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金属有机框架化合物的合成、表征及其性质
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曲霉型豆豉发酵特性及风味物质研究
中国农业大学 博士学位论文 曲霉型豆豉发酵特性及风味物质研究 姓名：汪立君 申请学位级别：博士 专业：食品科学与工程 指导教师：李里特
中国农业大学博士学位论文摘要摘要豆豉是我国传统的大豆发酵制品，且自古以来药食两用，迄今还用于ＪＬ种中药制剂中。本论 文检测了曲霉型豆豉加工过程中的主要感官指标（硬度和颜色）的变化，分析了豆豉后发酵的主要添加物――盐对它们的影响：检测了豆豉中两种营养成分（蛋白质和异黄酮）在加工过程中的变化，进一步分析盐对它们的影响：采用同时蒸馏萃取法提取了豆豉的挥发性风味成分，运用气 质联用定性和定量分析了市售豆豉的挥发性风味成分并比较它们之间的异同，进一步分析了曲霉 型豆豉加：ｌ过程中挥发性成分产生过程。得出以下主要结果： Ｉ、同一盐浓度的豆豉在后发酵过程中，硬度显著降低；豆豉的硬度在后发酵阶段受盐浓度的影 响，在同一发酵时间盐浓度越低，豆豉的硬度越低。豆豉的颜色在后发酵过程中，变暗、变黑。２、豆豉在前发酵过程中样品的ｐＨ值、可溶性蛋白含量和氨基氮含量升高。在后发酵过程中，ｐＨ 值显著降低，可溶性蛋白质含量利氨基氮含量则继续升高。盐浓度越高，ｐＨ值越高，可溶性 蛋白质和氨基氮含量越低。发酵结束，大部分蛋白质降解成多肽和氨基酸，分子量在２５ＫＤａ以下。３、豆豉Ｊ３ｎ＿Ｌ过程中总异黄酮的损失率为６１％。预处理没有造成异黄酮总量的显著损失，前发酵 损失４３％，后发酵损失１８％。后发酵中添加不同浓度的盐，对异黄酮总量影响不显著。 ４、豆豉加工的不同阶段显著影ｕ自异黄酮各异构体的含量。总体上，甙元型异黄酮的含量均显著 升高，葡萄糖苷型异黄酮、乙酰基葡萄糖苷型异黄酮和丙二酰基葡萄糖苷型异黄酮的含量降低。发酵结束，所有样品甙元型异黄酮含量均达到９０％以上。５、发酵过程中１３一葡萄糖苷酶活力和甙元型异黄酮含量有显著的相关关系。在前发酵阶段ｐ一葡 萄糖苷酶活力和甙元型异黄酮含量均显著升高。在后发酵中添加不同浓度的盐，影响ｐ一葡萄 糖苷酶活力和甙元型异黄酮含量，在后发酵的同一时间里，盐浓度越高，Ｂ一葡萄糖苷酶的活 性币Ｉ甙元型异黄酮含量越低。 ６、不同品种的豆豉中共检测到１７２种化合物，其中有２５种化合物在三种豆豉中均能检测到，挥 发性成分总数之间存在明显的差异。阳江桥姜豉中检出物最丰富，鉴定出的成分共有１０４种， 太平桥豆豉共有９２种．永ＪＩＩ家乡豆豉共有６２种。不同品种豆豉中，不同种类的化合物的含 量也明显不同，永川家乡豆豉中醇、醛、酸、酯的含量明显高于其他两种，而太平桥豆豉中 的吡嗪类含量较高。 ７、同时蒸馏萃取法结合ＧＣ．ＭＳ检测到的豆豉挥发性风味成分可分为１３个种类，包括烃类、醇 类、醛类、酮类、酸类、酯类、吡嗪类、呋喃类、含硫化合物、酚类、吡啶类、嘧啶类和其 他。根据与其他大豆发酵制品风味的比较可知，吡嗪和酚类化合物对豆豉的风味最有贡献， 醛、醇、酮和古硫化台物对豆豉的风味也有一定的贡献。关键词：豆豉硬度蛋白质异黄酮风味成分ＡＢＳＴＲＡＣＴＤｏｕｃｈｉ ｉｓ ｐｏｐｕｌａｒ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ ｓｅｖｅｒａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅａｓａｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｆｏｏｄ．Ｎｏｗａｄａｙｓ，ｉｔ ｉｓ ｓｔｉｌｌ ｕｓｅｄ ａｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｆｅｗ ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｉｔｓｓｅｎｓｅ，ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，ｗｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｔｈｅｓｅｎｓｅ（ｈａｒｄｎｅｓｓ ａｎｄ ｃｏｌｏｒ）ｏｆｄｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ－ｔｙｐｅ Ｄｏｕｃｈｉ，ａｎｄ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｕｃｈｉ．Ｄｏｕｃｈｉ’ｓ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｆｒｏｍｆｏｕｒ ｆａｍｏｕｓ ｂｒａｎｄｓ ｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｓｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｔｅａｍ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓａｐｐａｒａｔｕｓ（ＳＤＥ），ａｎｄｖｏｌａｔｉｌｅｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｇａｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣ－ＭＳ）．Ｔｈｅａｒｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｄｏｕｃｈｉ ｍａｋｉｎｇ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔｓａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：１．Ｄｏｕｃｈｉ’ｓ ｈａｒｄｎｅｓｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ ｄｕｒｉｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．ａｎｄ ｔｈｅ ｈａｒｄｎｅｓｓ ｏｆ Ｄｏｕｃｈｉ ｓｈｏｗｅｄ ｌｏｗｅｒ ｖａｌｕｅｓ ａｔ ｌｏｗｅｒ ｓａｌｔ ｌｅｖｅｌ Ｄｏｕｃｈｉ’ｓ ｃｏｌｏｒ ｃｈａｎｇｅｄ ｄａｒｋ ａｎｄ ｂｌａｃｋ． ２ Ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄｆｏｒｍｏｌｃｏｎｔｅｎｔｓｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＦＮ）ｉｎｃｒｅａｓｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｍ―ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＦＮ ｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｔｉｌｌ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｓｔ―ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ＮａＣｌ ｃｏｎｔｅｎｔ，ｂｕｔ ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＦＮ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｌｏｗ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ＮａＣＩ ｃｏｎｔｅｎｔ．Ｔｈｅ ｍａｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｗｈｉｃｈ ｆｏｒｍｅｄ ｔｈｅ ｂｏｄｙ ｏｆ Ｄｏｕｃｈｉ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｏｍｅ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｐｅｐｔｉｄｅｓ（１ｅｓｓｔｈａｎ ２５ｋＤａ）ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． ｉｎ ｒａｗ ｓｏｙｂｅａｎｓ ｗｅｒｅ ｌｏｓｔ，ｗｈｉｃｈ Ｄｏｕｃｈｉ ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ａＲｒｉｂｕｔｅｄ ｔｏ３．Ｓｉｘｔｙ－ｏｎｅ ｐｅｒｃｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｆｉａｖｏｎｅｓｐｒｅ－ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（４３％）ａｎｄ ｐｏｓｂｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（１８％）ｄｕｒｉｎｇｐｒｅ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｄｉｄ ｎｏｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｗｈｉｌｅａｍａｊｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｏｔａｌ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ Ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｈａｎｇｅｓｉＤ ｔｈｅ ｔｏｔａＩ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｖａｒｉｏｕｓ ｓａｌｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｈｅｍｅｓ ｉｎ Ｄｏｕｃｈｉ． ４．Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｒｏｍ ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ ａｎｄｒａｗｓｏｙｂｅａｎｓ ｔｏＤｏｕｃｈｉ，ｔｈｅ ａｇｌｙｃｏｎｅｓ（ｄａｉｄｚｅｉｎ， ａｎｄｇｌｙｃｉｔｅｉｎ）ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｉｌｅｔｈｅ１３－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ（ｄａｉｄｚｉｎ，ｇｅｎｉｓｔｉｎａｎｄｇｌｙｃｉｔｉｎ），ｍａＩｏｎｙｌｇＩｕｃｏｓｉｄｅｓ（６＂－Ｏ－ｍａｌｏｎｙｌｄａｉｄｚｉｎ，６＂－Ｏ―ｍａｌｏｎｙｌｇｅｎｉｓｔｉｎａｃｅｔｙｌｇｌｕｅｏｓｉｄｅｓ（６＂－Ｏ－ａｃｅｔｙｌｄａｉｄｚｉｎ ａｎｄ６＂－０－ｍａｌｏｎｙｌｇｌｙｃｉｔｉｎ），ａｎｄｉｎ ｔｈｅ６＂－Ｏ－ａｃｅｔｙｌｇｅｎｉｓｔｉｎ）ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｆｕｒｔｈｅｒ，ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓｆｏｒｍ ｏｆａｇｌｙｃｏｎｅｓ ｅｘｃｅｅｄｅｄ ９０％ｏｆｔｏｔａｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｏｓｔ－ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ． ５．Ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ａｇｌｙｃｏｎｅｓ ｋｅｐｔ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎａｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｃｌｏｓｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｗｉｔｈＢ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ Ｄｏｕｃｈｉ’ｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｏｔｈｐ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ａｇｌｙｃｏｎｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＮａＣｌｃｏｎｔｅｎｔｐｒｅ‘ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ｐ＜Ｏ．０５）．ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｄｉｄａｆｆｅｃｔ１３－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｅａｇｌｙｃｏｎｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ＮａＣＩ ｃｏｎｔｅｎｔ． ６．Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １ ７２ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎｓ，ｂｕｔ ｏｎｌｙ ２５ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｍｏｎ ｔｏ ａｌｌ ｔｈｒｅｅ ｂｒａｎｄｓ．Ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ １０４， ９２ ａｎｄ ６２ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｒａｎｄｓ ｏｆ Ｄｏｕｅｈｉ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌｓ，ａｌｄｅｈｙｄｅｓ，ａｃｉｄｓ，ｅｓｔｅｒｓ ｉｎ“Ｙｏｎｇｃｈｕａｎ Ｄｏｕｃｈｉ’’Ｉｌ中国农业大学博士学位论文ＡＢＳＴＲＡＣＴｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ“Ｔａｉｐｉｎｇｑｉａｏ Ｄｏｕｃｈｉ”ａｎｄ“Ｙａｎｇｊｉａｎｇｑｉａｏ Ｄｏｕｃｈｉ”．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｐｙｒａｚｉｎｅｓ ｉｎ“Ｔａｉｐｉｎｇｑｉａｏ Ｄｏｕｃｈｉ”ｗｅｒｅ ｍｕｃｈ ｈｉｇｈｅｒ．７．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＤＥ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＧＣ―ＭＳ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｍａｊｏｒｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ，ａｌｃｏｈｏｌｓ，ａｌｄｅｈｙｄｅｓ，ｋｅｔｏｎｅｓ，ａｃｉｄｓ，ｅｓｔｅｒｓ，ｐｙｒａｚｉｎｅｓ， ｆｕｒａｎ，ｓｕｌｐｈｕｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ｐｈｅｎｏｌｓ，ｐｙｒｉｄｉｎｅｓ，ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ，ａｎｄ ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ．Ｔｈｅ ｖｏｌａｔｉｌｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｃｏｉｎｃｉｄｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｒｅｐｏｓｅｄ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｆｏｏｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｆｏｏｄ，ｐｙｒａｚｉｎｅｓ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｌｓ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｅｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｄｏｒ ｏｆＤｏｕｃｈｉ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｄｏｕｃｈｉ，Ｈａｒｄｎｅｓｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ，ｌｓｏｆｉａｖｏｎｅｓ，Ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓＩＩＩ独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：ｊ毛ｔ是时间：≥“年易月ｆｒ日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：谛亡矗时间：炒６年厶月ｆｆ日导师签名：夸孥磅帆矽６年６月世日中国农业大学博士学位论文第一章绪论第一章绪论１．１豆豉的起源与种类１．１．１豆豉的起源豆豉是我国常见的一种调味鼎，是用黑大豆或黄大豆发酵后制成，它是我国古代劳动人民在 食品方面的一项重要发明。它的创造与应用已有２５００多年的历史。豆豉古名“幽菽”。古代称大 豆为“菽”，幽是指把大豆煮熟后幽闭发酵的意思。它是我国劳动人民最早利用微生物酿造的食 品之一（赵德安，１９９２）。明罗颀著《物原》中食原第十有关于豆豉起源的记载：“殷汤作醢，吴 寿梦作蚱，秦苦李作豉，糟酱诺物则周末制也。”根据这个考证豉的出现是在秦朝（包启安，１９８５）。 豆豉的最早记载，见于２２００多年前的《楚辞?招魂》：“大苦咸酸”，东汉王逸注：“大苦，豉也。”就此看来，可能早在战国时代我国中原及南方许多地区就已经有豆豉了（张发柱，１９８２）。《史记馈殖列传》说“蘖曲盐豉千瓦，比千乘之家。”《汉书食货志》载：“长安豉樊少翁，王孙卿为天下 高訾。”说明在汉代豆豉生产已相当发达。１９７２年从湖南长沙马王堆西汉墓中发现有殉葬品豆豉 酱，证明豆豉在公元前二世纪已是人们十分嗜好的食品了。唐朝时豆豉酿造技术传入日本、朝鲜， 渐及菲律宾、印度尼西甄等东南亚国家和地区，并发展成为具有地区特色的传统食品，如日本纳 豆和东南亚天培。１．１．２豆豉的种类根据制曲时参与微生物的种类不同，有霉菌型豆豉和细菌型豆豉两大类。霉菌型豆豉参与制 曲的主要微生物是霉菌。根据霉菌种类的不同，霉菌型豆豉又有米曲霉型豆豉、根霉型豆豉、毛 霉型豆豉和脉孢霉型豆豉等。细菌型豆豉参与制曲和发酵的主要微生物是枯草芽孢杆菌、乳酸菌 等（康明宫，２００１）。 根据发酵时是否加入食盐，可分为有盐发酵豆豉和无盐发酵豆豉（赵德安，１９９２：包启安， １９８５）。有盐发酵豆豉为成豆豉，方便食用．非常适宜做菜肴；无盐发酵豆豉为淡豆豉．它具有 独特的风味，特别适宜作调味料，多用来入药。 根据豆豉中水分含量的高低，可分为干豆豉和水豆豉两种（赵德安，１９９２；包启安，１９８５）。 干豆豉只因发酵时的水分较少成品为松散的颗粒（水分古量小于２０％），油润光亮，多产于北方； 湿豆豉在发酵时加入的水分较多（水分含量小于４５％），产品含水量较高，豆粒柔软，互相粘连， 多产于南方及一般家庭制作。根据辅料的不同，有酒豉、姜豉、椒豉、茄豉、瓜豉、酱豉、香油豉等（江洁，２００４）。根据原料的不同，有黄豆豆豉、黑豆豆豉、花生豆豉。它们分别采用大豆、黑豆、花生或榨 油后的花生饼作为原料（江洁，２００４）。 我国各地人们根据当地的地理条件和生活习惯，长期以来形成各具地方特色的豆豉品种。 现在中国市场上一些久负盛名的豆豉品种见表１．１。中国农业大学博士学位论文第一章绪论表１ １中国市场上豆豉品种（未完全统计）Ｔａｈｉｅ １．１ Ｔｂｅ ｂｒａｎｄｓ ｏｆ Ｄ０１１１ｃｈｉ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍａｒｋｅｔ１。２我国豆豉的生产和消费状况传统火豆食品源远流长，已成为我国饮食文化的重要组成部分，尤其是传统的大豆发酵制品， 不仅保持了大豆食品的营养，还具有独特的风味，并有较长的货架期，使产品能够更好的流通； 且在发酵过程中会生成一些功能性物质，有利于消费者的健康。为弘扬中国食品文化，挖掘和保 护中国食品文化遗产，进～步了解我国大豆及豆制品的生产和消费情况，本研究小组于２００３年６ 月至２００４年６月在全国范围内展开对中国传统的大豆发酵制品的调查。本次调查采用问卷的方 式。问卷涉及全国３１个省份，收回有效问卷４１４份，其中２６６份来自城市，１４８份来自农村。被 调查者的年龄分布如下：１８岁以下占２．９％，１９－一２５岁占３５．５％，２６～３５岁占７．２％，３６～４５岁 占２７．１％，４６～６０岁占２１．７％，６０岁以上占４．１％，未答占４．１％。被调查者女性占３６．５％，男性 占５８．５％。未答占５％。在此主要列举对豆豉的调查结果。．２．中国农业大学博：仁学位论文第一章绪论对传统大豆食品的了解程度：１６ ４３％的人了解，７０．３ｌ％的人知道一点，１１．６２％的人不了解。 对豆豉的总体印象见图１．１。在所有的项目中回答比例较高的是认为豆豉很鲜美和有营养。全国 各地对豆豉的消费情况见图ｉ．２。经常食用豆豉的地区由高到低依次为西南、华中、西北、华北、 华东、华南、东北。这符合“南方人不可一日无豉，北方人不可一日无酱”之说。可见豆豉的消 费具有显著的地域性。调查结果显示喜欢吃豆豉的人大部分是老年人和中年人（见图１．３）。近年 来，由于人们生活水平的提高，现代饮食的多样化，传统食品遭到很大的冲击，特别是小孩和年 轻人对传统的食品已经不感兴趣，同时我们也缺少这方面的科学研究和宣传。调查结果显示，认 为当地豆豉工业化大规模生产的占４．０５％，作坊式小批量生产的占１５．５４％，家庭自给自足的占 ２７．０３％。可见，豆豉现在的生产方式大部分仍处于家庭和小作坊的生产，这样的生产方式很难达 到产品的规格化和标准化。一些小作坊生产的卫生状况也更是令人担忧。 从调查的结果来看，豆豉的生产方式落后，产品质量不稳定，卫生状况堪忧：人们对传统产 品的价值认知度不够，豆豉虽在我国消费了２５００多年，但没有引起广大消费者的关注，只是作 为一种营养丰富、Ｅｌ昧鲜美的调味佳品。其消费群体也主要是中老年人。因此我们应该加大这方 面的研究和宣传，在继承豆豉美昧可口、营养丰富等优点的基础上，对生产工艺进行研究、改造，使其能够进行工业化生产，提高豆豉的消费量。通过科学研究和宣传，一方面可让这一优秀的传统美食继续发扬光大，同时可以充分利用其功能性为全民造福：另一方面通过研究成果的宣传， 提高消费者对大豆食品的认识，从而拉动大豆食品的消费。没有回答 很容易买到 便宜 卫生 配菜后太黑 能保健 有营养 有苦昧 很成．影响食用量 根鲜美 ０ ５ １０ １５ ２０ ２５百分比（％）圉１．１对豆豉的总体印象Ｆｉｇ．１．１ Ｃｏｎｓｕｍｅｒｓ’ａｗａｒｅｎｅｓｓｏｎＤｏｕｃｈｉ ｉｎ Ｃｈｉｎａ中国农业大学博士学位论文第一章绪论西南 西北 华南 华中 华东 华北 东北０ ２０ ４０ ６０ ８０ １００圈经常食用 圈有时食用 口很少食用 口、没有回答百分比（％）东北【黑龙江、吉林和辽中）．华北（内蒙古、河北，Ｉｈ西、北京、＾天津），华东（Ｉｈ东、江苏、安徽、浙江、江西、福建、上海），华中（河南、湖北、湖南 华南（广东、海南），西北（新疆、青海、制肃，中夏、陕西）， 西南（西藏、斟川、贵州，云南、广西、重庆ｊ：图１２中国各地对豆豉的消费情况Ｆｉｇ．１．２ Ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｕｃｈｉ ｉｎ Ｃｈｉｎａ窜 丑 采 缸∞蛎∞踮∞衢∞蛎ｍ０ ０老年人中年人青年人小孩没有回答图１３喜欢吃豆豉的人群分布ｏｎＦｉｇ．Ｉ．３ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆｐｅｏｐｌｅｌｉｋｅｎｅｓｓ ｏｆＤｏｕｃｈ１．３国内外研究现状和存在问题我国主要生产毛霉、曲霉型豆豉及少量细菌型豆豉（俗称水豆豉）。国外以天培（Ｔｅｍｐｅ，印 度尼西亚根霉型豆豉）和纳豆（Ｎａｔｔｏ，日本细菌型豆豉）著名。纳豆和天培分别是由纳豆杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）和少孢根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）将蒸煮的大豆发酵而成。李里特（２００３）等已经详细论述了豆豉、纳豆和天培的异同。 国外豆豉研究以日本的纳豆和印尼的天培较为深入，他们在微生物的选育、工艺的改进、发 酵机理与控制、产品的安全性等方面都进行了系统、详细的研究；最近又掀起了对保健功能的研 究，大量的研究结果已经证明，发酵的大豆食品具有更好的生理保健功能。 国内对豆豉的研究还处于起步阶段。自１９９７年以米，西南农业大学食品学院展开了对毛霉 型豆豉的研究，先后对毛霉型豆豉的生产菌，豆豉发酵过程的生化变化，生产工艺条件及毛霉型 豆豉的营养功能特性等进行了研究。石轶松（１９９８）等研究了毛霉型豆豉类黑精的形成机理及理一４．中国农业大学博士学位论文第一章绪论化功能性质：陈留记（１９９９）等对毛霉型豆豉褐变机理进行探讨．为解决豆豉速成低盐化生产工 艺奠定基础；杜术英（１９９９）等曾对毛霉型豆豉生产过程中生化机理进行系统研究，为采用纯种 法较大规模生产豆豉提供可行工艺技术。国内对曲霉型豆豉的研究，有蔡位辉（１９９７）对曲霉型 豆豉的发酵工艺进行了改进。最近又有张建华（２００３）从传统的曲霉发酵型豆豉中分离出主要的 曲霉菌种，并对豆豉的功能性进行了探索。１．３．１生理功能方面的研究豆豉在中医药学上是一味中药，被我国卫生部定为第一批药食兼用品种，如中成药银翘解毒 片、羚翘解毒片中均含有豆豉。我国人民在长期的实践经验中发现豆豉等产品具有良好的传统保 健作用．如李时珍在《本草纲目》中记载：豆豉有开胃增食、消食化滞、发汗解表、除烦平喘、 驱风散寒、治水土不服、解山岚瘴气等疗效。对豆豉，纳豆和天培现代的保健作用归纳起来主要 有三大类： １、抗氧化功能。食品抗氧化剂不仅可延缓油脂及脂溶性成分的氧化。而且可清除人体的自 由基，从而预防许多疾病、延缓机体老化。研究已经证明大豆在发酵后比没有发酵的蒸煮大豆有 更强的抗氧化功能。研究的热点集中在起抗氧化活性的物质上。通常认为，天培中抗氧化物质为 酚类和胺类，发酵过程中维生素Ｅ无变化，而异黄酮转变为营元后具有更高的抗氧化性。Ｇｙ６ｒｇｙ 等人（１９６４）首先证明了天培比大豆具有更高的抗氧化性，并从天培中分离出了抗氧化物质，认 为三种异黄酮（黄豆甙元、染料木黄酮和６，７，４‘．三羟基．２．异黄酮）是主要的抗氧化物质： Ｍｕｒａｋａｍｉ等人（１９８４）得出与上述一致的结论；Ｅｓａｋｉ等人（１９９８）在曲霉发酵的大豆中分离出 两种新的抗氧化的异黄酮形式８一羟基黄豆甙元和８～羟基染料术黄酮（８－ｈｙｄｒｏｘｙｄａｉｄｅｉｎ （８－ＯＨＤ），８－ｈｖｄｒｏｘｖｇｅｎｉｓｔｅｉｎ（８－０ＨＧ））；Ｈｉｒｏｔａ等人（２０００）认为８．ｏＨＤ和８－ＯＨＧ对１，１一 二苯基苦基苯肼（ＤＰＰＨ）的作用与维生索Ｅ相当，即具有比黄豆甙元、染料木黄酮更强的抗氧 化作用。同时也有研究认为在天培和纳豆中起抗氧化作用的主要物质不是异黄酮，而是其它的物 质。比如：Ｍａｒｋｕｓ等人（１９９７）认为天培的抗氧化效果可能是维生素Ｅ（大豆中本身含有的）和 氨基酸（发酵过程中蛋白质的降解产生）的协同作用；１ｗａｉ等人（２００２ａ，２００２ｂ）报道纳豆水提 取物（可能是多肽）具有一定的抗氧化的活性。也有许多的研究学者，在大豆发酵食品中发现其 它的抗氧化的物质。例如：Ｅｓａｋｉ等人（１９９６）从天培中分离出一种新的抗氧化的物质是３一羟基邻氨基苯甲酸（ＨＡＡ）；接着，Ｅｓａｋｉ等人（１９９７）用３０种曲霉将蒸煮后的大豆进行发酵，发现经发酵之后所有样品的抗氧化活性都增强了，用米曲霉发酵的样品抗氧化的活性最高，并从中确 认出２，３－二羟基苯甲酸（２，３－ＤＨＢＡ）（发酵过程中产生）是主要的抗氧化物质。大豆皂甙也具 有抗氧化活性。但在发酵制品中的降解还不清楚。最近，国内学者也对豆豉抗氧化进行了研究。 宋永生等人（２００２）通过实验证明了豆豉的自身抗氧化性比原料黑豆强很多。张建华（２００３）也 报告了曲霉型豆豉曲具有较好的抗氧化活性。 ２、预防心血管疾病功能。张建华（２００３）报道了豆豉具有阶血压功能：纳豆、豆豉的溶血 栓功能也有报道（Ｆｕｊｉｔａｅｔａ１．，１９９３；李江伟等人，１９９９）。发酵大豆制品的降血压作用主要源于具有血管紧张索转换酶（ＡＣＥ）抑制活性的多肽。中国农业大学博士学位论文第一章绪论３、降血糖功能。Ｆｕｊｉｔａ等人（２００１ａ）的研究表明曲霉型豆豉的水溶性提取物对小鼠肠内ｔＺ～ 葡萄糖苷酶有抑制作用，口服后可明显降低人和小鼠进食后的血糖，长期服用（６０天）效果更明 显，且无不适反应，对内脏没有任何副作用（Ｆｕｊｉｔａ ｅｔａｌ．，２００Ｉｂ；２００１ｃ），对非胰岛素依赖型糖 尿病的治疗有潜在的价值。有研究认为．豆豉中的多糖可能是抑制ｄ一葡萄糖苷酶的主要物质（郭 瑞华等人，２００５）。 ４、抗肿瘤作用。毛俊琴等人（２００３）报道淡豆豉的乙醇提取物具有抑制肝癌肿瘤细胞增值 的作用，并和时间、剂量呈正相关，认为淡豆豉乙醇提取物中主要含异黄酮和皂苷等是抗肿瘤作 用的主要成分。 正是由于国外学者对豆豉现代保健功能的认识，并用现代的科技手段加以证实，近几年国内 也展开对豆豉的研究，并逐渐由功能性研究发展为对起功能性作用物质的研究，其中起生理作用 的物质研究较多是蛋白质和多肽，以及异黄酮等。１．３．２蛋白质方面的研究豆豉生产包括原料处理、制曲和后发酵三大过程。其中原料处理工序包括浸泡、蒸煮，目的 是给微生物生长提供一个有利的环境：制曲工序主要是依靠微生物产生降解大分子物质所需要的 各种酶，如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等；而后发酵工序则是依靠微生物和酶的作用将大分子物质 分解为小分子，如游离氨基酸、有机酸和醇类等。这些酶水解大豆的各种组分，并且促使产生期 望豆豉的组织结构、风味和芳香。同时，这些酶的水解还可以减少或者消除抗营养的组分，改善 发酵产品的营养品质。大豆中大豆蛋白的含量为３０～４０％。在所有的酶类中蛋白酶起着举足轻重 的作用，蛋白质经酶解转化为可溶性蛋白、多肽及氨基酸厉，消化率及生物价均有所提高，将氨 基态氮含量作为蛋白质水解度指标之一。国标中规定豆豉样品中的氮基态氮含量不低于ｏ．６９／】ＯＯｇ （豆豉）和１．２９／ｌＯＯｇ（干豆豉）（豆豉的质量标准ＳＢ８２．８０）。 国内外的研究学者在研究发酵大豆食品时，都将大豆蛋白在发酵过程中的变化（包括总蛋白 质的变化和蛋白质的降解程度）以及影响这种变化的因素（包括ｐＨ值，蛋白酶活力，盐、醇及 其它添加物的影响等）作为研究的重点。 Ｓｔｅｉｎｋｒａｕｓ等人（１９６０）研究了天培发酵过程中ｐＨ值的变化，结果表明天培发酵后ｐＨ值从 蒸煮大豆的５．０增加到７．０以上，在发酵后期可检测出游离氨基态氮：而Ｓｈａｍｂｕｙｉ等人（１９９２） 却报道了相反的结果，发现ｐＨ值从蒸煮大豆的６．４３降到６．０７－－６．１９。Ｌａｈ等人（１９８０）证明ｐＨ 值对大豆蛋白质的降解有很强的影响。许多报告是关于在天培发酵过程中总蛋白质含量变化的研究。Ｖａｎ Ｂｕｒｅｎ等人（１９７２）注意到总蛋白质含量有轻微的减少，从４３．２％减少到４１．６％（质量／干物质质量）。也有人报道，发酵 过程中总蛋自质有略微的增加，Ｎｏｗａｋ等人（１９９２）报道从４５．１％增加到４８．８％（质量／干物质质 量）：Ｖａｎ ｄｅｒＲｉｅｔ等人（１９８７）观察为４０．１％增加到４９．３％（质量／干物质质量）；还有Ｍｕｍｔａ等 人（１９６７）得出从４５．７％增加到５０．６％（质量／干物质质量），发现天培和蒸煮大豆的蛋白质含量 没有明显的差别，但发酵后天培的蛋白质消化率从蒸煮大豆的６０～６５％提高到９４％左右：发酵过 程中游离氨基酸的含量却增加了８５倍。，６．中国农业大学博士学位论文第一章绪论许多研究者研究了蛋白质在天培发酵过程中的降解。Ｎｏｕｔ等人（１９９０）认为天培发酵过程中 总蛋白质含量减少，但游离氨基酸的含量明显增加。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ等人（１９９６）对少孢根霉ＮＲＲＬ２７１０ 生产天培的发酵过程中干物质、灰分、蛋白质、游离氨、粗脂肪、游离脂肪酸、甘油的含量以及 蛋白酶和脂肪酶的活性进行了检测，在发酵早期即检测出了蛋白酶的酶活性和游离的氨基态氮。 Ｓｐａｍｎｇａ等人（１９９９）考察了少孢根霉ＮＲＲＬ２７１０生产天培发酵过程中蛋白质的利用情况，发酵 ４６ｈ，有２５％的蛋白被水解，其中６５％以氨基酸或多肽的形式存在于天培中，２５％形成了菌丝体， 另外１０％被氧化。Ｒｅｕ等人（１９９５）发现天培在一个旋转式喷鼓反应堆（ＲＤＲ）里发酵比长久以 来使用固定传统的发酵大豆蛋白质的水解程度增加，水溶性氮和三氯乙酸（ＴＣＡ）溶解的氮增加。 大豆豆球蛋白（Ｂ－Ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ）比大豆球蛋白（ｇｌｙｃｉｎｉｎ）被水解更迅速。 也有研究者报道纳豆发酵过程中的蛋白质变化。Ａｋｉｍｏｔｏ等人（１９９３）研究了在不同的接种 量和不同的发酵温度下，纳豆中可溶性蛋白质的含量和蛋白质的降解比例。Ｗｅｉ等人（２００１）研 究了利用不同的菌株发酵纳豆。不同的蒸煮时间，在发酵过程中氨基态氨的含量。Ｃｈｉｏｕ等人 （１９９９。２００１ａ）报道了昧噌在发酵过程中蛋白质的降解受盐和醇的抑制。 相对天培和纳豆的研究，对我国的豆豉在发酵过程中蛋白质变化的研究还处于刚起步阶段。 蔡位辉（１９９７）认为大豆的蒸煮条件（即大豆蛋白的变性程度）对豆豉的品质影响很大，得出在 ３０℃浸泡３．３ｈ或４０。Ｃ浸泡２ｈ后再在１２ｌ℃蒸煮３０～４０ｍｉｎ，所得蒸煮大豆的蛋白质变性程度最 好，为豆豉制作的最佳处理条件。杨军等人（１９９８）等对黑豆在不同浸泡温度下达到最佳含水量 的时间，不同蒸煮条件下蛋白质变性程度等进行了研究，认为最佳前处理条件为：４０＂Ｃ浸泡 １５０ｒａｉｎ，常压蒸煮１５０ｍｉｎ。张建华（２００３）报道了曲霉型豆豉在发酵的不同阶段的氨基酸的变 化。 从以上的研究中，我们可以发现，在大豆发酵过程中，微生物会产生蛋白酶，样品中ｐＨ会 发生变化，这种变化会影响蛋白质的变化。从蛋白质总量来看，有研究认为增加，有研究认为减 少。蛋白质的降解程度也受诸多方面的影响，例如：蛋白质的变性程度、接种量的大小、发酵条 件、盐和醇添加物的影响等。 豆豉在发酵过程中，在微生物产生的蛋白酶的作用下，蛋白质会发生降解作用，这种降解作 用直接受诸多因素的影响，比如，微生物产蛋白酶的活力和豆豉在后酵过程中添加物的影响，在 发酵过程中蛋白质降解程度直接影响到产品的营养价值。因此，有必要对豆豉发酵过程中蛋白质 的变化进行研究。１．３．３异黄酮方面的研究国外学者对大豆发酵制品中异黄酮的研究集中在以下几方面：（１）对加工过程中异黄酮的流 失，即异黄酮总量的变化；（２）异黄酮各异构体的转化；（３）影响上述两方面的原因。研究已经 证明大豆在发酵过程中大豆异黄酮的糖苷形式会向甙元形式转化，这种转化主要是在微生物产的Ｂ一葡萄糖苷酶的水解作用下进行，并且会受盐与醇的影响（Ｙｉｎｅｔａ１．，２００４：Ｃｈｉｏｕ＆Ｃｈｅｎｇ，２００１ｂ）。Ｇｙ６ｒｇｙ等人（１９６４）发现在天培的发酵过程中异黄酮的糖苷形式黄豆苷（ｄａｉｄｚｉｎ）和 染料木营（ｇｅｎｉｓｔｉｎ）转化成甙元形式黄豆甙元（ｄａｉｄｚｅｉｎ）和染料木黄酮（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）。Ｗａｎｇ等人 （１９９６）在天培的发酵过程中也发现黄豆甙元和染料木黄酮的含量增加，而其相应的糖苷形式黄中国农业大学博士学位论文第一章绪论豆苷和染料木苷的含量降低，异黄酮总量没有显著降低。Ｃｈｉｏｕ等人（２００１ｂ）发现味噌在发酵过 程中黄豆甙元和染料术黄酮的含量增加，而其相应的糖苷形式黄豆苷和染料木苷的含量降低，在 低盐发酵的味噌中含有更多的黄豆甙元和染料木黄酮。ｌｂｅ等人（２００１）在纳豆的加工中，试图 找出能产生高异黄酮甙元的菌株。张建华（２００３）研究表明，豆豉在发酵过程中异黄酮也由糖苷 形式向甙元形式转化。而许多的研究同时也表明异黄酮的甙元形式比糖苷具有更强的生理活性。 通过以上的研究，我们发现，发酵大豆制品中异黄酮含量的变化和几种异黄酮异构体的转化 及生成机理以及这种转化的主要影响因素是各国学者进一步研究重点。因此，有必要对曲霉型豆 豉发酵过程中异黄酮含量的变化咀及几种异黄酮异构体之间的转化，以及在豆豉后发酵过程中盐 对异黄酮转化和对Ｂ一葡萄糖苷酶活性的影响进行研究。１．３．４对产品感官品质方面的研究豆豉的加工过程不仅对其蛋白质、脂肪、糖类物质及其它功能性成分产生影响，同时对其感 官指标，比如：硬度、颜色和风味等也相应产生影响。Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等人（１９９３）报道了纳豆发酵 过程中，不同的接种量和不同的培养温度对纳豆的外观、硬度和颜色的影响。国内未见这方面的 报道。在纳豆的发酵过程中产生了复杂的生物化学变化，这种变化赋予纳豆独特的风味，国外的 学者也对这方面进行了深入的研究。Ｓｕｇａｗａｒａ等人（１９８５）对蒸煮０～３，３～５，５和５．５～８ｈ的大 豆所获得的风味分别作比较，得出：己醛（ｈｅｘａｎａｌ）、（Ｅ）一２一己醛（（Ｅ）一２－ｈｅｘｅｎａｌ）和己醇（ｈｅｘａｎ０１） 等对大豆的豆腥味有作用的成分在蒸煮过程中消失或减少。即使大豆煮了８ｈ并发酵成纳豆，戊 基呋哺（Ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎ）和１一辛烯一３一醇（１－ｏＣｔｅＢ．３。０１）的大豆豆味成分仍然存在。在纳豆的风味浓缩物里，呲嗪（ｐｙｒａｚｉｎｅ）和含硫化合物对纳豆盼风味特性有很重要的贡献。Ｋａｎｎｏ等人（１９８７）报道了纳豆在制作和储存过程中挥发性成分的改变。Ｔａｎａｋａ等人（１９９３）用ＧＣ―ＭＳ分析在纳豆 发酵室中的挥发性成分：共有１１种醇、５种醛、１３种酮、９种脂肪酸、４种吡嗪、１３种烃、５种 硫化物、３种呋喃、氨和吡咯（ｐｙｒｒ０１）。 Ｔａｎａｋａ等人（１９９８）确认了丙酮（ａｃｅｔｏｎｅ）和异丁酸甲酯（ｍｅａｌ ｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ）是纳豆的主要 风味成分。Ｌｅｅｊｅｅｒａｊｕｍｎｅａｎ等人（２００１）确认了乙偶姻（ａｃｅｔｏｉｎ）、２－甲基丁酸（２－ｍｅｔｈｌｙｂｕｔａｎｏｉｅ ａｃｉｄ）、吡嗪（ｐｙｒａｚｉｎｅｓ）、二甲基二硫化物（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ）、２－戊基呋喃（２一ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎ） 是纳豆的主要风味成分。 关于中国豆豉的风味研究，余爱农等人（２００２）用干馏法提取细菌型豆豉香气成分，气相色 谱法分离，质谱法鉴定结构并与计算机系统储存的己知物质的质谱进行比较，共鉴定出２７个挥 发性化台物。蔡位辉（１９９７）认为自制的曲霉型豆豉与市售豆豉风味基本～致，都含有苯乙醛和 呋喃甲醛。秦礼康等人（２００５）用同相微萃取的方法将传统陈窖豆豉粑和“老干妈”豆豉的风味 做了比较。豆豉因其特有的醇香、酯香和鲜味成为独具特色的调味品和家常菜肴。１９１５年，在巴 拿马万国商品博览会上，作为中国传统调味品的豆豉，以其独特的鲜香美味受到国际烹饪界的重 视，荣获了博览会金质奖。我国豆豉，特别是曲霉型和毛霉型豆豉的风味与日本的纳豆有很大的 不同。与国外的研究相比，作为中国豆豉主流产品并具明显美拉德（Ｍａｉｌｌａｒｄ）反应褐变特征的 霉菌型豆豉（如四川Ｉ永ＪＩｌ豆豉、广东阳江豆豉、湖南浏阳豆豉等），其香味成分研究却少见报道。中国农业大学博士学位论文第一章绪论我们对豆豉的风味研究还处于初级阶段，豆豉的特征风味化台物还不明确，风味物质的形成机理 更没有人进行研究。１．４豆豉研究的展望曲霉型豆豉的研究工作虽取得了～定的进展，但迄今为止国内的曲霉型豆豉的生产技术还十 分落后，许多工作还有待于进一步的进展。主要包括： １、进一步筛选菌株，并能产生良好豆豉的风味； ２、对菌株所产生的酶类的组成、性质及其活力差异对豆豉熟成和风味的影响； ３、豆豉中各营养成分及抗营养的因子在豆豉发酵过程中的动态变化： ４、豆豉速成低盐化工艺与风味和保存期之间的关系； ５、豆豉的功能性及其成分的研究； ６、豆豉风味的特征化合物及形成机理。 纳豆和天培与国内毛霉、曲霉型豆豉的加：［既有相同的地方，也有区别。纳豆和天培有很强 地方嗜好性，不适合大多数中国居民口味。同国外对纳豆和天培的研究相比．国内对豆豉的研究 落后了很多。国外的学者已经对味噌、纳豆和天培进行了深入的研究，因此我们可以借鉴它们的 研究方法，对我国的豆豉进行深入的研究：在继承曲霉型豆豉美味可口、营养丰富等优点的基础 上，对其生产工艺等进行工业化改造，提高产品的生理功能，寻求新的消费热点，扩大豆豉的消 费。～方面可让这一优秀的传统美食继续发扬光大，同时可以充分利用其功能性为全民造福：另 一方面通过研究成果的宣传，提高消费者对大豆食品的认识，从而拉动大豆消费，提高经济效益。１．５研究的内容和目标本论文的主要研究内容；１、豆豉加工过程外观、温度、硬度和颜色的变化（１）研究不同接种量对豆豉温度、硬度和颜色的影响： （２）后发酵过程中盐对豆豉硬度的影响。２、豆豉加工过程蛋白质的变化（Ｉ）研究不同接种量对蛋白质降解的影响； （２）后发酵过程中盐对蛋白质的影响。 ３、豆豉加工过程异黄酮的变化 （１）研究豆豉在发酵过程中的总异黄酮和９种糖苷型大豆异黄酮和３种甙元型大豆异黄酮的各 自含量与转化： （２）研究发酵过程中１３一葡萄糖苷酶的活性，分析Ｂ一葡萄糖苷酶的活性与异黄酮构型转化的关 系和后发酵过程中盐对其影响。 ４、豆豉挥发性风味物质的研究 （１）检测不同类型的豆豉（曲霉型和毛霉型）的风味物质； （２）检测曲霉型豆豉在发酵过程中的风味物质的形成；中国农业大学博士学位论文第一章绪论（３）分析豆豉在发酵过程中主要风味物质的形成机理及其影响因素。 本论文通过对豆豉的生产过程中感官指标（硬度、颜色和风昧）、营养成分（蛋白质和异黄 酮）等方面的研究，达到加速豆豉工业化的实现，提高豆豉的生产水平，稳定产品品质。提高豆 豉的生理活性等目的。．１０，中国农业大学博士学位论文第二章豆驶加工过程中质构特性和感官指标的变化第二章２．１前言豆豉加工过程中质构特性和感官指标的变化豆豉是中国传统的大豆发酵制品之一。按发酵的主要微生物不同可将其分为毛霉型、曲霉型、 细菌型和根霉型。张建华（２００３）从传统的曲霉发酵型的豆豉中分离出主要的曲霉菌种，并对豆 豉的功能性进行探索。蔡位辉（１９９７）对曲霉型豆豉的发酵工艺进行了改进。自１９９７年以来， 西南农业大学食品学院展开了对毛霉型豆豉的研究，先后对毛霉型豆豉的生产菌，豆豉发酵过程 的生化变化，生产工艺条件及毛霉型豆豉的营养功能特性等进行了研究（石轶松，１９９８；陈留记， １９９９；杜木英，１９９９）。对细菌型和根霉型的豆豉的研究主要集中在对日本的纳豆和东南亚天培。 Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等人（１９９３）报道了纳豆发酵过程中，不同的接种量和不同的培养温度对纳豆的外观、 硬度和颜色的影响。Ｗｅｉ等人（２００Ｉ）报道了不同的蒸煮条件对纳豆的颜色和硬度的影响。对我 国曲霉型豆豉在发酵过程的感官品质（表观、硬度和颜色）的研究还很欠缺。 豆豉作为我国传统的大豆发酵制品，在人们的饮食中起到非常重要的作用。大豆通过发酵之 后制作成豆豉，应具有良好的外观、柔软的质地和诱人的风味。本文通过对曲霉型豆豉的实验研 究，探讨不同工艺条件下豆豉发酵过程中外观的变化，测定豆豉在前发酵的品温、豆豉在发酵过 程中硬度和颜色的变化以及后发酵过程中盐对豆豉硬度和颜色的影响。２．２材料与方法２．２．１试验材料黑豆购于吉林农科院；菌种米曲霉ＡＳ３．９５１购于中科院微生物所。２．２．２实验仪器表２，１实验仪器及设备Ｔａｂｌｅ ２．１ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ中国农业大学博：Ｉ：学位论文第二章豆豉加工过程中质构特性和感官指标的变化２．２．３试验方法２．２．３．１豆豉试样的制备浸泡生大豆（黑豆）―――‘＝一，浸泡后大豆预处理水蒸煮 米曲霉ＡＳ３９５赶 前发酵一一豆 曲黼豆筹黼撇后发酵盐一 一 ●Ｉｊ膨，―１啜 ‘、●＾ｌ．Ｉｆ０广ｊ、●＞ｔｏ图２ １豆豉的制作过程Ｆｉｇ．２．１ Ｆｌｏｗ ｄｉａｇｒａｍ ｆｏｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎｓ Ｄｏｕｃｈｉ按图２．１进行。取】０００９大豆清洗后，在３３００ｍＬ的蒸馏水中浸泡７ｈ，水温：２４０Ｃ士２。Ｃ：沥 干水后在高压釜中１２１℃下蒸煮３０ｍｉｎ：蒸煮后的大豆冷却至３０～３５０Ｃ，用米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ．ＡＳ３．９５１）孢子悬浮液进行接种，接种量分别为１０６ｃｆｕ／ｇ湿豆（１０％ｆｕ／ｇ）平ｕ １０％ｆｉｇｇ湿 豆（１０４ｃｆｕ／ｇ）。接种后的大豆２０００９平均分装到ｌｏ个竹笼屉（尺寸：ｍ１０．８ｅｒａｘ３．８ｃｍ），上面 用棉纱布盖上；放在３０。Ｃ的培养箱中进行前发酵，培养箱中相对湿度为８０９社２％，６０ｈ后得到豆 豉曲。分别取２００９的豆豉曲加入不同量的盐，使样品最终盐的浓度为５％，７．５％，１０％和１２．５％ （ｗ：ｗ），放入３５。Ｃ培养箱中发酵一个月。取浸泡后和蒸煮后的大豆样品，在前发酵的１２小 时（１２ｈ）、２４小时（２４ｈ）、３６小时（３６ｈ）、４８小时（４８ｈ）、６０小时（６０ｈ）和后发酵的ｌ周（１ｗ）、 ２周（２ｗ）、３周（３ｗ）和４周（４ｗ）取样，作为以下实验的样品。 ２．２．３．２豆豉前发酵过程中的外观观察 在前发酵过程中分别在１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０ｈ和后发酵的２ｗ、４ｗ取样，对豆豉样品进 行外观观察和气味评价。 ２．２．３．３豆豉制曲过程中品温的测定 用带有温度传感器的数显温度计直接插入豆豉的内部，在前发酵的１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０ｈ， 分别读出品温。．１２．２．２．３．４豆豉硬度的测定（ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＮａｔｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０）在前发酵过程中分别在时间１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、 ４８ｈ、６０ｈ和后发酵的】ｗ、２ｗ和３ｗ取样。每种试 样取３０粒完整的豆豉，用流变仪测豆豉的硬度。 一粒豆豉的硬度值取两个峰值的平均值表示，发 酵不同阶段的硬度值取３０粒豆豉硬度值的平均值 表示。采用齿型探头（如图２．２所示）；载物台速 度：ｐ＝６０ｍｍ／ｍｌｎ；量程：２０００９；记录仪的纸速： ｖ＝１００ｍｍ／ｍｉｎ。豆豉破断时受到的最大力为Ｆ（ｇ） 定义为豆豉的硬度。 ２．２．３．５豆豉颜色的测定 豆豉破碎研磨后在研钵里压平，放上盖玻片，直接用色差计测定其颜色。由色差计读出Ｌ、 ａ、ｂ值，测定三次取其平均值。囱２ ２探头装置示惹国Ｆｉｇ．２．２Ｔｈｅ ｓｋｅｔｃｈ ｍａｐ ｏｆｔｈｅ ｐｒｏｂｅ２．３试验结果与讨论２．３．１豆豉发酵过程中的外观评价与气味发酵过程中，对样品的外观与气味评价如表２．２。表２ ２豆豉在发酵过程中的表观和风昧评价Ｔａｂｌｅ ２，２ Ｔｈｅ ａｐｐｅａｒａｎｃｅｓ ａｎｄ ｆｌａｖｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇＤＱｕｅｈｉ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ中国农业大学博士学位论文第二章豆豉加工过程中赝构特性和感官指标的变化２．３．２豆豉制曲过程中品温变化４８ ４４ ４０口３６ Ｖ嚣３２２８ ２４ ２０ ０ １２ ２４ ３６ ４８ ６０前发酵时问（ｈ）图２ ３不同接种量对豆豉前发酵过程中的品温影响Ｆｉｇ ２．３ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｄｕｕｃｈｉ’ｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｅ?ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ豆豉在前发酵过程中温度变化如图２．３，它直接影响到产品的最终质量。接种量为１０６ｅｆｕ／ｇ 比｜０４ｃｆｕ／ｇ温度升高的快且高，在发酵的前３６ｈ内温度升高很快，在３６ｈ品温均达到最高值。说 明此时豆豉生产菌活动剧烈，代谢速度加快。温度升高是因为孢子发芽，菌丝生长，需要大量能 量，使得菌体代谢加大。在３６ｈ之后，品温略有降低，井维持在３５～４０‘Ｃ。温度过高（超过４０＊０） 的时间长，会影响米曲霉的生长，就需要进行翻曲的处理，最适宜的温度是保持在３７。Ｃ左右。２．３．３豆豉的硬度变化图２．４为豆豉在前发酵阶段的硬度变化。接种量为１０６ｃｆｔｌ／ｇ和１０４ｃｆｕ／ｇ有相同的变化趋势。 从开始发酵到３６ｈ，硬度略有降低；３６～６０ｈ硬度上升，主要是由于在这阶段曲霉菌膜的形成， 影响大豆硬度的测定。同时豆豉在发酵过程中由于水分的丧失，也影响硬度。前发酵６０ｈ后的硬 度跟浸泡后的硬度（数据未列出）相当。 图２．５是不同接种量和盐的添加量对豆豉后发酵过程的硬度变化。接种量为１０４ｃｆｕ／ｇ样品与 接种量为１０６ｃｆｕ／ｇ样品在后发酵的过程中硬度变化趋势相同，即随着发酵时间的延陡，豆豉的硬 度降低或基本保持不变。进入后发酵，在同一接种量和同一盐浓度下，豆豉硬度在６０ｈ到第一周 这段时间硬度下降较快，且盐浓度越低，硬度降低的速率越大；到第二周和第三周，硬度基本保持不变或略有下降。在同一发酵时间，同一接种量下，不同盐浓度豆豉之间的硬度也存在着差异，盐浓度越低，豆豉的硬度越低。另外，不同的接种量也显著影响后发酵豆豉的硬度。从图２．５可 知，在同一发酵时间，同一盐浓度＇Ｆ，接种量越大，豆豉的硬度越低。硬度降低主要是由于在笈 酵过程中由于微生物产生的复杂的酶系，将大豆中的蛋白质、脂肪和糖类等大分子降解成氨基酸、 脂肪酸和还原糖等小分子的结果。高盐能抑制酶的活性，使分解作用降低，导致硬度相对大些。接种量大，产生的酶系相对较多，大分子量物质分解得相对较彻底。．１４．中国农业大学博士学位论文第二章豆豉加工过程中质构特性和感官指标的变化：：１０＃ｃｆｕｌｇ印Ｏ５００―４００ｉ姗裂２００１００ ０ １２ ２４ ３６ ４８ ６０前投酵时问（ｈ）固２ ４不同的接种量对豆豉前发酵过程中的硬度影响Ｆｉｇ ２．４Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｄｏｕｅｈｉ’ｓ ｈａｒｄｎｅｓｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｅ?ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ “ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ田一ｓ。【．．．．．．、．Ｊ４００ ３５０ ３０。？２５０ 蜊２００ 剧１５０１００ ５０ ０后发酵时闾（ｗ）田４５０Ｌ――－Ｊ，２５０ 型２００ 掣Ｊ５０４００ ３５０ ３００１。。 ５０ ０后发酵时间（ｗ固２．５不同接种量和盐浓度对豆豉后发酵过程的硬度影响 Ａ：接种量为ｉＯ＇ｃｆｕ／ｇ：８：接种量为１０七ｆｕ／ｇ。Ｆｉｇ ２．５Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｄｏｕｃｈｉ’ｓ ｈａｒｄｎｅｓｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｄｏｓｔ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｔ ｄｉｆｉｅｒｅｎｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓａｌｔ ｌｅｖｅｌｓＡ：ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓｉｚｅ １０４ｃｆｕ／ｇ；Ｂ：ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｚｅ １０６ｃｆｕ／ｇ．．１ ５．中国农业大学博士学位论文箱二章豆豉加工过程中质构特性和感官指标的变化２．３．４豆豉的颜色变化田薯一崾世 鼎糕 嘣黼蚕 主要 尊重主毒三喜豆豉加工的不同阶段５ ４ ３ ２ １ ０ ．１ ．２齐？≥；‘虿。曾。謇尊豆豉加工的不同阶段曰１２ Ｊ０ ８ ６ ４ ２ ０一岖ｕ望 鼎糕 啷摧主专熏孽毫三意宣喜豆豉加工的不同阶段圈２ ６不同接种量在豆豉加工过程中的颜色变化 Ａ：Ｌ值；Ｂ：ａ值；Ｃ：ｂ值。Ｆｉｇ ２．６ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｄｏｕｃｈｉ’Ｓ ＣＯｌＯｒ ｔｏｆｌｅ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇａｔｄｉｆｉｅｒｅｎｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓＡ：Ｌ ｖａｌｕｅ；Ｂ：ａ ｖａｌｕｅ；Ｃ：ｂ ｖａｌｕｅ．一１６．中国农业大学博士学位论文第二章豆豉加工过程中质构特性和感官指标的变化图２．６是豆豉在发酵过程中的颜色变化。在前发酵期间，Ｌ值总体上是显著降低的，也就是 说随着发酵的进行，豆豉的颜色不断变暗，在前发酵１２ｈ和２４ｈ接种量为】０％ｆｕ／ｇ比１０６ｃｆｕ／ｇ的 Ｌ值略大；ａ值的总体趋势是上升，即由红向绿的方向变化，在后发酵过程中接种量为１０６ｃｆｕ／ｇ 比１０４ｃｆｕ／ｇ的ａ值明显增大；而ｂ值在整个前发酵阶段的变化呈无明显规律。在后发酵第一周， Ｌ值降低显著，ｂ值上升；在第二、三、四周，Ｌ、ａ、ｂ值变化均不显著。同时在后发酵过程中 不同盐的添加量对豆豉的Ｌ、ａ，ｂ值变化均不显著，数据末列出。这说明不同盐的添加量没有显 著影响豆豉的色泽。 豆豉在发酵过程中颜色会变暗，变黑。在前发酵过程中由于曲霉的不断生长，豆豉的颜色测 定，受曲霉的颜色影响较大：而在后发酵过程中，豆豉的颜色显著变黑，这主要是由于发生了美 拉德反应的结果：由于微生物产生的酶的降解作用，蛋白质降解成氨基酸，糖类降解成单糖，两 者发生了美拉德反应产生了类黑精素的结果（陈留记，１９９９）。另一方面，也与黑色素形成有关， 黑色素通常是氨基酸（酪氨酸）经一系列氧化反应形成的。在天培产品加工中氧气的浓度与天培 产品的色泽加深有很大的影响（Ｎｏｕｔｅｒａｌ，１９９０）。另外，黑色素被认为是酱油中的重要的抗氧化的物质（Ｍｏｏｎ，２００２）。因此，应该对豆豉加工过程中美拉德反应以及黑色素的形成作更深入 的研究。２．４本章小结通过曲霉型豆豉制作试验，探讨了加工工艺中各条件对制品的硬度、颜色的影响。观察豆豉 发酵过程中的外观，测定豆豉在前发酵过程中的品温、豆豉在发酵过程中硬度和颜色的变化，以 及后发酵过程中不同盐的添加量对豆豉的硬度和颜色的影响。得出以下主要结果： １、豆豉在前发酵过程中，品温会上升，温度的高低与接种量有一定的关系。 ２、同一盐浓度的豆豉随着后发酵时间的延长，硬度降低显著：豆豉的硬度在后发酵阶段受 盐浓度的影响，在同～发酵时间盐浓度越低，豆豉的硬度越低。 ３、豆豉的颜色随着发酵时间的延长，变暗、变黑。第三章豆豉加工过程中理化?｝生质的变化３．１前言豆豉生产包括原料处理、制曲和后发酵三大过程。其中原料处理工序包括浸泡、蒸煮， 其目的是给微生物生长提供一个有利的环境：制曲工序主要是依靠微生物产生降解大分子 物质所需要的各种酶，如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等；而后发酵则是依靠微生物和酶的作 用将大分子物质分解为小分子．如游离氨基酸、有机酸和醇类等。这些酶相应水解大豆的 备种成分，使产品产生相应的组织结构、风味和芳香。同时，这些酶的水解还可以减少或 者消除抗营养因子．提高产品的营养品质。蛋白质在原料大豆中大约占有４０％。所有的酶 类中蛋白酶起着举足轻重的作用，蛋白质经酶解转化为可溶性蛋白质、多肽及氨基酸后， 消化率及生物价均有所提高。豆致在发酵过程中，在微生物产生蛋白酶的作用下，蛋白质 会发生降解作用，这种降解作用直接受诸多因素的影响，比如，微生物产蛋白酶的活力， 豆豉在后发酵过程中添加物对酶的影响等；在发酵过程中蛋白质的降解程度直接影响到产 品的营养价值和风味。因此，有必要研究不同加工工艺，不同盐浓度对曲霉型豆豉蛋白质 的影响。 本章研究了豆豉发酵过程中水分、ＤＨ值、可溶性蛋白质、总蛋白质、氨基态氮以及总 酸的变化，并与现在国内市场上主要的四种曲霉型豆豉进行比较，达到研发检测豆豉营养 功能和各项指标的目的，从而将其优化并推向市场。３．２材料和方法３．２．１试验材料甲醇、甲醛、乙酸、乙醇、硫酸铜、硫酸钾、石油醚、丙三醇、浓硫酸、氢氧化钠、 甲基红、溴甲酚氯、３，５一二硝基水杨酸、硼酸、三氯乙酸（ＴＣＡ）、四水合酒石酸钾钠、 酚酞、醋酸、亚硫酸氢钠、氯化钠、氨基乙酸。 以上均为分析纯，厂家为北京化工厂、北京化学试剂公司、北京益利精细化学品公司、 北京旭东化工厂、北京双环化学试剂厂、中国医药（集团）上海化学试剂公司。 所有电泳试剂见本章附表。３．２．２实验仪器表３ １实验仪器Ｔａｂｌｅ ３．１ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ中国农业大学博士学位论文第三章豆豉加工过程中理化性质的变化３．２．３试验方法３．２．３．１豆豉的制备 如２．２．３．１豆豉制备方法。取原料、浸泡和蒸煮的样品，在前发酵过程中分别在时间１２ｈ、 ２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０ｈ和后发酵的１ｗ、２ｗ、３ｗ取样。将样品进行真空冷冻干燥。样品粉碎 后放入－２０＊（２的冰箱中贮存备用。购买商品豆豉：“太平桥”、“天马山”、“开渭口”和 “阳江桥”，经真空冷冻干燥后，粉碎备用。 ３．２．３．２水分含量的测定 取原料、浸泡和蒸煮的样品，前发酵６０ｈ和后发酵３ｗ的新鲜样品各２．０９左右。水分 含量的测定采用常压恒重法，参照ＧＢｆｒｌ４７６９．９３。试验重复三次，数值以平均值表示。３．２．３．３ｐＨ值的测定取原料、浸泡和蒸煮的样品，前发酵１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０ｈ和后发酵１ｗ、２ｗ、 ３ｗ的新鲜样品各２．ｏｇ左右，碾磨后加入蒸馏水５ＤｍＬ定容，搅拌均匀，静置后测定悬 浮液的ｐＨ值。试验重复三次，数值以平均值表示。 ３．２．３．４可溶性蛋白质的测定 （ｔ）总蛋白质含量的测定 用微量凯氏定氮法测定。具体操作参照ＧＢ／Ｔ１４７７ｌ一９３。试验重复三次，数值以平均 值表示。 （２）可溶性蛋白质的测定 称取Ｏ．４９样品溶于４ｍＬ的Ｏ．３ｍｏｌ／Ｌ的三氯乙酸（ＴＣＡ）中，均质机中均质３０ｓ后， 室温下放置２ｈ，期间在旋涡震荡器中不停震荡，之后在８５００。ｇ下离心２０ｒａｉｎ。取上清液 备用。用微量凯氏定氮法测定。具体操作参照ＧＢ／Ｔ１４７７１―９３。试验重复三次，数值以平 均值表示。 ３．２．３．５总酸的测定中国农业大学博士学位论文第三章豆豉加工过程中理化性质的变化ＮａＯＨ滴定法：准确称取冷冻干燥后样品２．５９于１００ｍＬ烧杯中，充分溶解后，定容到 １００ｍＬ；吸取２０ｍＬ的上清液，置于２００ｍＬ烧杯中，加蒸馏水６０ｍＬ，开动磁力搅拌器， 用Ｏ ０５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液滴定至ｐＨ值８．２时停止。此时即为总酸的滴定终点，记下此时消耗碱液体积，同时做空白试验。试验重复三次，数值以平均值表示。３．２．３．６氨基态氯的测定 甲醛法：在３．２．３．５的基础上，加入１０ｍＬ甲醛，再用０．０５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液滴定到 ｐＨ值９．２时停止。记下此时消耗碱液体积，同时做空白试验。试验重复三次，数值以平均 值表示。 ３．２．３．７蛋白质分子量的测定 凝胶板为：１００ｒａｍ×１２０ｍｍ×Ｏ．１ｍｍ。分离胶和浓缩胶的制备如表３．２所示。表３２ＳＤＳ―ＰＡＧＥ不连续电泳浓缩胶和分离胶的配方Ｔａｂｌｅ ３．２Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｇｅｌ ａｎｄ ｓｔａｃｋｉｎｇｇｅｌ ｏｆｔｈｅ ＳＤＳ―ＰＡＧＥ称取接种量为１０６ｃｆｕ／ｇ样品的粉末Ｉ．０９左右，溶解于Ｏ．１ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．５） 中，使其中的蛋白质浓度为ｏ．２～０．４％，与样品缓冲液（１％ＳＤＳ／１％［３，巯基乙醇／５０ｒａＭ缓冲 液／２０％甘油）１：１混合，在沸水中加热４ｍｉｎ，然后加入１０ｐ＿Ｌ的Ｏ．０２％ＢＰＢ。取５ｎＬ样品 溶液注入浓缩胶的梳腔中，开始电泳。电泳槽中的缓冲液为：ｏ．０２５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ／０ １９２ｍｏｌ／Ｌ甘氨酸／０．Ｉ％ＳＤＳ（ｐＨ８．３）。电泳条件：恒流１６ｍＡ。电泳结束后，固定４５ｒａｉｎ，固定液浓度为：５０％甲醇／５％醋酸。然后用２．５％考马氏亮蓝染色４５ｒａｉｎ。最后用５％甲醇／７１５％醋酸的脱色液脱色。３．３试验结果与讨论３．３．１豆豉加工过程中ｐＨ值的变化豆豉前发酵过程ｐＨ值的变化如图３ ｌ所示。前发酵制曲过程中产品的ｐＨ值在３６ｈ以前基本不变；３６ｈ到６０ｈ显著上升，且接种量大（１０６ｃｆｕ／ｇ湿豆）比接种量小（１０％ｆｕ／ｇ湿豆）的ｐＨ值高。１０６ｃｆｕ／ｇ湿豆接种量的成曲的ｐＨ值在８．５左右，１０４ｃｆｕ／ｇ湿豆接种量在 ７．５左右。前发酵的这一变化与天培生产过程中相似（Ｓｔｅｌｎｋｒａｕｓｅｔａ１．，１９６０），他们发现天培发酵后，ｐＨ值从蒸煮大豆的ｐＨ５ ０增加到ｐＨ７．０以上。Ｗｅｉ等人（２００１年）在纳豆的 发酵过程中也发现ｐＨ值上升。．２０．ｌ一一一／１譬“一．。彩＜／．．＿．［０４ｃｍ／ｇ一１ ｏ。ｃ如，ｇ”鲫＂加酊印＂如¨０ ２ ２４３６４８６０前发酵时闸（ｈ）图３ １不同的接种量对豆豉前发酵过程中ｐＨ值的影响Ｆｉｇ．３．Ｉ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐＨ ｄｕ ｒｊｎｇ Ｄｏｕｃｂｉ ｐｒｅ－ｆｃｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ田８．５ ｇ．０ ７．５ ７．０吾６．５６，０ ５．５ ５．０ ４５ ０圈８．５ ８．０ ７．５ ７．０翟６ ５６．０ ５．５ ５．０ ４５宴。≥：后发酵时间（ｗ）ｎ５ｌ ｌｎ５ｌｌ ５２２５３、盖：≥≤ｉｏ５２２５３后发酵时同（ｗ）图３ ２不同的接种量和盐浓度对豆豉后发酵过程中州值的影响 Ａ：接种量为１０‘ｃｆｕ／ｇ；Ｂ：接种量为１０。ｃｆｕ／ｇ。Ｆｉ９３．２ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｄｏｕｃｈｉ’ｓ ｐＨ ｄｕｒｉｎｇ ｐｏｓｔ－ｆｅｒｍｅｎｔａｔｌｏｎ 丑ｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓａｌｔ ｌｅｖｅｌｓ Ａ：ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｚｅ Ｉｏ＇ｃｆｕ／ｇ；Ｂ：ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｚｅ ．２１．１０６ｃｆｕ旭．鼍！量Ｉ中国农业大学博士学位论文Ｉ １１第三章豆豉自ｎｚｒ．过程中理化性质的变化．！！！！！ｓ！！！！Ｅ曼！！！！！！！舅豆豉后发酵过程ｐＨ值的变化如图３．２所示。随着发酵时间的延长，ｐＨ值显著下降； 在同一发酵时间，接种量大．ｐＨ值大；在同一发酵时间，同一接种量下，盐浓度越高，ｐＨ 值越高；１０６ｃＡｇｇ湿豆接种量豆豉的ｐＨ值均在６．５～７，０之间，１０４ｃｆｕ／ｇ湿豆接种量在５．ｏ～ ６．０之间。Ｃｈｉｏｕ（１９９９）报道，在味ｎ目的后发酵过程中盐浓度越高，口Ｈ值越高，这与我们 的结果一致。３．３．２豆豉加工过程中可溶性蛋白质的变化豆豉前发酵过程可溶性蛋白质变化如图３，３所示。前发酵制曲过程中产品的可溶性蛋 白质在３６ｈ以前基本不变｛３６ｈ到６０ｈ显著上升，且接种量大（１０６ｃｆｕ／ｇ湿豆）比接种量小 （１０４ｃｆｕ／ｇ湿豆）的可溶性蛋白质高。Ｒｅｕ等人（１９９５）发现天培在发酵过程中可溶性蛋白 质含量也上升。可溶性蛋白质的变化与ｐＨ值的变化显著正相关。Ｌａｈ等（１９８０）认为ｐＨ 值的变化对大豆蛋白的降解有很强的影响。发酵３６ｈ以后，微生物大量生长，产生了蛋白 酶，促使蛋白质分解，从而可溶性蛋白质显著升高。０…?…１０４ｃｆｕ／ｇ８。誉 叫 删 如 皿 嘲 趟 缝 睦６１０６ｅｆｕ／ｇ―夕／４２ｒ，．．，，∥…………“ ｐｐ＿２４ ３６ ４８ ６０／Ｏ ０ ２前发酵时问（ｈ）图３ ３不同接种量对豆豉前发酵过程可溶性蛋白影响Ｆｉｇ．３．３ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｄｏｕｅｈｉ ｐｒｅ―ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ豆豉后发酵过程可溶性蛋白质变化如圈３，４所示。随着发酵时间的延长，可溶性蛋白 质含量继续上升；在同一发酵时间，同一含盐量，１０６ｃｆｕ／ｇ接种量的可溶性蛋自质含量比 １０４ｃｆｕ／ｇ的高；在同一发酵时间，同一接种量下，盐浓度越高，可溶性蛋白质含量越低。后 发酵３周后，１０４ｃｆｕ／ｇ接种量的可溶性蛋白质含量在１０．３～１６．３％；１０６ｃｆｕ／ｇ接种量的可溶 性蛋白质含量在ｉ５．２～２０．ｏ％。后发酵的上升速度明显高于前发酵。Ｃｈｉｏｕ等人（２００１ａ） 报道，在昧噌的后发酵过程中盐浓度越高，可溶性蛋白质含量越低。他们认为蛋白质的降 解是在微生物产生的蛋白酶的作用下进行，盐通过抑制蛋白酶的活力，从而抑制蛋白质的 降解。．２２－田基 Ｖ嘲 缸 皿 蜘 篁 媲 甘后发酵时问（ｗ）田加 Ｉ．．Ｊ＾１６删１２ 醐８划．荔∥０ ＯＳｌ。多乒二≥ ．纩Ｉ三≥／一５％一Ｚ５％Ｉ妊时４―ｂ１０％―一１２５％一５ ２ ３Ｏ２ ５后发酵时问（ｗ）图３ ４不同接种量和盐浓度对豆豉后发酵过程可溶性蛋白影响 Ａ：接种量为１０‘ｏｆｕ／ｇ；Ｂ：接种量为ｌＯｔｆｕ／ｇ。Ｆｉｇ ３．４ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｄｏｕｃｈｉ’Ｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｐｅｓｔ－ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｆ ｄｉｆｉｅｒｅｎｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓａｌｔ ｌｅｖｅｌｓ Ａ：ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｚｅ １０４ｃｆｕ／ｇ；Ｂ：ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｚｅ １０６ｃｆｕ／ｇ．３．３．３豆豉加工过程中氨基态氨的变化豆豉发酵过程氨基氮含量的变化见图３．５和图３．６。从总体上，随着前发酵时间的延长， 两种接种量豆豉曲氨基氮的含量均呈上升趋势。在同一发酵时期，接种量大（１０６ｃｆｕ／ｇ湿豆） 比接种量小（１０４ｃ向惶湿豆）的氨基氮含量高（除３６ｈ）。４８ｈ和６０ｈ的氨基氮含量基本相当。接种量为１０４ｃｆｕ／ｇ湿豆的豆豉曲在发酵的前；ｃ［ｊ，氨基氮含量没有增加，到３６ｈ后，显著上升。接种量为１０６ｃｆｕ／ｇ湿豆的豆豉曲．在３６ｈ有一明显的下降趋势。这很难用一般的发酵理论米解释。在这一点的试验误差比较大，可能是试验的误著造成的。Ｗｅｉ等人（２００１年）在纳豆的发酵过程中氨基氮含量也显著上升。Ｓｔｅｉｎｋｒａｕｓ等人（１９６０）研究天培在发酵 后期可检测出游离氨。．２３－誉、，蛔拓 窖 城 箱 鹕 孵…．圈３ 叭ｓ５不同接种量对豆豉前发酵过程氯基氯的影响ｃｂ。ｎｇｅｓｊ。，。，ｍ㈣椭鳓ｄｕｒｉｎｇ Ｄｏｕｃｂｉ Ｐ…ｒｅ－ｆ４ｅ…ｒｍ”ｅｎ‰后发酵时舸（ｗ）后发酵时间（ｗ）固。６不同接种量和盐浓度对豆豉后发酵过程氨基氨影响 Ａ：接种量为Ｏ｜ｃｆｕ／ｇｉ＆接种量为ｌＯ?ｃｆｕ／ｇ。Ｆｊｇ ３ｔ６ ｃｈ８ｎｇｅｓｉｎ。。ｕｃｈｉ’ｓ自）ｒｍａＩ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｕｒｉｎｇ ｐ。ｓｔ．ｔ｝ｒｍｅｎｔａｔｉ。ｈＡ＝ｉＩｌ０ｃｕｌ８ｔｉｏＪ，ｓｊｚｅｌ０４ｃｆｕ／ｇ；Ｂ：ｉｎｏｃｕｌａｔ…ｚｅ １嘛如，ｇ．中国农业大学博士学位论文Ｉ第三章豆豉加工过程中理化性质的变化随着后发酵时间的延长，氨基氮含量继续上升：在同～发酵时间，同一盐浓度，接种 量越大，氨基氮含量越高；在同一发酵时间，同一接种量下，盐浓度越高．氨基氮含量越 低。这种变化趋势与可溶性蛋白质含量的变化趋势相同。后发酵３周后，１０４ｃｆｕ／ｇ接种量氨 基氮含量在ｏ．９０８～１．７１８％：１０６Ｐｆｕ／ｇ接种量氨基氮含量在１ ２９４～２．１７３％。 图中结果还可看出，相对于成品的氨基氮含量水平，曲中氨基氢含量都不太高，说明 蛋白质水解尽管在制曲过程中己发生，但主要是在后发酵过程中进行。在前发酵阶段，接 种量越多，孢子发芽后产生苗体越多，从而菌体的新陈代谢非常活跃，产生酶类也越多， 蛋白质水解程度也越大，因而氨基态氮的含量会增加．不利之处是：这会使产品带有一股 氢臭味，影响消费者的购买欲。３．３．４豆豉加工过程中总酸的变化豆豉发酵过程总酸的变化见图３，７和图３．８。在前发酵阶段，西种接种量的豆豉曲的总酸含量均是前升后降。接种量为１０６ｃ眦湿豆的豆豉曲，在２４ｈ总酸含量达到最大（１，５０３％）：接种量为１０４ｃｆｕ／ｇ湿豆的豆豉曲。在４８ｈ总酸含量达到最大（１．５４８％）。随着后发酵时间 的延长，总酸含量上升，接种量为ｌＯ％ｆｕ／ｇ，含盐量为７ ５％的样品除外，可能是因试验误 差造成；在同一发酵时间，同一含盐量，接种量大，总酸含量低；这恰与氨基氨和可溶性蛋白质的变化相反。在同一发酵时间，同一接种量下，盐浓度越高，总酸含量越低。后发 酵３周后，１０４ｃｆｕ／ｇ接种量总酸含量在２．４５５，－４．２７７％；１０６ｃｆｕ／ｇ接种量总酸含量在１．３８４～２ ０３４％。微生物在前发酵时期分泌大量的酶，包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。这些酶会在后发 酵阶段，使大豆中的蛋白质、碳水化合物和脂肪分解成氨基酸、有机酸或脂肪酸，从而使 总酸含量增加。基 一一―≠÷÷÷入ｔ，一?一一．．寝 碉／．?’＼－，．‘‘｜ ‘―一Ｉ＾１Ｉｌ旭一他¨ 他∞咐％¨蛇帅０ １２ ２４ ３６ ４８ ６０…●．１０ｄｃｆｕ／ｇ＼ Ｊ前发酵时间（ｈ）囤３ ７不同接种量对豆豉前发酵过程中总酸的影响Ｆｉｇ．３．７ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｏｔａｌ ａｃｉｄ ｄｕｒｉｎｇ Ｄｏｕｃｈｉ ｐｒｅ―ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｔ ｄｉｆｉｅｒｅｎｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ．２５．００．５Ｉ１．５２２．５３后发酵时问（ｗ）圈ｓＯ４０奎３０ 薹２０ｌ０ｎ０ ０ ０３ｌ １．５ ２２，５３后发酵时间＜ｗ） 图３ ８不同接种量和盐浓度对豆敢后发酵过程总酸影响＾：接种量为１０４ｃｆｕ／ｇ：Ｂ：接种量为ＩＯ＊。ｆｕ／鼬Ｆｉｇ ３，８ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｄｏｕｃｈｉ’ｓ ｔｏｔａｌ ａｃｉｄ ｄｕｒｉｎｇ ｐｏｓｔ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉＯｎ ａｔ ｄｉｆｆｅＨｎｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓａｌｔ ｆｅｖｅｌｓ Ａ：ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｚｅ １０‘ｃｆｎ／ｇ；Ｂ：ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｚｅ１０６ｃｆｕ垃．３．３．５豆豉加工过程中蛋白质的降解最３ ３豆豉加工过程中各成分的变化水分 古量【％）ｐＨ氨基司溶 氨的性蛋 含量 白质总蚕哥丽丽■Ｆ―磊’ｆ莱―’■靠■白质（％）白质占总 蛋白质的氮占总 氨比例（％）浸泡后５４ ２６ ５５ ２９，６．６６ ６．８８０．２３ ０．０７５．６０ ４．７９ ３，６２ ８ ３５３９ ８２ ３５ ７８１４．０７ １３ ３９３ ５４ １１９０９ｌ ０．５５＋警警曼。～～：萝攀甓（棼静霉１９４ｊ“哆，塑ｊ）４８．１８ 尊堡譬‘譬种量１０６ｃｆｕ／ｇ，６０ｈ）４８ ４４７ｍ∽ｌ８ ４７ ｏ．４２４ｉ≥７７、）名７一”一”４，矗。ｊ ｉｏｉ一． ４４ ００ １８ ９８’“”；ｏｉ”ｉ．６６一：霎鬣，‘攮种世Ⅶ４哆；含。ｏｏｏｓａ，㈣Ｈ：，３１６￣７ｌ”４１７ ６９――――――――――――――――――――――――――――――一一．２６．后发１０酵％）借种量１０魄’肯４２９５３６４７５’２。巍“ｔ：，蠢；．≯。 ４８．５１“２“６一Ｉｊ“中国农业大学博士学位论文第三章 袭３．４商品豆豉成分含量豆豉加工过程中理化性质的变化Ｔａｂｌｅ ３．４ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｄｏｕｃｈｉ从表３．３可知，与原料大豆相比，接种量为１０４ｃｆｕ／ｇ，含盐量为１０％的豆豉样品，氨基 态氮的含量增加９．０６倍；可溶性蛋白质占总蛋白质的含量由９．１６％升高到４５．３２％，即发酵 结束后将有近一半的蛋白质降解成可溶性的；而总蛋白质损失了９．４８％。 从表３．３和袭３．４中可以看出，本产品水分含量４０％比商品豆豉中水分含量最大的“阳 江桥”（３２．７０％）要多，主要是商品豆豉经过干燥处理而本产品未经此程序：可溶性蛋白 质占总蛋白质的比例和氨基态氮占总氮比例总体上差不多；但商品豆豉总酸含量超出了国 家规定的２．Ｏ％的标准，而试验产品在接种量为１０４ｃｆｕ／ｇ时，总酸含量也超过国家标准。３．３．６豆豉加工过程蛋白质分子量变化图３．９中的ｄ’、ｄ和Ｄ是大豆豆球蛋白（Ｄ－Ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ，７Ｓ球蛋白）的三个亚基，Ａ３ 和Ａ是大豆球蛋白（ｇｌｙｃｉｎｉｎ，１ＩＳ球蛋白）的酸性亚基，Ｂ是ｌＩＳ球蛋白的碱性亚基，一 般大豆中７ｓ球蛋白和１ｌＳ球蛋白总量约占蛋白总量的６０～７０％。如图所示，黑豆干粉中７ｓ 球蛋白和１ｌＳ球蛋白的各种Ⅱ基均存在。前发酵６０ｈ，７Ｓ球蛋白的三个亚基已经全部消失： 而１ＩＳ球蛋白的酸性亚基和碱性亚基仍然存在，但含量明显减少（亚基带的颜色明显变浅）， 仍有一部分蛋白分子量在３１ＫＤａ以上。到了后发酵１ｗ和３ｗ，７ｓ球蛋白的三个弧基完全 消失，只有１１Ｓ球蛋白的碱性亚基Ｂ仍然存在，蛋白分子量在２０．１ＫＤａ左右，３ｗ之后， 蛋白质被降解的分子量大概在２５ＫＤａ以下。这些都是由于蛋白质降解造成的，大部分蛋白 质以多肽和氨基酸形式存在。大豆豆球蛋白比大豆球蛋白被水解的更迅速（Ｒｅｕ１９９５）。ｅｔａ１．，固３ ９不同豆豉加工阶段样品的ＳＤＳ―ＰＡＧＥ电泳囤 卜标准蛋自：２一大豆干粉：３一前发酵６０ｈ： ４，５。６，７－后发酵】ｗ．含５％，７ ５％，１０％．１２ ５％拈的豆豉样品： ８．９，１０，１Ｉ一后发酵３ｗ，含５％．７ ５％，ＩＯ％．１２ ５％盐豆豉样品。Ｆｉｇ．３．９ ＳＤＳ―ＰＡＧＥ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆＤｏｕｃｈｉ ｓａｍｐｌｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ．２７－３．４本章小结ｌ、前发酵过程： 从整个前发酵过程来看，样品的ｐＨ值、可溶性蛋白质含量和氨基氮都上升（除１０６Ｃｆｕ／ｇ 接种量下，３６ｈ的氨基氮），且１０％ｆｕ／ｇ接种量的要比１０４ｃｆｕ／ｇ的偏高。两种接种量的豆豉 曲的总酸含量均是前升后降。 ２、后发酵过程： 随着发酵时间的延长，ｐＨ值显著下降；在同一发酵时Ｉ＇日－Ｊ，１０６ｃｆｕ／ｇ接种量。ｐＨ值较大： 在同一发酵时间，同一接种量下，盐浓度越高，ｐＨ值偏高； 随着发酵时间的延长．可溶性蛋白质含量和氨基氮含量继续上升：在同一发酵时间， 同一含盐量，】０６ｃｆｕ／ｇ接种量的可溶性蛋白质含量和氨基氮含量比１０４ｃｆｕ／ｇ的高；在同一发 酵时问，同一接种量下，盐浓度越高，可溶性蛋白质含量和氨基氨含量越低。 随着后发酵时间的延长，总酸含量上升（除１０４ｃｆｕ／ｇ接种量，含盐量７．５％）；在同一 发酵时间，同一含盐量，１０６ｃｆｕ／ｇ接种量比１０＇’ｃｆｕ／ｇ总酸含量较低：这与氨基氮和可溶性蛋 白质的变化相反。在同～发酵时间．同一接种量下，盐浓度越高，总酸含量越低（除】０４ｃｆｕ／ｇ 接种量，含盐量７．５％）。 发酵结束，大部分蛋白质降解成多肽和氨基酸，分子量在２５ＫＤａ以下。．２８－＿＿－Ｌ中国农业大学博士学位论文ｗｍ第三章豆豉加工过程中理化性质的变化附表：电泳所用的试剂２９－第四章４．１前言豆豉加工过程中异黄酮的变化大豆异黄酮（ｓｏｙｂｅａｎ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ）是一类生物类黄酮，主要是指以３－苯并毗哺酮为母核的 化合物。主要是由９种异黄酮糖菅（即糖苷型大豆异黄酮）和３种相应的糖苷配基（即甙元型 大豆异黄酮）（Ｋｕｄｏｕｅｔａ１．，】９９１）。大豆中前者的含量为９７－－９８％，而后者的含量为２～３％。大豆异黄酮的化学分子结构和结构式见图４．１、图４．２和表４．Ｉ。图４ １糖苷型大豆异黄酮Ｆｉｇ．４．１ Ｔｈｅ ｇｌｕｃｕｓｉｄｅｓ ｏｆ ｉｓｕｆｌａｖｏｎｅｓ图４ ２甙元型大豆异黄酮Ｆｉｇ．４．２ Ｔｈｅ ａｇｌｙｅｏｎｓ ｕｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ表４ １大豆异黄酮化台物的结构式、分子量和甙元的当量值（Ｗｉｓｅｍａｎｅｔａ１．，２００２）Ｔａｂｌｅ ４．１ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｓ ａｎｄ ａｇｌｙｃｕｎ ｍｕｌｅｃｕｌａｒ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ ｏｆｔｈｅ ｓｕｙ ｉｓｕｆｌａｖｏｎｅｓ．３０．｜！！！！Ｉ――――一―――――Ｉ―――――――Ｉ―――――１―――，――，中国农业大学博士学位论文 第四章豆豉加工过程中异黄酮的变化这些异黄酮在大豆食品中的含量与组成受加工过程的影响，例如：热处理、脱气、酶水解 和发酵（Ａｎｄｅｒｓｏｎ＆Ｗｏｌｆ，１９９５：Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔａｌ，２００２：Ｗａｎｇ＆Ｍｕｒｐｈｙ，１９９４ａ，１９９４ｂ，１９９６）。 热处理使一部分丙二酰基葡萄糖苷型向乙酰基葡萄菅型转化（Ｆａｒｍａｋａｌｉｄｉｓ＆Ｍｕｒｐｈｙ，１９８５）。 热处理过程的去除泡沫造成异黄酮的流失（Ｏｋｕｂｏ，Ｋｏｂａｙｚｓｈｉ＆Ｔａｋａｈａｓｈｉ，１９８３）。在Ｂ一葡 萄糖苷酶的作用下，葡萄糖苷型的异黄酮会向相应甙元型转化（Ｔｏｄａ ｅｔ ａ１．，２００１）。在大豆发 酵食品的加：［过程中也发现，葡萄糖苷型的异黄酮会向相应甙元型转化，例如：腐乳（Ｙｉｎ， Ｌｉ，Ｌｉ，Ｔａｔｓｕｍｉ＆Ｓａｉｔｏ．２００４），味噌（Ｃｈｉｏｕ＆Ｃｈｅｎｇ，２００１ｂ），纳豆（１ｂｅ，Ｋｕｍａｄａ，Ｙｏｓｈｉｂａ ＆Ｏｎｇａ，２００１）。在腐乳加工过程中，Ｂ一葡萄糖苷酶的水解作用是葡萄苷型的异黄酮向相应甙 元型转化的主要原因（Ｙｉｎ ｅｔａｌ．，２００４）。 大豆及普通大豆食品中的异黄酮主要以糖苷型的形式存在。但许多研究表明，游离型大豆 异黄酮比糖苷型大豆异黄酮具有更强的生物活性，游离型大豆异黄酮在抗自由基、抗氧化、抗 脂质过氧化、抗溶血、抗肿瘤、抗菌等生物活性方面均比糖苷型大豆异黄酮高（Ｏｎｏｚａｗａ，Ｆｕｋｕｄａ， Ｏｈｔａｎｉ，Ａｋａｚａ，Ｓｕｇｉｍｕｒａ＆Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，１９９８：Ｐｅｔｅｒｓｏｎ＆Ｂａｒｎｅｓ，１９９１）。动物试验表明食 物中大部分以糖苷形式存在的黄酮类化合物不能通过小肠壁直接进入到血液中，只有甙元能够 从小肠处被直接吸收（Ｐｉｓｋｕｌａ，Ｙａｍａｋｏｓｈｉ＆１ｗａｉ，１９９９）。一些羟基甙元型异黄酮，例如： ６一羟基黄豆甙元（６一ｈｙｄｒｏｘｙｄａｉｄｚｅｉｎ，６－ＯＨＤ）．８－羟基黄豆甙元（８－ｈｙｄｒｏｘｙｄａｉｄｚｅｉｎ，８－ＯＨＤ） 和８一羟基染料术黄酮（８－ｂｙｄｒｏｘｙｇｌｙｃｉｔｅｉｎ，８－ＯＨＧ）有更高的抗氧化能力（Ｈｉｒｏｔａ，Ｔａｋｉ，Ｋａｗａｉｉ ＆Ｙａｎｏ，２０００）。因此，不仅异黄酮的含量，而且它们的结构对大豆食品的生理活性影响显著。 尽管已经有些关于豆豉加工的报道，但很少有研究关注豆豉在加工过程中异黄酮总量和组 成的变化以及引起这种变化的原因。在这一章里，我们将分析豆豉在加工过程中的异黄酮总量 的变化、异黄酮各种形式的转化关系、Ｂ一葡萄糖苷酶括力以及与甙元型异黄酮含量的关系和盐 浓度对它们的影响。４．２材料和方法４．２．１试验材料表４ ２试验材料Ｔａｂｌｅ ４．２Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ４．２．２实验仪器实验仪器及设备见表４．３。表４ ３实验仪器及设备Ｔａｂｌｅ ４．３ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ４．２．３试验方法４．２．３．１豆豉的制备（见２２．３１）墩接种量为１ ｘ１０６ｃｆｕ／ｇ湿豆的样品。分别取生大豆、浸泡大豆、蒸煮大豆、前发酵的１２ｈ、 ２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ和６０ｈ和后发酵的１ｗ、２ｗ、３ｗ和４ｗ取样，将样品进行真空冷冻干燥，并计 算各个样品的水分含量。用碾钵将干燥后的样品粉碎后放入．２００Ｃ的冰箱中贮存备用。 ４．２．３．２异黄酮的提取 称取真空冷冻干燥、粉碎后的样品ｌｇ，分别加入８０％，２０ｒａＬ甲醇在８０＇ｃ的温度下进行索 氏抽提４ｈ。用提取溶剂洗涤滤渣３次，定窬至２５ｍＬ。溶液用０，４５ｕｍ的微孔滤膜过滤后，取 ２０ｐＬ用于ＨＰＬＣ分析。 ４．２．３．３样品中异黄酮含量分析（Ｗａｎｇｅ＇ｔａＩ．，２００６）流动相：Ａ溶液：水中含有０．１％的冰醋酸：Ｂ溶液：乙腈含有０．１％的冰醋酸。 洗脱程序：溶液Ｂ在３５ｒａｉｎ内，从１５％升高到２５％，然后在下一个１２ｒａｉｎ内将浓度升高到 ２６．５％，在接下来的３０ｓ内，溶液浓度升到５０％，并再保持１４ 柱温：４０℃： 流速：ｌｍＬ／ｍｉｎ； 进样量：２０［ｔｔＬ。５ｒａｉｎ。在２５４ｎｍ下检测，按峰面积计算各种异黄酮的含量。配制１２种异黄酮的标准混合液，用外标法进行定量分析。一３２－中国农业大学博士学位论文４．２．３．４第删章豆豉加工过程中异黄酮的变化Ｂ一葡萄糖苷酶的提取称取真空冷冻干燥并粉碎后的样品Ｏ．５９，加入５ｍＬ磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液，均质ｌｍｉｎ 后在室温下提取２ｈ。提取液置于高速冷冻离心机中，在９６００ｒｐｍ下离心１０ｍｉｎ。取上清液进行 酶活测定。４．２．３．５Ｂ一葡萄糖苷酶酶活力测定ｏ．２Ｍ ｐＨ４．５磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液配制：取磷酸氢二钠１４ ３２６９加蒸馏水２００ｍＬ溶解，配成ｏ，２Ｍ磷酸氢二钠溶液；取柠檬酸４．２０３９加蒸馏水２００ｍＬ溶解，配成０．１Ｍ柠檬酸溶液； 往Ｏ．２Ｍ磷酸氢二钠溶液加八０．１Ｍ柠檬酸溶液，用ＤＨ计校正，调至ｐＨ４．５。１ｍＭ ｐ－ＮＰＧ溶液配制：取ｐ－ＮＰＧ ３０．１３ｒａｇ溶于１００ｍＬ磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液中。酶活测定：将Ｂａｈｌ和Ａｇｍｗａｌ（１９６８）的方法略加改进，以ｐ－ＮＰＧ为水解底物测定酶的活力。先取２ｍＬｐ．ＮＰＧ液在４５＂Ｃ水浴中保温５ｒａｉｎ，然后加入Ｏ．５ｍＬ的提取液，在水浴中反应 ３０ｒａｉｎ后加入１Ｍ Ｎａ２Ｃ０３２．５ｍＬ中止反应。将反应液稀释至适当浓度后立即在４００ｎｍ下测ＯＤ 值。以对硝基苯酚作标准曲线。】个酶活单位定义为在上述条件下１ｒａｉｎ释放Ｉｐｍｏｌ对硝基苯酚 所需的酶量。 ４．２．８。６统计分析 所有的实验重复三次，取平均值。应用ＳＡＳ（ＳＡＳｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ ６．１２，ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｌｎｅ．．Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）分析系统的Ｄｕｎｃａｎ多重比较法在０．０５的水平下进行检验。４．３试验结果与讨论４．３．１豆豉加工过程中总异黄酮含量的变化异黄酮标准品和样品的ＨＰＬＣ分离诺图见附图。乙酰基异黄酮（６ｎ＿Ｏ．ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｉｔｉｎ）在大 豆中的含量很低，在一些的文献报道中不考虑它（Ｗａｎｇ＆Ｍｕｒｐｈｙ，】９９４ａ，】９９４ｂ，】９９６）。表 ４．４是豆豉加工各个阶段产量、水分含量和异黄酮总量的变化。结果表明，１０００９的生大豆能产 生１５４６９豆豉（盐的添加量为１０％，传统的加工工艺），豆豉中异黄酮的损失率为６ｌ‰在浸泡 和蒸煮过程中异黄酮的损失不显著。异黄酮的总量在前发酵的１２ｈ到６０ｂ内逐渐降低，结果导 致４３％的异黄酮损失，特别是在前发酵的３６ｈ到６０ｈ内，异黄酮损失了２８％。豆豉曲添加盐后， 进入后发酵的１ｗ内是异黄酮损失的第二个主要步骤，异黄酮损失了１８％。在接下来的后发酵过程中没有显著影响异黄酮总量。在后发酵中添加不同浓度的盐，没有显著影响异黄酮总量（见表４．５）。 异黄酮总量的计算是干基为准的，因此在前发酵过程中，微生物生长造成干物质的损失可 能影响异黄酮总量的变化。在前发酵的１２ｈ到６０ｈ，干物质从８７５９降到８３３９。一些羟基甙元型异黄酮在用曲霉发酵的大豆食品中产生。令人鼓舞的是，日本学者Ｅｓａｋｉ等人（１９９８）提出，在曲霉发酵大豆食品中分离出两种新的甙元型异黄酮８－ＯＨＤ和８－ＯＨＧ，并且它们的含量分别与黄豆甙元和染料术黄酮含量相当。接着，Ｅｓａｋｉ等人（１９９９ｂ）年再次在中国农业大学博士学位论文第四章豆豉加工过程中异黄酮的变化Ｉ发酵的大豆中分离出８－ＯＨＤ、８－ＯＨＧ和６－ＯＨＤ。Ｅｓａｋｉ等人（１９９９ａ）报道了８－ＯＨＤ和８－ＯＨＧ 的形成机理，他们认为，由微生物Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ发酵产生Ｄ一葡萄糖苷酶将黄豆苷（ｄａｉｄｚｉｎ） 和染料术苷（ｇｅｎｉｓｔｉｎ）水解为黄豆甙元（ｄａｉｄｚｅｉｎ）和染料木黄酮（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ），进一步在羟化 酶的作用下，形成８－ＯＨＤ和８－ＯＨＧ（见图４．３）。Ｈｉｒｏｔａ等人（２０００）报道从用曲霉发酵的味 噌（ｍｉｓｏ）中也分离出８－ＯＨＤ和８－ＯＨＧ．并得出它们对ＤＰＰＨ（ｉ，Ｉ．ｄｉｐｈｅｎｙｌ一２－ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ） 的作用与维生索Ｅ相当。他们的研究结果表明，异黄酮的羟基化过程很可能在豆豉的发酵过程中也产生，并且有可能是造成异黄酮总量损失的原因之一。我们的数据显示，在曲霉型豆豉发酵前３６ｈ到６０ｈ，大豆异黄酮总量（检测了目前已知的８种异黄酮糖苷（即糖营型大豆异黄酮） 和３种相应的糖苷配基（即甙元型大豆异黄酮））下降很多，我们推测在这个阶段，有可能甙元 型异黄酮黄豆甙元和染料木黄酮在羟基化的作用下形成了８－ＯＨＤ和８－ＯＨＧ。可惜的是在本研 究中我们没有检测羟基甙元型异黄酮和羟基化酶。因此，有待于进一步验证。固Ｇｌｖｅｏｓｉｄｅｓ －－－－＿???＿?＿－＇ Ｇｅｎｉｓｔｉｎ固ＡｇｌｙＣＯＩＬＳ Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ固８－ＯＨＧ厂―――］ｐ－Ｇｌｕｃｏｓ}