为三价，不能带氧。但红细胞内有NADH—高铁血红蛋白还原酶和NADPH—高铁血红蛋白还原酶，催化MHb还原成Hb。另外，GSH和抗坏血酸也能直接还原MHb。在上述高铁血红蛋白还原系统中，以NADH—高铁血红蛋白还原酶最重要，由于有MHb还原系统的存在，使红细胞内MHBb只占Hb总量的1%～2％。
　　（二)脂代谢
　　成熟红细胞的脂类几乎都存在于细胞膜。成熟红细胞已不能从头合成脂肪酸，但膜脂的不断更新却是红细胞生存的必要条件。红细胞通过主动参入和被动交换不断地与血浆进行脂质交换，维持其正常的脂类组成、结构和功能。
　　（三）血红蛋白的合成与调节
　　血红蛋白是红细胞中最主要的成分，由珠蛋白和血红素组成。血红素不但是它的辅基，也是肌红蛋白、细胞色素、过氧化物酶等的辅基。血红素主要在骨髓的红细胞和网织红细胞中合成。
　　1．血红素的生物合成
　　合成血红素的基本原料是甘氨酸、琥珀酰CoA和Fe2+。合成的起始和终止阶段均在线粒体内进行，而中间阶段在胞浆内进行。
　　（1）合成过程。
　　血红素的生物合成可分为四个步骤：
　　1）δ-氨基-γ-酮戊酸（ALA）的生成：在线粒体内，由琥珀酰辅酶A与甘氨酸缩合生成δ-氨基-γ-酮戊酸（ALA）。催化此反应的酶是ALA合酶，其辅酶是磷酸吡哆醛。此酶是血红素合成的限速酶，受血红素的反馈调节。
　　2）胆色素原的生成：ALA生成后从线粒体进入胞液，在ALA脱水酶催化下，2分子ALA脱水缩合生成1分子胆色素原。
　　3）尿卟啉原与粪卟啉原的生成：在胞液中，4分子原色素胆由尿卟啉原Ⅰ同合酶、尿卟啉原Ⅲ同合酶、尿卟啉原Ⅲ脱羧酶催化，经线状四吡咯、尿卟啉原Ⅲ，最终生成粪卟啉原Ⅲ。
　　4）血红素的生成：胞液中生成的粪卟啉原Ⅲ再进入线粒体，经粪卟啉原Ⅸ氧化脱羧酶和原卟啉原皿氧化酶催化，使粪卟啉原Ⅲ的侧链氧化生成原卟啉Ⅸ。通过亚铁螫合酶又称血红素合成酶的催化，原卟啉IX和 Fe2+结合，生成血红素。
　　血红素生成后从线粒体转运到胞液，在骨髓的有核红细胞及网织红细胞中，与珠蛋白结合成为血红蛋白。血红素合成的特点可归结如下：a．体内大多数组织均具有合成血红素的能力，但合成的主要部位是骨髓与肝，成熟红细胞不含线粒体，故不能合成血红素。b．血红素合成的原料有琥珀酰辅酶 A，甘氨酸及 Fe2+等简单小分子物质。c．血红素合成的起始最终过程均在线粒体中进行，而其他中间步骤则在胞液中进行。此定位对血红素的反馈调节有重要意义。
　（2）合成的调节。血红素的合成受多种因素的调节，其中最主要的调节步骤是ALA的生成。
　　1）ALA合酶：它是血红素合成体系的限速酶，受血红素的别构抑制调节。此外，血红素还可以阻抑ALA合酶的合成。如果血红素的合成速度大于珠蛋白的合成速度，过多的血红素可以氧化成高铁血红素，后者对ALA合酶也具有强烈抑制作用。
　　2）某些类固醇激素：能诱导ALA合酶，从而促进血红素的生成。
　　3）促红细胞生成素：促红细胞生成素主要在肾合成，缺氧时即释放入血。促红细胞生成素是红细胞生成的主要调节剂，可同原始红细胞的膜受体结合，加速有核红细胞的成熟，以及血红素和Hb的合成。
　　2.血红蛋白的合成
　　血红蛋白中珠蛋白的合成与一般蛋白质合成相同。珠蛋白的合成受血红素调控。血红素的氧化产物高铁血红素能促进的血红蛋白的合成。
　　一、肝在物质代谢中的作用
　　（一）肝在糖代谢中的作用
　　肝的糖代谢不仅为自身的生理活动提供能量，还为其他器官的能量需要提供葡萄糖。肝通过糖原的合成与分解、糖的异生作用来维持血糖浓度的稳定，保障全身各组织，尤其是大脑和红细胞的能量供应。
　　饱食状态下，肝很少将所摄取的葡萄糖转化为二氧化碳和水，大量的葡萄糖被合成为糖原贮存起来。在空腹状态下，肝糖原分解释放出血糖，供中枢神经系统和红细胞等利用。饥饿状态下，肝糖原几乎被耗竭。糖异生便成为肝供应血糖的主要途径。一些非糖物质如甘油、乳酸、丙氨酸等在肝内经糖异生途径转化为糖。空腹24～48小时后，糖异生可达最大速度。其主要原料氨基酸来自肌肉蛋白质的分解。此时，肝还将脂肪动员所释放的脂酸氧化成酮体，供大脑利用以节省葡萄糖。
　　（二）肝在脂类代谢中的作用
　　肝在脂肪类的消化、吸收、合成、分解与运输过程中均具有重要作用。
　　肝内脂肪酸的代谢途径有二：内质网中的酯化作用和线粒内的氧化作用。饥饿时脂库脂肪动员，释放的脂肪酸进入肝内代谢。肝是体内产生酮体的唯一器官。肝氧化脂肪酸的能力有限，但酯化脂肪酸的能力很强。饱食后，肝合成脂肪酸，并以甘油三酯的形式贮存于脂肪库，肝合成甘油三酯、磷脂和胆固醇，并以VLDL的形式分泌入血，供其他组织器官摄取与利用。
　　肝还是降解LDL的主要器官。肝在胆固醇代谢中起重要的作用，肝是合成胆固醇最活跃的器官，肝对胆固醇转化也具有重要作用。HDL的重要作用是将肝外组织中的胆固醇携带入肝。肝是体内胆固醇的重要排泄器官，粪便中的胆固醇除来自粘膜脱落细胞外，均来自肝。胆汁酸的生成是肝降解胆固醇的最主要的途径。肝不断将胆固醇转化为胆汁酸，以防止体内胆固醇的超负荷。
　　（三）肝在蛋白质代谢中的作用
　　1.分解代谢
　　肝细胞膜受体识别某些血浆蛋白而内吞，在溶酶体中降解。肝对除支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）以外的所有氨基酸均有分解代谢作用，可进行转氨基、脱氨基及脱羧基等反应。芳香族氨基酸代谢产生的芳香族胺（如章胺）在肝病时不能得到清除，可模拟正常的神经递质，引起神经活动紊乱。
　　氨是氨基酸代谢的主要产物，肠道氨是血氨的主要来源。肝是清除血氨的主要器官，氨在肝中通过鸟氨酸循环合成尿素。其次，肝可将氨转变成谷氨酰胺。
　　2.合成代谢
　　肝除合成自身所需蛋白质以外，还合成多种分泌蛋白质，如清蛋白、凝血酶原、纤维蛋白原，载脂蛋白，以及部分球蛋白。血浆清蛋白是许多物质(如游离脂肪酸、胆红素等)的载体，并在维持血浆胶体渗透压方面起重要作用。
　　（四）肝在维生素代谢中的作用
　　肝脏在储存、运输、代谢及吸收维生素中起重要作用。
　　肝脏分泌的胆汁酸盐可协助脂溶性维生素的吸收肝脏是维生素A、K及B12的主要储存场所，还富含B1、B2、B6，遍多酸和叶酸。
　　肝脏可合成维生素D结合蛋白和视黄醇结合蛋白，通过血液循环转运维生素D和A。
　　多种维生素在肝中转变为辅酶的组成成分。如肝将尼克酰胺转变为辅酶Ⅰ(NAD+)及辅酶Ⅱ(NADP+)的组成部分，将泛酸转变为辅酶A的组成部分，将维生素B1转化为焦磷酸硫胺素，将胡萝卜素转变为维生素A，将维生素D3羟化为25羟维生素D3。维生素K参与肝中凝血酶原的合成。
　　（五）肝在激素代谢中的作用
　　多种激素在发挥其调节作用后，主要在肝中转化、降解或失去活性，这一过程称为激素的灭活。
　　二、肝的生物转化作用
　　(一)概述
　　人体内经常存在非营养物质，这些物质不能构成组织细胞的结构成分，又不能氧化供能，其中一些对人体有一定的生物学效应或毒性作用，机体在排出这些物质以前常将其进行各种代谢转变，这一过程称为生物转化。肝是机体内生物转化的主要器官。
　　生物转化的生理意义在于它对体内的非营养物质进行转化，使其生物学活性降低或消除（灭活作用），或使有毒物质的毒性减低或消除（解毒作用）。更为重要的是生物转化作用可使这些物质的溶解性增高，变为易于从胆汁或尿液中排出体外的物质。应该指出的是，有些物质经肝的生物转化后，其毒性反而增加或溶解性反而降低，不易排出体外。
　　（二）生物转化反应的主要类型
　　小结：参与肝生物转化的酶类
& & & & 酶类& & & & 辅酶或结合物& & & & 细胞内定位
第一相反应& & & & 氧化酶类?
①细胞色素P450?
②单胺氧化酶?
③脱氢酶类?
水解酶类& & & & NADPH，O2?
NADH或NADPH?& & & & 内质网?
线粒体或胞液?
胞液或内质网
第二相反应& & & & 转葡糖醛酸酶?
谷胱甘肽转硫酶?
乙酰基转移酶?
酰基转移酶?
甲基转移酶& & & & 活性葡糖醛酸CUDPGA?
活性硫酸(PAPS)?
谷胱甘肽(GSH)?
S-腺苷甲硫氨酸& & & & 内质网?
胞液与内质网?
胞液与内质网
　　生物转化过程所包括的化学反应可归纳为两相。第一相反应包括，氧化、还原、水解反应，使得物质分子中某些非极性基团转变极性基团，增加了亲水性。第二相为结合反应，物质分子进一步与葡萄糖醛酸、硫酸或氨基酸等极性更强的物质结合，以得到更大的溶解度。
　　1．氧化反应
　　(1)微粒体依赖P450的单加氧酶系 该酶又称混合功能氧化酶，催化脂溶性物质从分子氧中接受一个氧原子，生成羟基化合物或环氧化合物。进入人体的外来化合物约一半以上经此系统氧化。单加氧酶的羟化作用不仅增加药物或毒物的水溶性，有利于排泄，而且是许多物质代谢不可缺少的步骤。有些致癌物质经氧化后丧失其活性，而有些本来无活性的物质经氧化后生成有毒或致癌物质。例如，多环芳烃经加单氧酶作用生成的环氧化合物是致癌物质，需经进一步的生物转化。
　　（2）线粒体单胺氧化酶系 存在于线粒体内的单胺氧化酶是另一类参与生物转化的氧化酶类。它是一种黄素蛋白，可催化胺类（如组胺、酪胺、色胺、尸胺和腐胺)氧化脱氨基生成相应的酸，后者进一步在胞液中醛脱氢酶催化下氧化成酸。
　　（3）醇脱氢与醛脱氢酶系 肝细胞内含有非常活跃的醇脱氢酶(ADH)，可催化醇类(如乙醇)氧化成醛，后者再经醛脱氢酶(SALDH)作用下进一步氧化成酸。大量饮酒会经ADH和微粒体乙醇氧化系统(乙醇P450加单氧酶)将乙醇氧化为乙醛，再ALDH催化进行进一步氧化。
　　2．还原反应
　　肝细胞中的主要还原酶类是硝基还原酶类和偶氮还原酶类，分别催化硝基化合物与偶氮化合物从NADPH接受氢，还原成相应的胺类。如硝基苯、偶氮苯。
　　3．水解反应
　　肝细胞的胞液与微粒体中含有多种水解酶类，可将脂类、酰胺类和糖苷类化合物水解，以减低或消除其生物活性。如乙酰水杨酸。
　　4．结合反应
　　第二相反应是结合反应。肝细胞内含有许多催化结合反应的酶类。凡含有羟基、基或氨基的药物、毒物或激素均可与葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽、甘氨酸等发生结合反应，或进行酰基化和甲基化等反应。与葡萄糖醛酸、硫酸和酰基的结合反应最为重要，尤以葡萄糖醛酸的结合反应最为普遍。
　　（1）葡糖醛酸结合反应 肝细胞微粒体中含有非常活跃的葡萄糖醛基转移酶。它以尿苷二磷酸α-葡糖醛酸(UDPGA)为供体，催化葡糖醛酸基转移到多种含极性基团的分子(如醇、酚、胺、羧基化合物等)
　　（2）硫酸结合反应 3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸（PAPS）是活性硫酸供体，在肝细胞液硫酸转移酶的催化下，将硫酸基转移到多种醇、酚或芳香族胺类分子上，生成硫酸酯化合物。如雌酮。
　　（3）酰基化反应 肝细胞液中含有乙酰基转移酶，催化乙酰基从乙酰辅酶A转移到芳香族胺化合物，形成乙酰化衍生物。例如，大部分磺胺类药物和异烟肼在肝内通过这种形式灭活。
　　（4）谷胱甘肽结合反应 谷胱甘肽在肝细胞胞液谷胱甘肽S-转移酶催化下，可与许多卤代化合物和环氧化合物结合。
　　(5)甘氨酸结合反应 甘氨酸在肝细胞线粒体酰基转移酶的催化下可与含羧基的外来化合物结合。例如，胆酸和脱氧胆酸可与甘氨酸或牛磺酸结合。
　　（6）甲基化反应 体内一些胺类生物活性物质和药物可在肝细胞胞液和微粒体中甲基转移酶的催化下，通过甲基化灭活。S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是甲基的供体。
　　三、胆汁酸的代谢
　　（一）胆汁酸的分类
　　胆汁酸按其结构可分为两类：一类是游离胆汁酸，包括胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸和石胆酸；另一类是上述胆汁酸分别与甘氨酸和牛磺酸相结合的产物，称为结合胆酸，主要是甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸。从来源进行分类，也可分为两类：由肝细胞合成的胆汁酸称为初级胆汁酸，包括胆酸、鹅脱氧胆酸及其与甘氨酸和牛磺酸的结合产物；初级胆汁酸在肠管中受细菌作用生}