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中国北方汉族人群CTH基因、HMOX1基因及HMOX2基因与原发性高血压的关联研究
北京协和医学院博ｌｊ研究生毕业论文Ｙ１４１４２８４论文题目中国北方汉族人群ＣＴＨ基因、ＨＭＯＸｌ基因及ＨＭＯＸ２基因与原发性高血压的关联研究研究生：李云导师：顾东风教授专业：流行病与卫生统计学研究方向：心血管流行病学所在院所：阜外心血管病医院入学时间：二零零五年八月二零零八年五月北京协和医学院博士研究生学位论文摘要中文摘要第一部分：血红素加氧酶基因多态性与原发性高血压的关联研究研究背景和目的血红素加氧酶（Ｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＨＯ）是催化血红素分解生成等摩尔一氧化碳（Ｃａｒｂｏｎｍｏｎｏｘｉｄｅ，Ｃｏ）、铁和胆绿素的起始酶和限速酶，在体内以三种同工酶形式存在，分别是Ｈｏ―ｌ、Ｈｏ．２和ＨＯ．３。Ｈ０．１为诱导型，广泛分布于全身组织细胞的微粒体内，脾、肝中含量最高，炎症细胞因子、激素和环磷酸腺苷（Ｃｙｃｌｉｃａｄｅｎｏｓｉｎｅｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｃＡＭＰ）等均能诱导ＨＯ一１的生成；ＨＯ一２为构成型，于血管的内皮细胞及肌层天然表达，主要存在于内皮细胞和神经元内，脑组织和前列腺中含量最高；Ｈｏ．３也是构成型，主要分布于脾脏和肝脏，是一个作用很弱的血红素催化剂。在这三种同工酶中，研究较多的足Ｈｏ．１和Ｈ０―２。肾脏在血压调节和高血压发生中发挥重要作用，肾脏功能异常可引起水钠潴留、肾血流量下降和肾小球滤过率下降，体内诱导生成Ｈ０―１可纠乖这些异常变化。在动物模型中诱导生成Ｈ０．１可以保护横纹肌溶解症、顺铂肾毒性和肾毒性肾炎大鼠的肾脏功能。在急性肾衰和高血压中，Ｈｏ的产物可提供保护性作用。另外有研究提示，血管紧张素ＩＩ（ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｌＩ，ＡｎｇＩＩ）灌注可降低肾小球滤过率（Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｒａｔｅ，ＧＦＲ），从而导致血压升高，随后即观察到Ｈｏ．１表达上调，发挥细胞保护作用。这个研究证实Ｈ０．１在山肾脏功能异常导致的高血压中起到保护性作用。氧化应激（ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ）参与了体内多种病理变化过程，包括高血压、动脉粥样硬化、心肌缺血和一些神经变性疾病。有研究证实，在脂蛋白Ｅ缺乏小鼠中给予血红素后，小鼠主动脉和。肾脏中的ＨＯ．１表达增加，同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Ｎｉｃｏｔｉｎ锄ｉｄｅ―ａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＮＡＤＰＨ）活性显著下降。此外，在高血压大鼠的肾髓质中诱导生成Ｈｏ一１可降低血压水平。最近研究发现，Ｈｏ．２敲除小鼠对肿瘤坏死因子．ｃ【引起的细胞凋亡非常敏感，抑制内源性生成ＨＯ．２可加重由肿瘤坏死因子一ａ诱发的氧化应激反应，说明内源性Ｈｏ．２可抑制肿瘤坏死因子．ａ诱发的氧化应激反应，提供保护作用。这些研究结果提示ＨＯ可能通过调节机体的氧化应激状态参与体内血压的调控和高血压的发生发展。４北京协和医学院博士研究生学位论文摘要以上这些证据提示Ｈｏ．１和Ｈ０―２可能参与了原发性高血压的发生发展。Ｈｏ．１和Ｈｏ一２的编码基因分别是ＨＭＯＸｌ和ＨＭＯＸ２，目前关于这两个基因多态与高血压关系的研究尚较少。本研究采用病例对照设计，探讨在中国北方汉族人群中，ＨＭｏＸｌ基因和ＨＭｏＸ２基因多态是否与原发性高血压关联，同时应用多因子降维方法（Ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｉｔｙｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，ＭＤＲ）分析ＨＭＯＸｌ基因和ＨＭｏＸ２基因多态在高血压的发生中是否存在交互作用。材料和方法所有研究对象的ＤＮＡ样本和临床资料均来自亚洲国际心血管疾病协作研究（ＩｎｔｅｍａｔｉｏｎａｌｃｏｌｌａｂｏｍｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｆｃａｒｄｉｏｖａＳｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｉｎＡｓｉａ，ＩｎｔｅｒＡＳＩＡ）的中国部分。为了检测出岛血压病例和血压正常者之间可能的遗传差异和提高关联分析的把握度，我们从ＩｎｔｅｒＡＳＩＡ人群中选择了５０３例血压水平为收缩压（ｓｙｓｔｏｌｉｃｂｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅ，ＳＢＰ）三１６０ｍｍＨｇ和／或舒张压（Ｄｉａｓｔｏｌｉｃｂｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅ，ＤＢＰ）≥１００ｍｍＨｇ的高血压患者和４９０例年龄、性别匹配的正常血压对照（ＳＢＰ＜１４０ｍｍＨｇ且ＤＢＰ＜９０ｍｍＨｇ）。参加者均接受标准的问卷调查，调查内容包括疾病史、家族史、吸烟与饮酒史和药物使用情况，并测量血压、身高、体重、腰围及臀围以及脂质水平等各项生化指标。所有研究对象均为汉族且无血缘关系。研究巾排除了有继发性高血压、冠心病、糖尿病、脑卒中、严重肝肾疾病或甲状腺疾病病史以及恶性肿瘤的患者。采用标签单核苷酸多态（ＴａｇｇｉｎｇｔａｇＳＮＰ）策略，在中困汉族人群中少见等位基因频率（ＭｉｎｏｒＳＮＰ，ａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ＭＡＦ）≥Ｏ．０５的所有ＳＮＰ中，ＨＭｏＸｌ基因筛选出３个标签ＳＮＰ位点，分别是ｒＳ８１４０６６９Ｔ／Ａ多态、ｒｓ９６０７２６７Ｔ／Ｃ多态和ｒｓ２０７１７４９Ｇ／Ａ多态；ＨＭｏＸ２基因筛选出２个标签ＳＮＰ位点，分别是ｒｓ４７８６５００Ｔ／Ｃ多态和ｒｓ９９２１７８１Ｃ厂ｒ多态。采用聚合酶链反应和限制性片断长度多态性方法对这５个ＳＮＰ位点进行基因分型。病例组和对照组间基因型的分布和等位基因频率的比较采用卡方检验；采用非条件Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析检验多态位点与表型的独立关联，以上分析过程由ＳＰＳＳ１３．Ｏ来完成。采用Ｈａｐｌｏ．ｓｔａｔｓ软件包分析单体型、双体型与原发性高血压的关系。结果病例组和对照组的性别、年龄、吸烟率和饮洒率均无显著性差异。所有５个标签ＳＮＰ位点均符合Ｈａｒｄｙ．Ｗｄｎｂｅｒｇ平衡。北京协和医学院博士研究生学位论文摘要单点分析结果提示，病例组中ＨＭＯＸｌ基因的ｒＳ９６０７２６７位点ＣＣ基因型频率高于对照组，校正其它影响因素后，ｒＳ９６０７２６７位点ＣＣ基因型个体高血压发病危险是该位点其它基因型个体的１．４ｌ倍（９５％ＣＩ：１．０２．１．９５，Ｐ＿０．０４０）。数量性状分析结果也显示ｒｓ９６０７２６７位点ＣＣ基因型个体血压水平显著高于该位点其它基因型患者，校Ｊ下其它影响因素后，ｒｓ９６０７２６７位点ＣＣ基因型个体与其它基因型个体比较，收缩压水平升高４．７ｍｍＨｇ，舒张压水平升高２．８ｍｍＨｇ，差别有统计学意义。单体型分析结果显示，携带ＨＭＯＸｌ基因ｒＳ９６０７２６７位点Ｃ等位基因的单体型Ｈａｐ３（Ｔ－Ｃ．Ｇ）与血压水平相关，校正其它影响因素后，该单体型的ＥＨ发病危险为对照单体型（Ｈａｐｌ，Ｔ．Ｔ－Ｇ）的１．４４倍（９５％ＣＩ：１．０４―２．０１，尸：Ｏ．０２９）。此外，没有观察到ＨＭｏｘ２基因与原发性高血压之间的关联。多因子降维（ＭＤＲ）分析也没有发现ＨＭｏＸｌ基因和ＨＭＯＸ２基因在原发性高血压的发生中存在交互作用。结论中国北方汉族人群中ＨＭｏｘｌ基因多态可能与血压水平及原发性高血压相关联，该关联有待在其他人群中进一步研究证实。关键词：关联研究，基因．基因交互作用，单体型，血红素加氧酶，高血压，标签ＳＮＰ６北京协和医学院博士研究生学位论丈摘要第二部分：中国北方汉族人群胱硫醚吖一裂解酶基因多态性与原发性高血压的关联研究研究背景和目的高血压是导致中风、心肌梗塞和肾衰患者死亡的重要原因，目前已成为危害人类健康的主要公共卫生问题。在过去的几十年间，对高血压病理机制进行了大量的研究，但由于高血压是一种遗传因素和环境因素共同作用引起的复杂性疾病，存在多基因决定性、遗传异质性、外显不全、表型模糊等诸多因素，阻碍了对其遗传机制的深入研究，以致这些研究结果在不同人群中的重复性较差，甚至在同种族人群亦有差异，关于高血压的发病机制仍不明确。内源性硫化氢（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｉｄｅ，Ｈ２Ｓ）是继一氧化氮（Ｎｉｔ“ｃｏｘｉｄｅ，Ｎｏ）和ＣＯ之后的第三种气体信号分子，在调节血管舒张程度等多方面具有与Ｎｏ及Ｃｏ非常相似的特性。内源性Ｈ２Ｓ主要来自于体内的同型半胱氨酸，在硫化作用下生成半胱氨酸，然后半胱氨酸在胱硫醚一ｐ一合成酶（ＣｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅＤ―ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＢｓ）和胱硫醚吖．裂解酶（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ丫一ｌｙａｓｅ，ＣＳＥ）作用下生成Ｈ２ｓ。ＣＢＳ主要分布于神经系统，而ＣＳＥ主要表达于肝脏、肾脏和血管平滑肌。研究发现，高血压大鼠胸主动脉中ＣＳＥ表达水平和活性均低于对照组。此外，实施腹主动脉．下腔静脉分流术后的大鼠肺动脉ＣＳＥｍＲＮＡ表达水平与正常对照组比较明显下调，这提示ＣＳＥ可能与高血压的发生相关。ＣＳＥ的编码基因为ＣＴＨ，在其第１２外显子处存在一个常见错义突变１３６４Ｇ＞Ｔ（ｒＳｌ０２１７３７），该多态使ＣＴＨ基因编码的第４０３位氨基酸由丝氨酸（ｓ嘶ｎｅ，Ｓｅｒ）变为异亮氨酸（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉｌｅ）。研究发现该多态与血清同型半胱氨酸浓度相关，而同型半胱氨酸能增强氧化应激的反应程度，刺激血管平滑肌细胞增殖并改变血管壁弹性蛋白的特性，从而参与高血压的发生与发展。这些结果提示我们ＣＴＨ基因有可能通过调控血清同型半胱氨酸浓度来参与血压调节和高血压的发生发展。目前尚没有关于ＣＴＨ基因多态与原发性高血压的关联研究报道。本研究采用病例对照研究设计，在中国北方汉族人群中探讨ＣＳＥ编码基因ＣＴＨ多态是否与原发性高血压（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，ＥＨ）相关。拣漱帮玄浓所有研究对象的ＤＮＡ样本和临床资料均来自亚洲圈际心血管疾病协作研究７北京协和医学院博士研究生学位论文（ＩｎｔｅｍａｔｉｏｎａｌｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉＶｅｓｔｕｄｙｏｆｃａｒｄｉｏＶａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｉｎＡｓｉａ，摘要ＩｎｔｅｆＡＳＩＡ）的中国部分。我们选择了５０３例血压水平为ＳＢＰ三１６０ｍｍＨｇ和／或ＤＢＰ＞１００ｍｍＨｇ的高血压患者和４９０例年龄、性别匹配的正常血压对照者（ＳＢＰ＜１４０ｍｍＨｇ且ＤＢＰ＜９０ｍｍＨｇ）进行研究。参加者均接受标准的问卷调查，调查内容包括疾病个人史、家族史、吸烟与饮酒史和药物使用情况，并测量血压、身高、体重、腰围、臀围以及脂质水平等各项生化指标。所有研究对象均为汉族且无血缘关系。本研究排除了有继发性高血压、冠心病、糖尿病、脑卒中、严重肝肾疾病或甲状腺疾病病史以及恶性肿瘤的患者。采用单核：苷酸多态位点功能分析和选择工具（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｔｏｏｌｆｏｒｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐ０１ｙｍｏ印ｈｉｓｍｓ，ＦａＳｔＳＮＰ）进行ＳＮＰ位点选择。在中国汉族人群中少见等位基因频率（Ｍｉｎｏｒａｌｌｅｌｅ仔ｅｑｕｅｎｃｙ，ＭＡＦ）≥Ｏ．０５的所有ＳＮＰ位点中，根据ＦａｓｔＳＮＰ功能预测结果，选择了２个ＣＴＨ基因潜在的功能位点：ｒｓ４８２８４３位点～Ｇ多态和ｒｓｌ０２１７３７位点Ｇ／Ｔ多态。基因分型方法ＰＣＲ．ＲＦＬＰ方法。病例组和对照组间基因型分布和等位基因频率的比较采用卡方检验，采用非条件Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析检验多态位点与表型的独立关联，以上分析过程由ＳＰｓＳ１３．Ｏ来完成。采用Ｈａｐｌｏ．ｓｔａｔｓ软件包分析单体型、双体型与原发性高血压的关系。结果病例组和对照纽的性别、年龄、吸烟率和饮酒率均无显著性差异。ＣＴＨ基因ｒｓ４８２８４３位点和ｒｓｌ０２１７３７位点均符合Ｈａｒｄｙ．Ｗａｎｂｅｒｇ平衡。病例组和对照组中这两个多态位点的基因型分布和等位基因频率没有显著差别（Ｐ值均＞０．０５）。在逐步回归分析中，校正年龄、性别等协变量后，也没有发现ＣＴＨ基因ｒｓ４８２８４３位点和ｒｓｌ０２１７３７位点与高血压相关。此外，在校正协变量前和校正协变量后均没有发现可以增加或降低高血压危险的单体型或双体型。结论我们的研究没有观察到中国北方汉族人群的ＣＴＨ基因ｒｓ４８２８４３～Ｇ多态和ｒＳｌ０２１７３７Ｇ／Ｔ多态与原发性高血压相关。关于ＣＴＨ基因与原发性高血压的关系尚需在其他人群中进行重复验证，同时需要进一步的功能研究证据。关键词：胱硫醚吖．裂解酶，双体型，单体型，高血压，单核苷酸多态性８北京协和医学院博士研究生学位论文摘要ＡＢＳＴＲＡＣＴＳｅｃｔｉｏｎ１：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｕｄｙｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅｇｅｎｅｓｗｉｔｈｅｓｓｅｎｔｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｉｎｎｏｒ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ｉｏｎＮＯＮｏＳＯＲＰＣＲＲＦＬＰＮｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅＮｉｔｎｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ０ｄｄｓｒａｔｉｏ一氧化氮一氧化氮合酶比值比聚合酶链反应限制性片段长度多态ＰｏｌｙｍｅｒａＳｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ行ａｇｍｅｎｔｌｅｎ舀ｈｐｏｌｙｍｏ叩ｈｉｓｍＲｅＶｅｒｓｅ‘ｒａｎｓ嘶ｐｔｉ。ｎＲＴ．ＰＣＲｒ．ｅａｃｔｉｏｎＳＢＰｓＧＣＳＨＲｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ逆转录聚合酶链反应收缩压可溶性鸟：肖酸环化酶自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞ＳｙｓｔｏｌｉｃｂｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅＳｏｌｕｂｌｅｇｕａｎｙｌｙｌｃｙｃｌａｓｅＳｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙｈｙｐｅｎｅｎｓｉＶｅｒａｔＳＭＣｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ２缩略语表３北京协和医学院博士研究生学位论丈北京协和医学院博士研究生学位论文前言前言在世界范围内，心血管病（ＣａｒｄｉｏｖａＳｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ，ＣＶＤ）位于疾病死亡谱的首位，占所有疾病负担的１３％。每年死于非传染疾病的人数占所有死亡人数的绝大部分，而其中一半以上的人死于心血管病。在许多发展中国家，包括中国，随着经济的快速发展及生活条件、营养状态和医疗卫生水平的改善，ＣＶＤ的发病率大幅度增加，目前已成为我国４０岁以上成人死亡的主要原因。无论在发达国家还是在发展中国家，高血压都是ＣＶＤ最重要的一个危险因素。目前，全世界约有２６．４％的成人患有高血压，预计到２０２５年，高血压患病率将达到２９．２％，患病人数将从２０００年的９．７亿增加到１５亿。在过去的几十年中，我国高血压的患病率和患病人数也在快速增长。中国成人中估计的高血压人数已经从１９８０年的５９００万增加到１９９１年的９４００万，到２００２年，中国１８岁及以上居民高血压患病率达１８．８％，高血压患者约１．６亿。研究已经证实，高血压是中风、心肌梗塞和肾衰的重要危险因素，我国高血压患者的死亡率比非高血压患者死亡率高约４８％。高血压已经成为危害人类健康的主要公共卫生问题。在过去的几十年间，虽然对高血压致病基因进行了大量的研究，但由于高血压是一种遗传因素和环境因素共同作用引起的复杂性疾病，存在多基因决定性、遗传异质性、外显不全、表型模糊等诸多冈素，阻碍了对其遗传机制的深入研究，以致这些研究结果在不同人群中的重复性较差，甚至在同种族人群办有差异，关于高ｍ压的发病机制仍不明确。关于血压调控和高血压发生过程中遗传因素的作用研究有多种方法，主要包括连锁分析和关联研究。连锁分析是在有亲缘关系的个体中，通过检测某一性状和遗传标记之间共分离的概率是否超过预期的随机概率，来定位疾病易感位点。连锁分析常能将疾病的易感基因定位到染色体的一个较大的区域，甚至在不知道疾病的生物学机制的情况下也能运用。但连锁分析需要获得相对完整的家系结构，这限制了连锁分析在复杂疾病遗传冈素研究中的广泛应用。关联研究是在无关个体中，通过比较病例组和对照组之间的等位基因频率来评价遗传变异对所研究的表型的作用。关联研究常用来在最初连锁所确定的基因组位置之上进行精细作图和定位。与连锁分析相比，关联研究在检测微效基因的效应方面把握度更高，但需要更多的遗传标记。最近，人们已经认识到常见的复杂疾病涉及到许多易感１４北京协和医学院博士研究生学位论文前言基因，并且这些基因均为微效基因，加上全基因组已经识别出来大量的单核苷酸多态（Ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）和基因分型价格的迅速下降，使得关联研究在遗传流行病学中有着重要的作用和地位，逐渐成为复杂疾病致病基因研究的主要方法。ＳＮＰ作为人类基因组中最丰富的遗传变异，可能是人类基因组中疾病易感基因的遗传标记，甚至是直接影响一些常见病的易感性基因位点。目前许多高通量ＳＮＰ检测方法应用到ｓＮＰ的基因分型中，大大加快了人类ＳＮＰ数据的增长。据估计，人类基因组中平均约每２９０ｂｐ就存在一个碱基突变，这些ＳＮＰ位于基因的编码区或非编码区，可能与复杂疾病之间存在关联。运用关联研究发现这些与常见疾病相关的脱氧核糖核酸（ＤｅｏＸｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ，ＤＮＡ）多态位点，是揭示人类疾病复杂致病原因的最重要途径之一。但由于ＳＮＰ位点数量庞大，检测所有ＳＮＰ位点与疾病的关联显然是不太可能的事情，标签ＳＮＰ（ＴａｇｇｉｎｇＳＮＰ，ｔａｇＳＮＰ）的提出使人类探究基因组ＳＮＰ多态信息与遗传性状的关系成为可能。一个染色体区域可以有很多ＳＮＰ位点，其中能代表其它位点信息的ＳＮＰ位点称为标签ＳＮＰ，选择恰当的标签ＳＮＰ可以保留全部或者大部分ＳＮＰ的信息，这样将大大减少用于基因型与疾病关联分析中的ＳＮＰ数量，提高关联分析的有效性，同时节省基因分型的费用。标签ＳＮＰ的选择有不同的算法，按选择方法评价标准的不同，可以分为基于单体型变异选择、基于两点之间的关联程度选择和基于多个点与一个ＳＮＰ位点的关联选择等三种方法。其中基于两点之间的关联程度选择的标签ＳＮＰ效力最高。人类基因组中，相邻近的ＳＮＰ位点倾向于以一个整体遗传给后代，位于一条染色体上或某一区域的一组相关联的ＳＮＰ等位位点被称为单体型。如果一个单体型有ｎ个变异位点，理论上就有２ｎ种可能的单体型，实际上，大多数染色体区域只有少数几种常见的单体型，他们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。单体型方法是以单体型板块为研究基础，通过检测构成单体型板块的几个标签ＳＮＰ，分析易感基因与复杂疾病间的相关性。许多研究表明，一些复杂性状的遗传只能通过两个不连锁的位点的联合作用来解释，因此，在易感基因与复杂性状的相关分析中，采用单体型或双体型分析比单个ＳＮＰ分析具有更好的统计分析效果。而且，通过单体型方法还可以分析其所在区域内等位基因的相关性１５北京协和医学院博士研究生学位论文前言以及通过比较不同人群中的单体型种类和频率的不同来确定常见复杂疾病的致病因素。高血压作为一种多基因疾病，基因一基因之间或基因一环境之间的交互作用在其发生和发展过程中有重要作用。基因．基因之间交互作用的分析方法有很多种，包括多元适应性回归样条（Ｍｕｌｔｉｖ撕ａｔｅａｄ叩ｔｉｖｅ归分类树（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｌｉｏｎａｎｄｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓｐｌｉｎｅｓ，ＭＡＲＳ）、回ｔｒｅｅｓ，ＣＡＲＴ）和多因子降维法（Ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏ卜ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｉｔｙｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，ＭＤＲ），其中ＭＤＲ是在遗传关联研究中应用较多的一种方法。ＭＤＲ是一种非参数、无需遗传模型的分析方法，以疾病易感性分类的方式建模，将研究中的多个因子（指交互作用研究中的变量）看做一个多因子的组合，通过这种方法把高维的结构降低到一维两水平。该方法无需指定遗传模型，只需具备各位点的遗传数据即可进行，适用于病例对照研究设计，目前己成功应用于散发性乳腺癌、心房颤动等疾病的研究，也为高血压的基因．基因交互作用分析提供了有效的工具。本研究采用关联研究设计和标签ＳＮＰ策略，在中国北方汉族人群中分析胱硫醚吖．裂解酶和血红素加氧酶基因多态性与原发性高血压的关系，同时探讨血红素加氧酶基因１和基因２对高血压是否存在交互作用。１６北京协和医学院博士研究生学位论文实验材料实验材料实验主要试剂试剂名称ＰＣＲ相关试剂ｄＮＴＰ生产厂商大连Ｔａｋａｒａ（宝生物）公司大连Ｔａｋａｒａ（宝生物）公司北京天根生化科技有限公司ＴａｑＤＮＡ聚合酶引物（合成）上海生物技术工程有限公司奥科生物技术有限公司ＰＣＲ染料酚氯仿法提取ＤＮＡ相关试剂北京赛百盛生物工程公司嘶ｓ．ＨＣｌ重蒸饱和酚氯仿蛋白酶Ｋ异戊醇无水乙醇乙酸钠十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）限制性内切酶长度多态（ＲＦＬＰ）相关试剂琼脂糖溴乙锭（ＥＢ）限制性内切酶ＢｓｍＡＩ限制性内切酶ＥｃｏＲ限制性内切酶ＸａｐＩ限制性内切酶ＳｓｐＩＩ北京华美生物公司北京化学试剂公司美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司北京化学试剂公司北京化学试剂公司北京化学试剂公司美国Ｓｉｇｍａ公司上海Ｙｉｔｏ有限公司（分装）北京化学试剂公司立陶宛ＭＢＩＦｅｍｌｅｎｔａｓ公司立陶宛ＭＢＩＦｅｒｎｌｅｎｔａｓ公司立陶宛ＭＢＩＦｅｒｎｌｅｎｔａＳ公司立陶宛ＭＢＩ立陶宛ＭＢＩＦｅｍｅｎｔａｓ公司Ｆｅ肌ｅｎｔａＳ公司限制性内切酶Ｃａｉｌ限制性内切酶Ｈｐｙｌ８８ＩＤＬ２０００分子量标记ＭａｒｋｅｒＭａｒｋ纽英伦生物技术（北京）有限公司中同合资大连Ｔａｋａｒａ（宝生物）公司北京天根生化科技有限公司１７１分子量标记北京协和医学院博士研究生学位论文实验材料实验主要仪器及相关耗材仪器名称生产厂家ＰＣＲ相关仪器耗材ＧｅｎｅＡｍｐ９７００ＰＣＲ扩增仪美国ＡＢＩ公司梯度ＰＣＲ自动循环仪德国Ｅｐｐｅｎｄｏｌｌｆ公司９６孔ＰＣＲ反应板美国Ａｘｙｇｅｎ公司单道移液器（Ｏ．１－２．５ｐ１；Ｏ．５－ｌＯ“ｌ；２０―２００ｐ１）德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司８道移液器（０．５．１０斗１）德国ＥｐｐｅｎｄｏｒｌＦ公司１２道移液器（Ｏ．５．１０¨１）德国ＢＲＡＮＤ公司单道电动连续移液器（５一１００肛１）德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司枪头北京东方仪器厂ＱＬ．９０１漩涡混合器江苏海门麒麟医用仪器厂Ｍｉｌｌｉ―Ｑ纯水制备机美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司ＳＡＮＹＯＳＩＭ．Ｆ１２４制冰机同本ＳＡＮＹｏ公司Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１５Ｄ离心机德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５８１０ＲＰＣＲ板离心机德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司阪神ＢＤ／ＢＣ一５６８冷柜江苏阪神电器有限公司Ｈａｉｅｒ－２００Ｃ冰箱青岛海尔集团公司血液生化指标测定相关仪器耗材ＨＩＴＡＣＨＩ７０６０自动生化分析仪闩本ＨＩＴＡＣＨＩ有限公司酚氯仿法提取ＤＮＡ相关仪器耗材ＢＥＣＫＭＡＮＡｖａｎｔｉＪ．２５低温离心机美国ＢＥＣＫＭＡＮＣｏＵＬＴＥＲ公司．７００Ｃ冰箱Ｂｅｃｌ【ｍａｎ．Ｕ．Ｓ．Ａ紫外分光光度计ＤＵ６４０型Ｂｅｃｋｍａｎ．Ｕ．Ｓ．Ａ限制性内切酶长度多态（ＲＦＬＰ）相关仪器耗材ＬＲＨ一２５０Ａ恒温生化培养箱广东省医疗器械厂Ｄｙｙ－ＩＩｌ６Ｂ型稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂Ｂｉｏ．ＲａｄＧｅｌＤｏｃ２０００型凝胶成像仪美国Ｂｉｏ―Ｒａｄ公司电热恒温水浴箱北京东方仪器厂１８北京协和医学院博士研究生学位论文实验材料实验及分析主要软件软件名称ＱｕａｎｔｉｔｙＰｒｉｍｅｒ３ＨａｐｌｏＶｉｅｗＳＰＳＳｌ３．ＯＨａｐｌｏ．ｓｔａｔｓＯｎｅｓｏＲｗａｒｅ开发厂商／作者美国Ｂｉｏ―Ｒａｄ公司ｈｔｔｐ：／／舶ｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃ西－ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３―－Ｗｗｗ．ｃ百ｈｔｔｐ：∥ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄ幽ｐｇ／ｈａｐｌｏＶｉｅｗＳＰＳＳＩｎｃ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｙｏ．ｅｄｕ／ｌｌｓｒ／ｐｅｏｐｌｅ／ｓｃｈａｉｄ．ｈｔｍｌＭＤＲＧｅｎｅｔｉｃｓＦａｓｔＳＮＰｈｔｔｐ：∥ｗｗｗ．印ｉｓｔａｓｉｓ．ｏｒ∥ｏｐｅｎ―ｓｏｕｒｃｅ―ｍｄ叩ｒｏｊｅｃｔ．ｈｔｍｌｈｔｔｐ：∥ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒ∥ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌｈｔｔｐ：／／ｆ．ａｓｔｓｎｐ．ｉｂｍｓ．ｓｉｎｉｃａ．ｅｄｕ．ｔｗ／ｐａｇｅｓ／ｉｎｐｕｔ―ＣａｎｄｉｄａｔｅＧｅｎｅＳｅａｒｃｈｊｓｐ１９北京协和医学院博士研究生学位论文实验方法实验方法一、主要试剂配置１．Ｏ．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０，１０００ｍ１）：称取二水乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ．Ｎａ?Ｈ２０）１８６．１ｇ，加入８００ｍｌ去离子水，磁力搅拌器搅拌，用ＮａＯＨ调节ｐＨ至８．Ｏ，定容至ｌ０００ｍｌ。分装高压灭菌备用。２．溶血液：１５５ｍＭＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭＫＨＣ０３，Ｏ．１ｍＭＥＤＴＡＮａ２，调ｐＨ值至７．４。常温保存。３．ＳＥ液：７５ｍＭＮａＣｌ，２５ｍＭＥＤＴＡＮａ２，调ｐＨ值至８．０。放置４０Ｃ保存。４．１０％ＳＤＳ溶液：取１０９ＳＤＳ溶于１００ｍｌ蒸馏水中，可加热加速其溶解。常温保存。５．１０ｍ∥ｍｌ蛋白酶Ｋ：将１００ｍｇ蛋白酶Ｋ溶于１０ｍｌ蒸馏水中，以ｌｍｌ为单位分装在ｌＯ个１．５ｍｌＥＰ管中。放置一２００Ｃ冻存。６．ＴＥ液：１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡＮａ２，调ｐＨ值至８．Ｏ。放置４０Ｃ保存。１０８７．１Ｏ×ＴＢＥ（１０００ｍ１）：称取嘶ｓｇ，硼酸５５磊吸取Ｏ．５ＭＥＤＴＡ贮存液（ｐＨ８．Ｏ）４０ｍｌ，置入洁净烧杯中，加去离子水８００ｍｌ，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，移液至洁净量筒，定容至１０００ｍ１，用于电泳。８．１０“Ｍ引物工作液：１００００叩ｍ离心带有引物干粉的小离心管１０秒钟，慢慢打开管盖，加入适量去离子水，充分振荡后分装，．２００Ｃ冻存备用。加入去离子水量的计算公式：去离子水量（斗１）＝（３－３×１０６）×ｏＤ／ＭＷ其中ＯＤ为引物的ＯＤ含量，ＭＷ为引物分子量。二、生化指标测定５ｍｌ非抗凝血以３０００印ｍ常温离心１５分钟，取出上清，分装于４个ＥＰ管，各约０．５ｍ１。其中ｌ管用于测定生化指标，其余．２００Ｃ冻存备用。三、基因组ＤＮＡ提取采用低渗法破白细胞，酚氯仿法从外周静脉血白细胞中提取基因组ＤＮＡ。１．分离白细胞：５ｍｌＥＤＴＡ抗凝管中的血液直接倒入１５ｍｌ塑料离心管，３０００叩ｍ于４０Ｃ下离心１０分钟，取上清液（血浆）分装入两个ＥＰ管中，各１．２．１．３ｍｌ，北京协和医学院博士研究生学位论文实验方法放入塑料袋中，．２００Ｃ冻存。剩下的血细胞加入ｌＯ一１３ｍｌ的溶血液，轻弹混匀，置于冰上１５分钟，３０００印ｍ４０Ｃ离心１０分钟，倒掉上清，再重复上述步骤，得到白细胞沉淀。２．向自细胞中加入４．５ｍＩＳＥ，混匀打散，再加入０．５ｍｌ白酶Ｋ，轻微混匀，３７０Ｃ恒温箱消化１８．２０小时。１０％ＳＤＳ，５０ｕｌｌｏｍ咖ｌ蛋３．取出消化好的白细胞，加入５ｍｌ嘶ｓ―Ｃｌ饱和酚，轻摇颠倒混匀１０分钟，４０Ｃ３０００印ｍ离心１５分钟。４．取出离心管，小心吸取上清，转移到新离心管。下层的沉淀弃去。５．重复步骤３、４一次。６．在含有上清液的新离心管中加入与上清液等体积氯仿，轻摇颠倒混匀１０分钟，４０Ｃ３０００印ｍ离心１５分钟。７．取出离心管，小心吸取上清，转移到新离心管。８．重复步骤６、７一次。９．取出离心管，小心吸取上清，转移到新离心管，加入２倍体积的预冷无水乙醇。１０．将沉淀出的ＤＮＡ挑出，用７５％乙醇冲洗２次，置入１．５蒸发后，加入适量ＴＥ，４０Ｃ过夜溶解备用。ｍｌＥＰ管中，待乙醇四、ＤＮＡ浓度和质量的检测１．取溶解后的ＤＮＡ溶液１“ｌ，加蒸馏水至５０“ｌ（稀释５０倍），以相同蒸馏水为空白对照，在紫外分光光度计上测定ＯＤ２６０、ＯＤ２８０及ｏＤ２３０。２．ＤＮＡ的纯度检测：ＯＤ２６０／ｏＤ２８０＞１．７，ｏＤ２８０／０Ｄ２３０＞２．０，说明ＤＮＡ纯度合格，否则需要重新提取。３．ＤＮＡ的定量：根据测定的原液ＤＮＡ浓度（ｎ∥肛１）），加入ＴＥ液，稀释ＤＮＡ终浓度为５０ｎ∥肛ｌ。五、聚合酶链式反应（ＰＣＲ）的主要条件１．ＰＣＲ反应体系的常用组成：常用反应体系为１０“ｌ，组成如下，具体调整后的ＰＣＲ反应体系的组成详见分章节方法部分。２ｌ北京协和医学院博士研究生学位论文实验方法２．ＰＣＲ反应条件详见分章节实验方法部分。六、限制性内切酶长度多态分析（ＲＦＬＰ）１．酶切体系的建立和酶切过程１）酶解体系组成。酶切体系组成建立后，用移液枪反复吹打几次，使酶切体系中所有成分混匀。置于内切酶最适的反应温度下，过夜消化。每板酶切反应均加入１．２例未经酶切的阴性对照样本；２）反应终止。次日早晨，以内切酶合适的灭活温度保温２０分钟以灭活内切酶；２．琼脂糖凝胶电泳以鉴定样本基因型１）琼脂糖凝胶的制备：根据所需浓度称取一定量的琼脂糖粉，置入三角烧瓶，加入３００ｍｌＯ．５×ＴＢＥ缓冲液；微波炉加热使琼脂糖溶解完全至溶液清澈透明无絮状物。取出溶液冷却至６００Ｃ以下，加入ｌＯｍ咖ｌ溴乙锭（ＥＢ）溶液至终浓度０．５肛∥ｍｌ（约加入１５ｐ１）。制胶模具的两端用医用橡皮膏封好，将含有ＥＢ的琼脂糖溶液缓缓倒入模具，厚度一般为０．３．０．５ｃｍ，迅速插上梳子。冷却至琼脂糖完全凝固。装入电泳槽内，放入Ｏ．５×ＴＢＥ缓冲液至液面高于胶面ｌｍｍ。北京协和医学院博士研究生学位论文２）上样及电泳：实验方法用移液枪将酶切后样品加入琼脂糖凝胶上样孔，接通电源，在合适电压下电泳Ｏ．５．１小时，根据指示剂迁移的位置和预检测的片段大小，判断何时终止电泳。３）鉴定基因型。使用Ｂｉｏ．ＲａｄＧｅｌＤｏｃ２０００型凝胶成像仪在合适的曝光条件下显影并照相保存胶图。独立２次判读并输入数据库。北京协和医学院博士研究生学位论文ＨＭＯＸ基因与原发性高血压第一部分‘中国北方汉族人群中血红素加氧酶基因多态性与原发性高血压的关联研究一、研究背景与目的内源性一氧化碳（Ｃａｒｂｏｎｍｏｎｏｘｉｄｅ，Ｃｏ）是继一氧化氮（Ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ，Ｎｏ）之后发现的第二种气体信号分子，与Ｎｏ一样，都是双原子、小分子气态物质，在体内充当重要的血管活性介质和神经递质，通过扩散以自分泌或旁分泌方式与自身或临近细胞胞浆中可溶性鸟苷酸环化酶（Ｓｏｌｕｂｌｅｇｕａｎｙｌｙｌｃｙｃｌａｓｅ，ｓＧＣ）分子血红素基团中的铁结合，发挥各种生理效应。Ｎｄｉｓａｎｇ等研究认为ｃｏ可直接调节大鼠主动脉、肺动脉、尾动脉、冠状动脉以及犬的股动脉、颈动脉、冠状动脉等的血管平滑肌细胞的舒缩状态【Ｉ】。Ｃｏ生成增加可降低自发性高血压大鼠（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙｈｙｐｅｎｅｎｓｉｖｅｒａｔ，ＳＨＲ）大鼠和醋酸去氧皮质酮（Ｄｅｏｘｙｃｏｎｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅａｃｅｔａｔｅ，ＤＯＣＡ）盐敏感大鼠的血压水平‘２１。向１２．１４周ＳＨＲ大鼠或ＤｏＣＡ盐敏感大鼠腹腔内注入Ｃ０（１２ｍｌ／ｌ（ｇ）可显著降低大鼠的血压水平。Ｂａｕｍ等研究认为在患有妊高症的女性中，内源性生成的Ｃ０量要低于血压水平正常的妊娠女性【３】。这些结果均提示ＣＯ与正常血压水平的维持及高血压的发生有一定关系。人类和哺乳动物几乎所有的器官、组织、细胞都能合成和释放内源性Ｃｏ，且体内存在着多个合成释放Ｃ０的生物学系统，其中由血红素加氧酶（Ｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ，Ｈｏ）催化血红素分解生成等摩尔ＣＯ、铁和胆绿素是最主要的代谢途径，Ｈｏ是该过程的起始酶和限速酶。Ｈｏ在体内以三种同工酶形式存在，分别是ＨＯ―ｌ、Ｈ０．２和Ｈ０．３。Ｈ０―１为诱导型，广泛分布于全身组织细胞的微粒体内，脾、肝中含量最高，脑中则很难检出。除血红素外，某些重金属（如镉、三价砷化合物）、热休克、高氧、低氧、紫外线辐射、内毒素、炎症细胞因子、激素和ｃＡＭＰ等均能诱导Ｈｏ．１的生成，其抑制剂主要是金属卟啉，如锌原卟啉，锡原卟啉，铜原卟啉等。Ｈ０．２为构成型，于血管的内皮细胞及肌层天然表达，主要存在于内皮细胞和神经元内，脑组织和前列腺中含量最高，肾上腺糖皮质激素可上调Ｈ０―２基因，使其蛋白质表达增加。Ｈｏ一３也是构成型，主要分布于脾２４北京协和医学院博士研究生学位论文ＨＭＯＸ基因与原发性高血压脏和肝脏，是一个作用很弱的血红素催化剂。在这三种同工酶中，研究较多的是ＨＯ―ｌ和ＨＯ．２。肾脏功能异常在高血压的发生发展中有重要作用。ＳＨＲ大鼠肾脏功能异常可导致血压升高，移植血压正常的大鼠肾脏后可降低升高的血压水平【４】。肾脏功能异常可引起水钠潴留、肾血流量下降和肾小球滤过率下降，体内诱导生成ＨＯ．１可纠正这些异常变化。在动物模型中诱导生成Ｈ０．１可以保护横纹肌溶解症【５１、顺铂肾毒性【６】和肾毒性肾炎【７】大鼠的肾脏功能。血管紧张素ＩＩ（Ａｎ西ｏｔｅｎｓｉｏｎＡｎｇＩＩ，ｌＩ）可能是Ｈｏ一１的一个诱导因子【８１。Ｈａｕｇｅｎ等‘９１研究证实在肾脏近曲小管使用ＡｎｇＩＩ后可增加Ｈ０一ｌ活性，说明ＡｎｇＩＩ在体内可直接诱导Ｈｏ．１的生成。另外有研究提示，ＡｎｇＩＩ灌注可降低肾小球滤过率（Ｇｌｏｍｅｌｌｌｌａｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｒａｔｅ，ＧＦＲ），从而导致血压升高，随后即观察到ＨＯ．１表达上调，发挥细胞保护作用ｆ１０】。这个研究再次证实Ｈ０．１在由肾脏功能异常导致的高血压中起到保护性作用。氧化应激（ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ）参与了体内多种病理变化过程，包括高血压、动脉粥样硬化、心肌缺血和一些神经变性疾病…。１４】。Ｄａｔｌａ等观察到在脂蛋白Ｅ缺乏小鼠中给予血红素后，小鼠主动脉和肾脏中的ＨＯ一１表达增加，同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ―ａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＮＡＤＰＨ）活性显著下降；同时给予血红素和Ｈｏ抑制剂后，没有观察到小鼠体内Ｈ０．１表达的变化，这提示体内诱导产生ＨＯ．１能抑制ＮＡＤＰＨ诱发的氧化应激反应【１５】。Ｖｅｒａ等研究认为在高血压大鼠的肾髓质中诱导生成Ｈｏ一１可降低血压水平【１６】。最近，Ｂａｓｕｒｏｙ等利用小鼠和新生猪的脑组织微血管上皮细胞发现，ＨＯ一２敲除小鼠对肿瘤坏死因子仅（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａ，ＴＮＦ．仅）引起的细胞凋亡非常敏感，抑制内源性生成Ｈｏ．２可加重由ＴＮＦ一０Ｌ诱发的氧化应激反应，说明内源性ＨＯ一２可抑制ＴＮＦ．０【诱发的氧化应激反应，提供保护作用【１７１。这些研究结果提示ＨＯ可能通过调节机体的氧化应激状态参与体内血压的调控和高血压的发生发展。以上这些证据说明Ｈｏ．１和ＨＯ．２可能参与了血压调二符和高血压的发生发展。ＨＯ．１和Ｈｏ。２的编码基因分别是ＨＭｏＸｌ和ＨＭＯＸ２，２００１年，Ｓａｂａａｗｙ等【１８】发现ＨＯ．１基因转染可降低ＳＨＲ大鼠血压。２００４年，Ｏｎｏ等㈣发现ＨＭｏｘｌ基北京协和医学院博士研究生学位论文ＨＭｏＸ基因与原发性高血压因启动子区存在Ｇ―１１３５Ａ多态和Ｔ－４１３Ａ多态，其中Ｔ＿４１３Ａ多态与缺血性心脏病和女性高血压患病率相关【２０１，但在男性中没有观察到这种相关性。目前尚无该基因其它多态及ＨＭｏｘ２基因多态与高血压关系的研究。本研究采用病例对照设计，探讨在中国北方汉族人群中，ＨＭｏＸｌ基因和ＨＭＯＸ２基因是否与原发性高血压关联。此外，高血压作为一种复杂疾病，单一基因作用微弱，基因一基因之间的交互作用在高血压的发生发展中有重要作用。基因．基因之间的交互作用也称为上位效应（Ｅｐｉｓｔａｔｉｃｅ仃ｅｃｔ），指一个基因／位点修饰了另一基因／位点的作用【２¨，这种效应在基因与表型的关系中起着重要作用，同时也是决定个体疾病易感性的重要因素【２引。目前用于检测交互作用的统计方法很多，包括分类回归树（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｒｅ野ｅｓｓｉｏｎｔｒｅｅｓ，ＣＡＲＴ）、多元适应性回归样条（Ｍｕｌｔｉｖ撕ａｔｅａｄａｐｔｉｖｅｒｅ铲ｅｓｓｉｏｎｓｐｌｉｎｅｓ，ＭＡＲＳ）和多因子降维法（Ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏ卜ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｉｔｙｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，ＭＤＲ）等，其中ＭＤＲ是应用较为广泛的一种方法，本研究中我们采用ＭＤＲ方法分析ＨＭｏＸｌ基因和ＨＭＯＸ２基因在高血压的发病中是否存在交互作用。二、研究对象和方法２．１研究对象及调查内容所有研究对象的ＤＮＡ样本和临床资料均来自亚洲国际心血管疾病协作研究（ＩｎｔｅｍａｔｉｏｎａｌｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｆｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｉｎＡｓｉａ，ＩｎｔｅｒＡＳＩＡ）的中国部分。ＩｎｔｅｒＡＳＩＡ研究采用多阶段整群随机抽样方法，选取了全国范围年龄在３５岁到７４岁之间具有代表性的人群样本，共有１５，８３８名参与者最终完成了调查和相关检查项卧１３１，ＩｎｔｅｒＡｓＩＡ研究方案得到了伦理委员会的批准，并且所有参与者均签署了知情同意书。为了检测出高血压病例与对照组之间可能的遗传差异和提高关联分析的把握度，我们从ＩｎｔｅｒＡＳＩＡ人群中选择了５０３例血压水平为收缩压（Ｓｙｓｔｏｌｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅ，ＳＢＰ）之１６０ｍｍＨｇ和／或舒张压（Ｄｉａｓｔｏｌｉｃｂｌｏｏｄｂｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅ，ＤＢＰ）之１００ｍｍＨｇ的高血压患者和４９０例年龄、性别匹配的血压正常对照（ＳＢＰ＜１４０ｍｍＨｇ且ＤＢＰ＜９０ｍｍＨｇ）。所有研究对象均为汉族，无血缘关系。按照标准方法进行资料的收集和访谈，调查员均经过统一的培训和考核。调查前制定详细的调查表，对所有入选者采用统一的调查表进行详细的调查，包括人口统计学和一般情况、北京协和医学院博士研究生学位论文ＨＭｏＸ基因与原发性高血压个人史及家族史、吸烟与饮酒史，病例组详细记录降压药使用情况（包括药物的名称、是否规律用药、最近两周是否服药等），测量血压、身高、体重、腰围和臀围，体重指数（ＢＭＩ）＝体重／身高２（ｋ∥ｍ２）。根据美国心脏病协会（ＡｍｅｒｉｃａｎｈｅａｎａＳｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ＡＨＡ）推荐的标准，由统一培训的调查人员对每个研究对象测量３次血压。测量血压前研究对象坐位休息５分钟。此外，测量血压前３０分钟避免饮酒、吸烟、饮茶／咖啡及体育锻炼。研究中排除了有继发性高血压、冠心病、糖尿病、脑卒中、严重肝肾疾病或甲状腺疾病病史以及恶性肿瘤的对象。２．２标本采集和生化指标测定所有调查对象晨起空腹，由受过训练的护士使用Ｇｒｅｉｎｅｒ公司（奥地利）真空耿血管采集肘静脉血液样本（６ｍｌＥＤＴＡ抗凝血和５ｍｌ非抗凝阻），于４０Ｃ３０００转／分钟离心１５分钟，分离血浆和血清用于后续检测。样品采集后于一７０。Ｃ冷冻保存。使用同立７０６０自动生化分析仪，根据标准方法（高密度脂蛋白胆固醇（ＨＤＬ―Ｃ）：磷酸钨沉淀法；其余：酶法）测定血清生化指标，包括：空腹血糖（Ｇｌｕ）、总胆固醇（Ｔｃ）、甘油三酯（ＴＧ）、ＨＤＬ．Ｃ和血肌酐（ｃｒ）水平。当ＴＧ＜４００ｍ∥ｄ１时，用Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ公式计算低密度脂蛋白胆固醇水平（ＬＤＬ―Ｃ），即ＬＤＬ．Ｃ＝ＴＣ―ＨＤＬ―Ｃ―ＴＧ／５（所有指标单位均为ｍｍｏｌ／Ｌ）。使用标准方法从血液白细胞中分离提取基因组ＤＮＡ。使用分光光度计进行ＤＮＡ质量鉴定，ｏＤ２６０／ｏＤ２８０≈１．８为合格。２．３标签ＳＮＰ选择本研究根据ＰａｕｌｄｅＢａｋｋｅｒ等人【２３】提出的扩张标签（Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｔａｇｇｉｎｇ）ＳＮＰ选择方法进行标签ＳＮＰ的选择。该方法首先以预设的ｒ２为界值，按照配对标签（Ｐａｉ刑ｉｓｅｔａｇｇｉｎｇ）ＳＮＰ选择方法构建一个包含最少标签ＳＮＰ的集合，该集合代表的所有ＳＮＰ位点均与集合中的某个ｓＮＰ位点相关，其相关程度大于等于预设的ｒ２值。然后应用多标记检验方法（Ｍｕｌｔｉ―ｍａｒｋｅｒｔｅｓｔ），在第一步构建的集合所不能代表的剩余ＳＮＰ位点中，寻找可以用集合中多个标签ＳＮＰ位点的组合所代表的ＳＮＰ位点。最后，应用多标记检验方法对第一步中构建好的标签ＳＮＰ集合进行回溯检查，去除可以用多个标签ＳＮＰ位点组合代表的单个标签ＳＮＰ位点。该方法以配对优势对数评分（Ｐａｉ刑ｉｓｅＬｏＤｓｃｏｒｅ）方法衡量ＳＮＰ位点问的连锁关系，且２７北京协和医学院博士研究生学位论文ＨＭｏＸ基因与原发性高血压只在连锁不平衡的ＳＮＰ位点间进行多标记检验方法，这样就避免了重复选择标签ＳＮＰ位点。ＬｏＤ值默认为３，该参数可以根据需要调整。扩张标签ＳＮＰ选择方法已由Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ软件中的Ｔａｇｇｅｒ程序实现，本研究选取的运行参数是：ＭＡ眨Ｏ．５，ｒ２芝Ｏ．８，ＬｏＤ≥３。ＨＭＯＸｌ基因定位于２２号染色体的ｑ１２．１３．１，全长约１３ｋｂ。上下游各扩２ｋｂ后，ＨＭＯＸｌ基因在ＨａｐＭａｐＩＩ期数据上（更新至２００７年４月）共有１２个常见ＳＮＰ位点（ＭＡ脸Ｏ．０５），应用Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ软件中的Ｔａｇｇｅｒ程序，根据扩张标签ＳＮＰ选择方法，最小ｒ２＝Ｏ．８时，可选出３个标签ＳＮＰ（ｔａｇＳＮＰ）来代表这１２个ＳＮＰ位点，这３个ＳＮＰ分别为ｒｓ８１４０６６９，ｒＳ９６０７２６７和ｒＳ２０７１７４９。ＨＭＯＸ２基因定位于１６号染色体的ｐ１３．３，全长约３４ｋｂ。上下游各扩２ｋｂ后，ＨＭｏｘ２基因在ＨａｐＭａｐＩＩ期数据上共有１８个常见ＳＮＰ位点（ＭＡ眨Ｏ．０５），应用与ＨＭＯＸｌ基因相同的标准，可选出２个ｔａｇＳＮＰ（ｒｓ４７８６５００和ｒｓ９９２１７８１）来代表所有的１８个ＳＮＰ位点，其中ｒｓ４７８６５００可代表除ｒｓ９９２１７８ｌ外的其它１６个ＳＮＰ。选择的５个ｔａｇＳＮＰ位点的详细信息见下表。表ｌＨＭｏＸｌ基冈和ＨＭ０ｘ２基因标签ＳＮＰ伉点信息ＭＡＦ：少见等位基闪频率＋常见／少见等位基因４本研究中的少见等位基因频率２．４基因分型利用ｏｌｉ９０６．Ｏ软件设计引物，采用ＰＣＲ．ＲＦＬＰ的方法，在９９３名个体中进行基因分型。表２列出了５个标签ＳＮＰ位点相应的ＰＣＲ引物序列、ＰＣＲ产物北京协和医学院博士研究生学位论文ＨＭＯＸ基因与原发性高血压长度、限制性内切酶及各等位基因所对应的酶切片段的长度。表３给出了ＰＣＲ反应体系成分的组成，总反应体系共１０肛１。ＰＣＲ的循环参数：９４。Ｃ预变性５分钟，经９４ｏＣ１５秒，５０ｏＣ（ｒｓ９９２１７８１）或５９ｏＣ（ｒｓ８１４０６６９，ｒｓ９６０７２６７，ｒＳ２０７１７４９和ｒｓ４７８６５００）２０秒，７２ｏＣ２０秒，循环４０次，后于７２ｏＣ延伸１０分钟。主要热循环设备为ＡＢＩＰＲＩＳＭ表２９７００ＰＣＲ仪。ＨＭｏＸｌ基因和ＨＭＯＸ２基因标签ＳＮＰ引物序列和限制性内切酶注：Ｕ代表上游引物，Ｌ代表一卜．游引物；下划线表示错配的碱基酶切体系（１５“１）：限制性内切酶１Ｕ、Ｂｕ仃ｅｒ１．５“ｌ、ｄｄＨ２０３．４肛ｌ、ＰＣＲ产物１０¨ｌ（见表３）。ｒｓ８１４０６６９，ｒｓ９６０７２６７，ｒＳ２０７１７４９和ｒｓ４７８６５００的ＰＣＲ产物经３７０Ｃ恒温箱中消化过夜，ｒＳ９９２１７８１的ＰＣＲ产物经５５０Ｃ水浴箱中消化过夜。鉴定基因型：酶切产物经２‰３％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外灯下读取酶切结果并确定基因型（图１．图５）。在酶切电泳结果中，ＤＮＡ标记使用ＭａｒｋｅｒＩ，从小到大片段分别为１００６００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ和ｂｐ。使用Ｂｉｏ―ＲａｄＧｅｌＤｏｃ２０００型凝胶成像仪在合适的曝光条件下显影并照相保存胶图。随机抽取ｌＯ％的个体进行重复基因分型，控制基因分型质量。独立、双遍判读基因型并输入数据库。北京协和医学院博士研究生学位论文Ｉ｛Ｍ０ｘ基因与原发性高血压表３ＨＭＯｘｌ基因和ＨＭ０）（２基因标签ｓＮＰ伉点ＰｃＲ体系和酶切体系的组成及反应带ｎｃ）ｆＪｂ”５００¨４０ｕｂ【）３ｆｍ¨２（ｍｂｎ｜ｃ｝ｆｌｈｎ５，７，８为Ｔｒ基因型，６为１Ａ基因刑，Ｍ为Ｉｎａｒｋｅｒ嘲ｌＨＭＯｘｌ基内Ｂ８ｊ４０６６９基Ｉ划型鉴定圈示北京协和医学院博士研究生学位论丈ＨＭｏｘ基因与原发性高血压６００ｂｏ５００ｈｏ４（）０ｂｏ３００ｂ口２００ｂ口ｌ叫ｂｏ２３４５６７８Ｍ３，４．５为ＴＴ基因型，２，６，８为Ｔｃ基闻型，７为ｃｃ基因掣，Ｍ为眦ｒｋｃｒ幽２ＨＭ０ｘ１摹田口９６０７２６７基冈型鉴定酗示６０。ｂＤ５００ｂ口４（１０ｈ３００ｂ口２００ｂ口Ｉ（ｍｂ３４５６７８Ｍ８为ＧＧ基ｌｑ型，２为ＧＡ萜冈吧．５为ＡＡ墓ｌ州刑．Ｍ为ｍａ＾ｃｒ刚３ＨＭ０ｘｌ基因ｎ２０７１７４９基田型鉴定凹示６ｗ，ｂｏ５∞ｈ４００ｂＤ３㈨ｂＤ２００ｂＤ２３４５６７８Ｍ２，７为ＴＴ基冈型，３．４，６，８为Ｔｃ基闪型，５为ｃｃ基内科。Ｍ为ｍａ＾ｅｒ网４ＨＭＯｘ２基闭ｒＳ４７８６５００基Ｗ型鉴定刚不北京协和医擘院博士研究生学位论疋ＨＭ０ｘ基因与原发性高血压６００ｂＤ５００ｂｏ４Ｉｍｂｏ３００ｂＤ２００ｂｏｏｏｂＤ２．３，５．６，７，８为ｃｃ基Ⅲ７ｑ。４为Ｔｃ基协ｌ型，Ｍ为ｍａ出ｅｒ幽５ＩｌＭｏｘ２基Ｌ碍％９９２１７８ｌ基…型鉴定吲示２．５统计分析２５１标签ｓＮＰ与原发性高血雎的关联分析数据采用ｓＰｓｓ软件１３０（ｓＰｓｓＩｎｃ，ｃｈｍｇｏ，ｕｓＡ）进｛ｊ统计分析。计量资料以均数±标准差表示。应用两样本ｔ榆验（计晕资料）或乍方榆验（计数资料）比较病例组和对照组蜘人体测晕指标、尘化指标及ｍ压水平之Ｍ的差异。根据基叫型频率计钟＿等他基凶频率，通过引ｓｈｅｒ精确概率法检验枷、签ｓＮＰ位＾是否符合Ｈａｒｄｙ－ｗｃｌｎｂｅ喀平撕。以卡疗检验比较丛冈型在病例纽｛ｌ时蹦组刚的分布差异。然后应用非祭¨ＬｏｇＩｓｔＩｃ回蚰模型，校｛１：传统心咖管病危险心豢，例如性别、年龄、ＢＭＩ、吸烟、饮洒、ｍ槠、肌酐和ｍ脂水平后．分析ＨＭｏｘｌ和ＨＭＯ）（２璀因标签ｓＮＰ位点对高血压危险的作用大小，计算比值比（ｏｄｄｓｒａｔｉｏ，ＯＲ）和９５％可信区问（ｃｏｎ尉ｃｎｃｃＩｎｔｅｒｖａｌ，ＣＩ）。２５２单体型、烈体型与原发性高血压的关联分析采用ＥＭ原理计算单体型频率，应用ｓｃｈａｌｄ等【“魄出的计分检验（ｓｃｏｒｃｔｅｓｔ）探讨在校正环境因豢后单体型和高血雎的发生是否相关。统计分析由ＨａＤｌｏｓｔａｔｓ程序完成，该程序包含Ｈａｐｌｏｅｍ、Ｈ叩ｌｏｓｃｏｒｃ和Ｈａｐｌ。羽ｍ㈣＝个模块。Ｈａｐｌｏｃｍ是用米估训单体型的频率；Ｈａｐｌｏｓｃｏｒｃ足在校正环境危险凼岽后，比较单体型在病例纽和对照组问频率分布是否存在差异；ＨａｐｌｏｇＩｍ探讨在校ｌｌ其它危险因索后，单体型埘高血雎危险的作用大小，井计算ＯＲ值和９５％可信区间。该程序通北京协和医学院博士研究生学位论文ＨＭｏＸ基因与原发性高血压过ＥＭ算法估计单体型频率及个体单体型对（Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｐａｉｒ）概率，并基于广义线性模型（ＧＬＭ）构建单体型与疾病表型的回归方程。此外，以Ｈａｐｌｏ．ｅｍ程序估计的每个个体每种可能的单体型组合而成的双体型的频率作为权重，应用加权Ｌｏ西ｓｔｉｃ回归方法进行双体型分析。频率小于５％的单体型和双体型不参与分析。２．５．３标签ＳＮＰ位点与血压水平的关系分析对单个标签ＳＮＰ分析、单体型分析和双体型分析结果均提示与ＥＨ相关的基因，进一步分析该基因标签ＳＮＰ位点与血压水平之间的关系。以ｔ检验比较标签ＳＮＰ位点的突变纯合基因型个体和其他基因型个体的血压水平有无显著差异；应用多元线性回归模型分析在校正可能影响血压水平的危险因素后，与收缩压和舒张压水平相关的ＳＮＰ位点；采用Ｈａｐｌｏ．ｓｃｏｒｅ程序校Ｊ下环境因素后，分析单体型与收缩压和舒张压水平是否相关。２．５．４基因．基因间交互作用分析基因．基因之间的交互作用，即上位效应，在常见疾病的遗传影响因素中有重要作用，Ｍｏｏｒｅ等【２６】研究认为上位效应是导致原发性高血压遗传关联研究重复性较差的一个主要因素。采用传统的参数统计方法，如线性模型或Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归模型，分析病例对照研究设计中众多ＳＮＰ之间的基因一基因交互作用，可能会导致ＩＩ类错误增加，效能降低，且所需样本量大，过程繁琐，模型参数的结果难以解释，况且，大多数复杂疾病的基因型和表型之Ｉ、日Ｊ并非线性关系。同时，在研究多位点之间基因．基因交互作用时，每增加一个ＳＮＰ位点，数据在多维空｜’ｕＪ的分布就会变得相对稀疏，在某些基凶型组合下很可能会没有观察值【２７】，这增加了多位点Ｉ、日Ｊ交互作用的检测难度。２００１年Ｒｉｔｃｈｉｅ等首次提出采用多因子降维法（ＭＤＲ）分析基因．基因之问的交互作用【２¨。该方法将研究中多个ＳＮＰ位点的基因型分为高危组和低危组，这样将用于预测的基因型从多维降至一维两水平，然后通过交叉验证（Ｃｍｓｓｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）和置换检验（Ｐｅｒｎｌｕｔａｔｉｏｎｔｅｓｔｉｎｇ）来评价这个新的一维变量对疾病分类和预测的效力，在检验所有可能的多位点基因型组合后，报告最佳分类的组合。ＭＤＲ分析是一种非参数、无需遗传模型的分析方法，最多可处理４０００名研究对象、５００个变量中２～１５个遗传或环境因素之间的交互作用【２８】，适用于病例对照研究或患病不一致同胞对设计，只需具备各位点的遗传数据即可进行基因．基因３３北京协和医学院博士研究生学位论文ＨＭＯＸ基因与原发性高血压交互作用的分析，其优点在于可以大大降低建模所需的自由度。Ｒｉｔｃｈｉｅ等【２９】在病例对照各为２００的样本量中估计了基因型错分、数据缺失及遗传异质性对ＭＤＲ效能的影响，结果显示，ＭＤＲ检测两点交互作用的效能达到８０％以上，即使在基因型错分５％或数据缺失达５％的情况下，对大多数模型该结果仍然真实。目前该方法己成功应用于原发性高血压等疾病的研究【３０】，具有传统统计学分析方法无法比拟的优势。本研究采用ＭＤＲ方法分析ＨＭｏｘｌ基因和ＨＭｏｘ２基因在原发性高血压的发生中是否存在交互作用。三、结果３．１研究对象一般特征所有研究对象的一般情况比较见表４。病例组的年龄、性别、吸烟和饮酒比例与对照组比较没有显著差别。病例组血清ＨＤＬ．Ｃ水平明显低于对照组（尸＜Ｏ．０５）：而ＢＭＩ、ＴＣ、ＴＧ、Ｇｌｕ和Ｃｒ水平高于对照组（尺０．０５）。表４研究对象一般情况比较ＳＢＰ，收缩压；ＤＢＰ，舒张压；ＢＭＩ，体重指数；ＴＣ，总胆Ｉ州醇；ＨＤＬ―Ｃ，高密度脂蛋北京协和医学院博士研究生学位论文白胆同醇；１２次。ＨＭＯＸ基因与原发性高血压Ｃｒ，血肌酐：吸ＬＤＬ―Ｃ，低密度脂蛋白胆ｌ卉Ｉ醇：ＴＧ，甘油三酯；Ｇｌｕ，血糖；烟者，在调查访问前至少吸烟１００支：饮酒者，在调查访问前的一年时间内饮酒次数不少于３．２ＨＭｏＸｌ和ＨＭｏＸ２基因标签ＳＮＰ位点与原发性高血压的关联分析ＨＭＯＸｌ基因和ＨＭｏＸ２基因的５个标签ＳＮＰ位点在总样本、病例组和对照组中的基因型分布均符合ＨＷＥ。ＨＭＯＸｌ基因ｒｓ８１４０６６９位点在ＨａｐＭ印数据库中国人群中ＭＡＦ为０．０６７，ＨＭｏＸ２基因ｒｓ９９２１７８ｌ位点的ＭＡＦ为０．１３２，但是本研究中并没有观察到这两个位点的突变纯合基因型。由表５可以看到，ＨＭＯＸｌ基因ｒＳ９６０７２６７位点ＣＣ基因型在病例组中的频率显著高于对照组，用Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析校正年龄、性别、ＢＭＩ、Ｇｌｕ、Ｃｒ、吸烟、饮酒和血脂水平后发现，ｒＳ９６０７２６７位点ＣＣ基因型个体ＥＨ发病危险高于ＧＧ／ＧＣ基因型个体（校正后ＯＲ＝１．４１，９５％ＣＩ：１．０２．１．９５，仁Ｏ．０４０）（表５）。此外，在校正协变量前和校正协变量后均没有观察到ＨＭｏＸｌ基因其它标签ＳＮＰ位点和ＨＭｏＸ２基因标签ＳＮＰ位点与ＥＨ关联。表５ＨＭＯＸｌ基冈和ＨＭｏＸ２基冈标签ＳＮＰ位点与原发性高血压关联分析’本研究没有观察剑该位点的突变纯合基冈型。＃校正年龄、性别、ＢＭＩ、Ｇｌｕ、Ｃｒ、吸烟、饮酒和血脂水平。３．３ＨＭｏＸｌ基因单体型、双体型与原发性高血压的关联分析ＨＭＯＸｌ基因３个标签ＳＮＰ位点共组成８种单体型，其中３种单体型的频率大于５％，这３种单体型累计频率达９５．２％，本研究只对频率大于或等于５％的单体型进行了分析。由于对照组中单体型Ｔ．Ｔ－Ｇ（Ｈａｐｌ，位点排列次序为北京协和医学院博士研究生学位论文ＨＭＯｘ基因与原发性高血压ｒＳ８１４０６６９．ｒｓ９６０７２６７．ｒＳ２０７１７４９，以下单体型位点排列次序均与此相同）的频率（Ｏ．２５５）大于病例组（Ｏ．２３３），因此选择Ｈａｐｌ为对照单体型。从表６可以看到，单体型Ｔ．Ｃ．Ｇ（Ｈａｐ３）在病例组中的频率（Ｏ．４７１）显著高于对照组（Ｏ．４４０）。进一步应用了Ｈａｐｌｏ．ｇｌｍ程序，以单体型Ｈａｐｌ（Ｔ－Ｔ－Ｇ）作为对照单体型，评估每种单体型对高血压发病的作用。在校正年龄、性别、ＢＭＩ等影响因素后，与单体型Ｈａｐｌ（Ｔ－Ｔ－Ｇ）比较，携带ｒＳ９６０７２６７Ｃ等位基因的单体型Ｈａｐ３（Ｔ－Ｃ．Ｇ）显著增加高血压发生的危险，其校正后的ｏＲ值为１．４４（９５％ＣＩ：１．０４．２．Ｏｌ，ｐＯ．０２９）。表６ＨＭＯＸｌ基因单体型、双体璎频率分布及与原发性高血压关联分析注：表格中没有色括频率低于５％的单体型和双体型＋单体型位点排列次序ｒＳ８１４０６６９．ｒＳ９６０７２６７一ｒＳ２０７１７４９。４选择Ｈａｐｌ单体型作为对照单体型。’选择Ｄｉｐｌ双体型作为对照双体型。｛校正的协变量包括年龄、性别、ＢＭＩ、Ｇｌｕ、Ｃｒ、吸烟、饮酒和血脂水平。ＨＭｏＸｌ基因３个标签ＳＮＰ位点的３种常见单体型共组成６种双体型，频率均大于５％。以含有两个保护作用的单体型（Ｈ印１）组成的双体型Ｈａｐｌ．Ｈａｐｌ北京协和医学院博士研究生学位论文ＨＭｏＸ基因与原发性高血压作为对照双体型，校正年龄、性别、ＢＭＩ、Ｇｌｕ、Ｃｒ、吸烟、饮酒和血脂水平后，由两个危险单体型组成的双体型Ｈａｐ３一Ｈａｐ３携带者发生高血压的危险为对照双体型携带者的１．６７倍（９５％ＣＩ：１．０７．２．６ｌ，尸＝Ｏ．０２５），见表６。单体型分析及双体型分析结果与单个标签ＳＮＰ结果相一致。３．４ＨＭｏｘ２基因单体型、双体型与原发性高血压关联分析ＨＭＯｘ２基因２个标签ＳＮＰ共组成４种单体型，其中２种单体型频率大子５％，这２种单体型累计频率达９９．４％。由于对照组中单体型Ｔ－Ｃ（Ｈａｐｌ，位点排列次序为ｒｓ４７８６５００一ｒｓ９９２１７８１，以下单体型排列次序均与此相同）的频率（Ｏ．６８０）高于病例组（０．６６２），因此选择该单体型作为对照单体型。由表７可见，虽然ＨＭＯｘ２基因的Ｈａｐ２单体型（Ｃ―Ｃ）频率在病例组中高于对照组，但是这种差别没有统计学意义。此外，在校正年龄、性别等影响因素后，没有观察到可能增加或降低高血压危险的单体型。表７ＨＭＯＸ２基冈单体型、双体型频率分布及与原发性高血压关联分析注：表格中没有包括频率低于５％的单体型和双体型。’单体型位点排列次序ｒＳ４７８６５００稍９９２１７８１。”选择Ｈａｐｌ单体型作为对照单体型。’选择Ｄｉｐｌ双体型作为对照双体型。｝校正的协变量包括年龄、性别、ＢＭＩ、Ｇｌｕ、Ｃｒ、吸烟、饮酒和血脂水平。ＨＭＯＸ２基因２个标签ＳＮＰ位点的２种常见单体型共组成３种双体型，频３７北京协和医学院博士研究生学位论ｔＨＭ０ｘ基因与原发性高血压率均大于５％。以两个保护作川的单体型组成的政体碰Ｈ印ｌ－ＪＩａｐＩ为刘照双体型，校正其它影响因素后，没有舰察到可能增加或降低高Ｉ缸上丘发病危险的取体型，结果见表７。单体型分析及取体型分析结果与单个标签ｓＮＰ结粜丰Ｈ一致。３．５ＩｌＭｏｘｌ基因标签ｓＮＰ位点与血压水平关系分析单个标签ｓＮＰ分析、单体型分析和双体掣分析结果均提示ＨＭｏｘＩ基因可能与ＥＨ相关，凶此我们进步刘该基凼与血压水平之『ＬＩｊ的关系进行ｒ分析。奉研究－ｐ没有观察到ｒｓ８１４０６６９位点的突变纯合基因型，只分析了酶基凶的ｒｓ９６０７２６７位ｒ＾和璐２０７１７４９何点，结果见图６。由冈Ｌ｝＿ｌ可知，ＨＭｏｘ】基因ｒｓ９６０７２６７化点ｃｃ基冈型个体的收缩压（１４６９±３１５ｍｍＨｇ）和舒张Ｊｌ、（８９９土１６１４１】±２９８ｍｍＨ２）水平均硅著『苛１。该位点Ｈ他基冈型个体（收缩压２±ｌ５１ｍｍ№，舒张Ｈ、８７８ｍｍＨＫ），筹异有统¨学意义（尸值均ｃ７００５）。ｌ比外．没有观察到ｒｓ２０７】７４９位点小同基冈型个体ｆ¨血压水平存在硅善荠异。∞∞∞∞∞∞∞∞∞☆＿一口｝扪“蘸嘲ｒｓ９６０７２６，ｎ２０７ｌ，４９?与}