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两种检测方法检测乙型肝炎病毒突变株表面抗原结果比较
摘　要:目的：根据平行检测结果比较Roche电化学发光法乙肝表面抗原第二代试剂和Abbott化学发光法乙肝表面抗原试剂检测乙型肝炎病毒突变株表面抗原结果的异同,探讨一种合理的乙型肝炎病毒突变株检测方法。方法：将296例临床随检血液样本和13种已知乙型肝炎病毒突变株同时用两种方法进行平行检测,将检测结果进行统计分析,判断两种方法检测结果的异同。结果：①电化学发光法和Abbott化学发光法对普通临床298例血液样本进行HBsAg检测,其相关因系数为0.88,二者阴阳性符合率为100%。②电化学发光法对13种突变株的检测结果均为阳性,检出率为100%,Abbott化学发光法仅检测出10种,有3种检测结果为阴性,检出率为76.9%。结论：Roche提供的电化学发光法乙肝表面抗原第二代试剂,除对普通临床血液样本HBsAg的检测结果与传统金标准法相比具有良好的阴阳性符合率,还针对乙型肝炎病毒突变株具有良好的检测效果,即有良好的特异性和敏感性。
作者单位：(广东省阳春市人民医院 广东阳春 529600)【摘要】&
目的：根据平行检测结果比较roche电化学发光法乙肝表面抗原第二代试剂和abbott化学发光法乙肝表面抗原试剂检测乙型肝炎病毒突变株表面抗原结果的异同，探讨一种合理的乙型肝炎病毒突变株检测方法。方法：将296例临床随检血液样本和13种已知乙型肝炎病毒突变株同时用两种方法进行平行检测，将检测结果进行统计分析，判断两种方法检测结果的异同。结果：①电化学发光法和abbott化学发光法对普通临床298例血液样本进行hbsag检测，其相关因系数为0.88，二者阴阳性符合率为100%。②电化学发光法对13种突变株的检测结果均为阳性，检出率为100%，abbott化学发光法仅检测出10种，有3种检测结果为阴性，检出率为76.9%。结论：roche提供的电化学发光法乙肝表面抗原第二代试剂，除对普通临床血液样本hbsag的检测结果与传统金标准法相比具有良好的阴阳性符合率，还针对乙型肝炎病毒突变株具有良好的检测效果，即有良好的特异性和敏感性。
【关键词】& 电化学发光法;化学发光法;乙型肝炎病毒;突变株
abstract objective：article probes into reasonable detection of mutation with hepatitis b virus (hbv) according to comparison between roche electrogenerated chemiluminescence on hbsag ii reagent and abbott chemiluminescence hbsag reagent on surface antigens of hbv mutation.method：a dual-ways parallel examination was introduced between 296 cases clinical random blood samples and 13 ones with known mutation with hbv.the statistic analysis for these experimental results indicates the differences among samples.results： the hbsag testing between roche electrogenerated chemiluminescence and abbott chemiluminescence on 296 cases of clinical samples show that the correlative coefficient is 0.88 and their negative accordant ratios is 100%.2.the experimental result with electrogenerated chemiluminescence among 13 mutation blood sample is all positive，picks out rate is 76.9%.conclusion：the electrogenerated chemiluminescence on hbsag ii reagent on common clinical blood samples raises the negative accordant ratio with traditional amsel method，also gaining better testing result for mutation with hbv including superior differentiation and sensitivity.
　　key words the electrogeneratmutation with hepatitis b virus
　　乙型肝炎病毒低水平携带是hbsag阴性乙型肝炎感染的主要形式[1]，同时由于乙型肝炎病毒其本身的特点而较容易发生变异[2]，在慢性感染过程中，变异可自发或在治疗后发生。据报道该病毒的每一个基因和每一种病毒蛋白都可发生突变，使其感染后临床表现多样化、临床经过复杂化，以及治疗困难化。变异可发生在 hbv基因组的前 c/c、x、前 s/s和dna-p等多个区域，形式包括突变、插入或缺失、移框突变等[3]。目前已经发现的比较重要的变异有以下几种：一是可以造成乙肝疫苗接种失败的变异;二是可以导致&小三阳&慢性乙肝的变异;三是可以对抗病毒治疗产生耐药的变异，这主要发生在药物与病毒结合的位置，当病毒基因发生变异时，这些结合位点的空间结构发生改变，药物与病毒的结合能力下降，因而导致病毒耐药。近年来，运用核苷类药物治疗hbv感染较普遍，由此可导致 hbv的变异不断发生，需动态监测变异的发生、发展与临床关系。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 roche elecsys2010电化学发光免疫分析仪用材料：elecsyshbsagii乙型肝炎表面抗原第二代试剂，配套定标液，质控品。
　　1.1.2 abbott axsym化学发光免疫分析仪用材料：axsym乙型肝炎表面抗原试剂，配套定标液，质控品。
　　1.1.3 收集296例普通临床血液样本(乙肝病毒感染者hbsag非亚型和突变型)。
　　1.1.4 生物研究中心提供的13种乙型肝炎突变株hbsag阳性样本。
　　1.2 方法
　　1.2.1 遵照两种方法所用仪器相关操作指导书进行操作。
　　1.2.2 检测原理
　　(1)roche elecsys采用双抗体夹心法原理，整个检测过程18min完成。①50&l标本、生物素化的抗hbsag单克隆抗体和钌(ru)标记的抗hbsag单克隆抗体混匀，形成夹心复合物。②加入链霉亲和素包被的微粒，使上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。③反应混和液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。elecsys自动将标本产生的光电信号与从hbsag定标液得出的cutoff值相比较。
　　(2)abbott axsym采用双抗体夹心法原理。①标本和抗hbs抗体包被的微粒子和生物素标记的抗hbs抗体在反应杯中反应，标本中的hbsag与包被在微粒子上的抗体和生物素化的抗hbsag抗体结合形成夹心型抗原抗体复合物。②吸取反应混合液到纤维杯中，微粒子与玻璃纤维结合，洗涤未结合的物质，加入碱性磷酸酶标记的抗生物素抗体，此酶标记抗体与固相上的免疫复合物结合。③经过洗涤多余的酶，加入底物mup，免疫复合物上的alp催化底物发光。光强度与标本中hbsag有关，根据校准曲线计算出待测hbsag的量。
　　1.2.3 对两种方法所用试剂进行常规定标、质控，并保证质控结果在允许范围内。
　　1.2.4 普通临床血液样本296例(乙肝病毒感染者hbsag非亚型和突变型)用两种对比方法平行检测，记录结果，检测完毕，将血清分离后于4℃储藏;对电化学发光法检测结果在0.9～1.0coi之间的样本进行hbsag证实试验(检测过程同厂家hbsag证实试验程式)。
　　1.2.5 将生物研究中心提供的13种乙型肝炎突变株阳性样本从冰箱取出进行复溶后，按编号顺序平行上机检测，记录结果，将样本密封置于4℃储藏。第2日从冰箱取出待回温后再平行重复检测1次，并记录结果。
　　2 结果
　　2.1 两种对比方法对296例普通临床血液样本的平行检测hbsag结果见表1。两种对比方法对普通临床的血液样本平行检测hbsag结果的阴阳性符合率为100%。
　　2.2 两种方法检测乙型肝炎病毒突变株hbsag结果见表2。两种方法阴性参考值均为<1，elecsys法结果均显示阳性，检出率为100%，符合研究中心预期值，而axsym只有10例结果显示阳性，有3例显示为阴性，检出率仅为76.9%，且10例阳性结果中有5例在1.1～1.8范围内，即判断为弱阳性。
　　3 讨论
　　乙肝病毒包膜蛋白，即乙肝表面抗原，是一种糖基化的脂蛋白，通常以直径22nm的球形颗粒和相似大小的丝状体形式大量存在于感染者血清中。表面抗原决定簇，是一种突出于病毒颗粒表面的可见双环结构，是主要的中和表位。针对这一抗原决定簇的抗体可以保护成人感染所有常见乙肝病毒亚型。亚型决定簇d或y和w或r也定位于可见环区。
　　在乙肝感染过程中表面抗原是最早出现的血清标志物之一，并且比肝功异常和黄疸出现早2～8周。在自限性疾病中，表面抗原几个月内被清除。如果表面抗原持续存在6个月以上，自身清除几乎是不可能，感染者被认为是慢性hbv携带者。 表 1 296例普通临床血液样本hbsag检测结果表 2 乙型肝炎病毒突变株hbsag检测结果*标记为阴性值 在目前市售表面抗原检测试剂盒中，最常用的是酶联免疫吸附法。这些方法把单克隆或多克隆乙肝表面抗体结合到固相载体上，然后用一个标记二抗检测捕获的抗原。尽管筛查试验的水平很高，但输血后hbv感染仍有报道[1，4-6]。对市售的试剂盒中存在假阴性结果的解释有3种可能性：①慢性hbv携带者的表面抗原低于检出限。例如，在乙肝核心抗体作为唯一血清感染标志物的人群中，有相当高的比例是低水平的hbsag慢性病毒携带者。②病毒变异株产生了试剂盒中所用抗体不能识别的序列。不同地区，在选择性主动免疫接种的压力下出现疫苗逃逸突变。③基因组其他部分的变异抑制了表面抗原的产生。
　　临床实验室在检测单纯抗-hbc阳性hbv携带者时，通常未能检出表面抗原的一个原因是初浆具有较大变异，而且整个包膜蛋白比hbsag阳性质控可变性更大。同时，多克隆抗体方法也未能观察到完全灵敏度，特别是检测s基因变异的灵敏度。标准方法中使用针对不同s基因变异的单克隆抗体，在检测系列稀释的hbsag变异体时可能比血清学方法具有更高的灵敏度。另外，有报导称国产hbsag试剂盒检测变异株的能力不同，各试剂分别有3～8种变异株不能检出[7]。而elecsys法除对普通临床血液样本hbsag的检测结果与传统金标准法相比具有良好的阴阳性符合率，还在乙型肝炎病毒突变株的检测方面具有明显优势，是一种高灵敏高特异性的方法，代表了检测供血者的表面抗原和常规实验室诊断的替代性方法的一个大的改进，进一步改善了包括能识别流行病学相关表面抗原变异的单克隆抗体和提高了灵敏度。 第2期 叶火林：两种检测方法检测乙型肝炎病毒突变株表面抗原结果比较
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金月芽期刊网 2018黄振勇& 罗永钊（暨南大学医学院第五附属医院清远市人民医院& 广东清远& 511500）
【中图分类号】R512.6+2【文献标识码】A【文章编号】（8-03
【摘要】目的 探讨外周血中电化学发光免疫分析法(ECLIA)定量检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)与荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA(HBV-DNA)载量之间的相互关系。方法& 运用电化学发光法、荧光定量PCR法两种方法同时检测180份血清标本的HBsAg含量和HBV-DNA载量，并按HBV-DNA载量分成4组，对其结果应用统计学分析。结果& 在180份血清标本中，HBsAg阳性为161例，占89.4%，HBV-DNA阳性为101例，占56.1%，两者同时为阳性的有101例，占56.1%。经统计学分析HBsAg定量与HBV-DNA载量之间无统计学意义，没有相关性（r＜0.3，P＞0.05）。结论& 电化学发光法定量检测HBsAg与HBV-DNA载量无关，联合检测两者可以为临床提供诊断治疗依据。
【关键词】乙型肝炎表面抗原(HBsAg)& HBV-DNA& 电化学发光免疫分析法(ECLIA)& 荧光定量PCR(FQ-PCR)
The correlation between quantitative detection of Hepatitis B surface antigen by Electrochemi luminescene and Fluorescence quantitative PCR detection of Hepatitis B virus DNA load
HUANG Zhen-yong ，Luo yong-zhao&& （The Fifth Affiliated Hospital of Medical College Jinan University， Qingyuan city People&s HospitalGuangdong Qingyuan& 511500）
【Abstract】Objective& To explore the correlation between quantitative detection of Hepatitis B surface antigen (HBsAg) by Electrochemi luminescene immunoassay (ECLIA) and Fluorescence quantitative PCR detection of Hepatitis B virus DNA (HBV-DNA) load in peripheral blood. Method& Serum samples from 180 patients were measured simultaneously the quantitative of HBsAg and HBV-DNA with Electrochemi luminescence immunoassay and Fluorescent quantitative PCR, Pressing HBV-DNA to load into 4 groups all attained data were then undergone statistical analysis. Result& In the 180 serum samples,HBsAg was positive in 161 cases, accounting for 89.4%, HBV-DNA was positive in 101 cases, accounting for 56.1%, both positive in 101 cases, accounting for 56.1% .The relevant analysis is no statistical significance between HBsAg and HBV-DNA（r＜0.3，P＞0.05）. Conclusion& That is no correlation between the quantitative HBsAg and HBV-DNA load, Combined detection of both can be provided for clinical in diagnosis and treatment of foundation.
【Key words】HbsAg& HBV-DNA& Electrochemi luminescence immunoassay (ECLIA)& Fluorescent quantitative PCR(FQ&PCR)
&&&&&&& 乙型肝炎是一种由乙肝病毒(HBV)传播的慢性传染性疾病，是当今流行最广泛，危害最严重的病毒性肝炎之一。目前我国多以血清感染标志物(主要是HBsAg)及荧光定量PCR ( FQ-PCR)检测HBV-DNA作为临床分析和判断乙肝患者病情、疗效及预后的主要依据。但受到实验室要求的严格限制，荧光定量PCR难以普及应用和无法快速检查。本文运用电化学发光法定量检测180份血清标本的HBsAg，并结合HBV-DNA载量探讨两者之间的关系。希望能对临床诊断、治疗乙型肝炎及其预后提供有参考意义的依据。
&&&&&&& 1 材料与方法
&&&&&&& 1.1标本来源& 2011年6月至10月间清远市人民医院门诊及住院患者180例，其中男123例，占68.3%，女57例，占31.7%，年龄10&65岁，诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》，抽静脉血分离血清，检测后留取标本-20℃冷冻保存备复查。
&&&&&&& 1.2检测方法& HBsAg定量采用电化学发光法，仪器为罗氏全自动电化学发光免疫分析系统罗氏E170，检测试剂由罗氏诊断产品（上海）有限公司提供。HBV-DNA定量检测采用荧光定量PCR法，仪器为ABI 7000荧光定量PCR仪，检测试剂由上海克隆生物高技术有限公司提供。样本检测严格按照说明书进行操作。
&&&&&&& 1.3统计学处理& 用Microsoft Excel软件建立数据库，整理后用SPSS13.0统计软件进行Pearson相关分析和处理。
&&&&&&& 2 结果
&&&&&&& 2.1 HBsAg定性与HBV-DNA定性检测结果比较& 180例标本中，HBsAg阳性同时HBV-DNA阳性为101例，占56.1%（101/180）；HBsAg阳性而HBV-DNA阴性的为60例，占33.3%（60/180），HBsAg阴性同时HBV-DNA阴性为19例，占10.6%（19/180），HBsAg阴性而HBV-DNA阳性的为0例。见表1。
&&&&&&& 表1& 180例标本HBsAg定性与HBV-DNA定性检测结果比较
&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&& &注：以HBsAg&1.0s/co为阳性，HBV-DNA&1000IU/ml为阳性作为定性判断标准。
&&&&&&& 2.2 按HBV-DNA值分组& 阴性组:HBV-DNA&1000IU/ml；低载量组: 103&105 IU/ml；中载量组: 105&107IU/ml；高载量组:＞1.0&107IU/ml，HBsAg定量与HBV-DNA载量检测结果比较见表2。
&&&&&&& 表2& 40例HBV-DNA载量与HBsAg定量检测结果平均值比较
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&n&&&&&&&&&&HBV-DNA(IU/ml)&HBsAg定量（s/co）
&&&&&&& 阴性&&&&&&&&&&&&&&&&&&&79&&&&&&&&&&&&&1000&&&&&&&&&&&&&&&&&&&3684.74
&&&&&&& 低载量组&&&&&&&&&&35&&&&&&&&&&4.84E+03&&&&&&&&&&&&&&&&&&&5614.96
&&&&&&& 中载量组&&&&&&&&&&39&&&&&&&&&&1.43E+06&&&&&&&&&&&&&&&&&&&4207.34
&&&&&&& 高载量组&&&&&&&&&&27&&&&&&&&&&&&1.43E+06&&&&&&&&&&&&&&&&&&&4052.74
&&&&&&& 2.3 HBsAg定量与HBV-DNA相关性分析& 根据 HBV-DNA载量不同分为四组,分别与相应的HBsAg进行 Pearson相关分析发现两者之间r值均在0.3以内，P值均& 0.05（见表3），说明HBsAg定量与HBV-DNA载量缺乏相关性。
&&&&&&& 表3& 四组不同HBV-DNA载量与HBsAg定量的相关性分析
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&R值&&&&&&&&&&&&&&&&&&&P
&&&&&&&&&&&&&&&&&阴性&&&&&&&&&&&&&&&&&&&/&&&&&&&&&&&&&&&&&&&/
&&&&&&&&&低载量组&&&&&&&&&&0.16&&&&&&&&&&&&&&&&&&&0.36
&&&&&&&&&中载量组&&&&&&&&&&0.01&&&&&&&&&&&&&&&&&&&0.94
&&&&&&&&&高载量组&&&&&&&&&&0.27&&&&&&&&&&&&&&&&&&&0.17
&&&&&&&&&3 讨论
&&&&&&&&&乙型肝炎是一种由乙肝病毒(HBV)引起的,经血液、母婴及性接触等途径传播的慢性传染性疾病。乙肝的临床表现呈多样化，早期无明显症状，易发展成慢性肝炎和肝硬化，少数患者可转变为原发性肝癌。本病在我国广泛流行，是严重危害人民健康的乙类传染病之一。
&&&&&&&&&近年随着荧光定量PCR技术在临床上的广泛应用，定量测定HBV-DNA已经成为临床乙肝诊断的有效手段。乙肝病毒在宿主体内复制是慢性HBV感染的主要决定因素。血清HBV-DNA水平是病毒复制活动最直接和最可靠的标志，也是目前评价HBV复制情况的&金标准&[1]。定量测定HBV- DNA为研究病毒水平与病情严重程度与传染性的关系，监测疾病进展和评价抗病毒药物的疗效等提供了可靠依据。但是，PCR操作技术较复杂，费用相对较高，对实验条件和操作人员的要求比较严格，易受在提取标本DNA时容易受到污染等多种因素影响，因此，在技术不成熟的医院难以推广应用。此外，相当比例的慢性乙型肝炎患者，在应用抗病毒药物治疗段时间后，血清 HBV-DNA常降至较低水平，难以检测到。因此，它作为何时停用抗病毒药物的评价指标有一定局限性。
&&&&&&&&&乙型肝炎病毒表面抗原是HBV的外膜蛋白，为一条由病毒S基因编码的多肽，在病毒感染肝细胞过程中起重要作用。人感染HBV后4&7天，血清中出现HBsAg，在免疫耐受期、慢性乙型肝炎期(免疫清除期)、非活动携带状态期和再活动期，HBV感染以及部分肝硬化和肝癌患者的血清中均可检测到HBsAg；此外，在HBV感染的潜伏期后期、急性期也可检测到HBsAg，所以HBsAg检测一直是临床诊断HBV感染的传统手段[2]。以往检测HBsAg多以酶联免疫吸附法（ELISA）的方法，血清中的HBsAg定量是经过酶标仪比色得出，有学者以该方法作研究，认为血清HBsAg水平与HBV-DNA效价呈正相关，可反映病毒在宿主体内的活动程度[3，4，5]。但也有学者认为两者之间缺乏相关性。
&&&&&&&&&国际上近年兴起以HBsAg定量作为慢性乙肝或干扰素、核苷类似物抗病毒疗效及治疗终点的评估指标的研究，但HBsAg定量检测方法并不是传统的ELISA,而是电化学发光法（ECLIA）。本文运用 ECLIA定量检测180例血清标本中的HBsAg。根据表1可知在180份血清标本中，HBsAg阳性同时HBV-DNA阳性为101例，占56.1%（101/180）；HBsAg阳性而HBV-DNA阴性的为60例，占33.3%（60/180），HBsAg阴性同时HBV-DNA阴性为19例，占10.6%（19/180）。由此可见，HBsAg和HBV-DNA的阳性检出率是有区别的：HBsAg阳性，HBV-DNA不一定是阳性；HBV-DNA阴性，HBsAg也不一定是阴性。根据表2结果可知四组HBsAg定量与HBV-DNA载量检测结果比较并没有明显的线性关系，但HBsAg定量随着HBV-DNA载量的增多而稍微减小。这是由于ECLIA定量检测 HBsAg存在钩状效应(hook effecl)，在现阶段的检测技术中是不可避免的。在低、中、高载量组中HBsAg含量有一定的数值，而且在HBV-DNA阴性组中HBsAg含量也有比较高的数值。造成这样结果的原因可能如下：FO-PCR只能检测血中游离的 HBV-DNA，当病毒整合到肝细胞染色体上，随同肝细胞一起复制、表达时， HBsAg可出现阳性反应，但血清中已没有HBV颗粒存在，此时FQ-PCR为阴性反应；在应用抗病毒药物治疗有效时，血清 HBV-DNA常降至较低水平，有时会低于检测下限而显示为阴性。
&&&&&&&&&一些学者认为，血清HBsAg水平与HBV-DNA效价呈正相关。但本研究并不支持该观点，表3数据显示，r值均在0.3以内，P均& 0.05，说明HBsAg定量与HBV-DNA载量缺少正相关性。导致研究结果不同可能与下列因素有关：研究对象不同所导致，不同地区的每一个病人感染的乙肝情况会有所不同,包括不同病人自身免疫力所致；检测方法不同所致，其他学者大多数都是采用ELISA方法检测HBsAg，而本研究所采用的是ECLIA。
&&&&&&&&&综上所述，HBsAg定量与HBV-DNA载量两者之间是缺少相关性的。ECLIA检测HBsAg存在钩状效应，虽然未降低HBsAg定性结果的准确性，但使HBsAg定量结果缺少提示乙肝病人传染性强弱的作用，所以ECLIA定量检测HBsAg是难以取代荧光定量PCR检测HBV-DNA的意义。但电化学发光定量检测法具有灵敏度高、检测快速、无放射性危害等优点，在追求高效率&&快而准&的现代化检测方法中，ECLIA定量检测HBsAg相比较于一般的ELISA法有一定的优越性。在临床治疗诊断中，联合检测HBsAg和HBV-DNA有助于乙肝患者的疾病观察、用药、提高疗效及判断预后。
参 考 文 献
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罗氏Cobas e601与雅培Architect i2000检测乙肝表面抗原的比较
【摘要】：目的比较罗氏电化学发光检测仪Cobas e601与雅培化学发光微粒子免疫分析仪Architect i2000检测乙肝表面抗原的结果。方法选取在雅培i2000检测仪上检测乙肝表面抗原结果为有反应性,且定量结果小于250IU/mL的标本,同时在罗氏e601进行检测,分析比较检测结果间的差别,并进行直线相关和回归分析。结果共检测46份临床标本,剔除1份两台仪器上检测结果反应性不符的标本外,其余结果具有很好的相关性。其中雅培检测值为0.05~1.00IU/mL的15份,两者的直线回归方程为Y=17.49 X+0.843,相关系数r=0.979;1.1~10.00IU/mL的15份,两者的直线回归方程为Y=15.72 X+21.06,相关系数r=0.952;11~250IU/mL的15份,两者的直线回归方程为Y=29.17 X-129,相关系数r=1.000。结论两种方法的检测结果具有很好的相关性,并可以通过公式进行相互换算。
【作者单位】：
【分类号】：R446.6
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