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免疫组织（细胞）化学王颖颖
内? ? ?容免疫组化 免疫组织（细胞）化学免疫荧光显微镜的使用概 念用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学 成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究的技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry， 技术。IHC）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC）IHCICC原 理?根据抗原抗体反应和化学显色原理酶或荧光基团?最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成 分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内 发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组 织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量分 类?按标记物质的种类? ?免疫荧光法：荧光染料 放射免疫法：放射性同位素??免疫酶标法：HRP（辣根过氧化物酶）免疫金银法：胶体金?按结合方式??抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法； 聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生 物素含量高的组织抗原检测。?内? ? ?容免疫组化*免疫荧光显微镜的使用实验步骤二甲苯 梯度酒 精石蜡切片ddH2O或PBS洗 抗原修复冰冻切片脱蜡、水化37度烤片预 处 理3%H2O2孵育10 min去除内源性过氧化物酶 孵育一抗 即 用 型 二 步 法 孵二抗试剂1 37度20分钟 孵二抗试剂2 37度30分钟 梯度酒精 二甲苯 DAB显色 复染 脱水、透明 封片 血清封闭（试剂A）室温2 h 孵一抗 孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h 孵ABC液（试剂C） 37度40分钟ABC放 大 法预处理?石蜡切片：组织切片在60℃恒温箱中烘烤6-8h，浸二甲苯前应在60℃烤0.5-1h。?脱蜡：组织切片置于二甲苯中浸泡15分钟,更换二甲苯后再浸泡15分钟?水化：分别过无水乙醇，95%乙醇，80%乙醇，70%乙醇，自来水，双蒸水?冰冻切片：将切片放在37℃烘烤1h，然后置于组化PBS或蒸馏水中浸泡实验步骤二甲苯 梯度酒 精石蜡切片脱蜡、水化ddH2O或PBS洗冰冻切片37度烤片抗原修复预 处 理3%H2O2孵育10 min去除内源性过氧化物酶 孵育一抗 即 用 型 二 步 法 孵二抗试剂1 37度20分钟 孵二抗试剂2 37度30分钟 梯度酒精 二甲苯 DAB显色 复染 脱水、透明 封片 血清封闭（试剂A）室温2 h 孵一抗 孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h 孵ABC液（试剂C） 37度40分钟ABC放 大 法抗原修复?抗原修复(Antigen Retrieval，AR)是以高温、高压对常规 固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消 化，以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。?修复介质： ①0.01M pH6.0柠檬酸盐缓冲液(CB)；②EDTA pH9.0。?修复方式：①微波96℃±10min×2；②直接加温100℃， 15min；③水浴锅100℃，10/20min；④高压锅/消毒锅 120℃，3min；⑤真空加热10min；⑥直接烤片法。抗原修复??? ?热处理后应注意自然冷却（至少半小时）； 热处理液不要让其煮干； 不要任何抗原的检测都使用该方法； 同一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。实验步骤二甲苯 梯度酒 精石蜡切片脱蜡、水化ddH2O或PBS洗 抗原修复冰冻切片37度烤片预 处 理3%H2O2孵育10 min去除内源性过氧化物酶孵育一抗 即 用 型 二 步 法 孵二抗试剂1 37度20分钟 孵二抗试剂2 37度30分钟 梯度酒精 二甲苯 DAB显色 复染 脱水、透明 封片 血清封闭（试剂A）室温2 h 孵一抗 孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h 孵ABC液（试剂C） 37度40分钟ABC放 大 法去除内源性过氧化物酶?尤其在含有丰富血细胞的标本中，由于其中含有大量 的具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢反应，出现 气泡现象，易对组织结构和细胞形态产生一些不良影响。?用3%过氧化氢的方法，能够去除大部分内源性酶，即使有些血细胞在显色后也出现棕黄色反应，但由于其形态结构与组织细胞不同，也易鉴别。?注意过氧化氢的浓度不能过高，一般为3%-5%，时间 不宜过长，10-40 min。二甲苯 梯度酒 精实验步骤石蜡切片脱蜡、水化 ddH2O或PBS洗 抗原修复冰冻切片37度烤片预 处 理3%H2O2孵育10 min去除内源性过氧化物酶 孵育一抗 即 用 型 二 步 法 孵二抗试剂1 37度20分钟 孵二抗试剂2 37度30分钟 梯度酒精 二甲苯血清封闭（试剂A）室温2 hDAB显色 复染 脱水、透明 封片 孵一抗 孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h 孵ABC液（试剂C） 37度40分钟ABC放 大 法血清封闭组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色， 最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物的非免疫血清(1:5~1:20) 封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性 结合。必要时可加入2%~5%牛血清蛋白，可进一步减少非特异 性染色。作用时间为室温2 h，或根据说明书。??? ? 封闭前 封闭后?驴血清 10% BSA 3% triton-100 0.1% tween-20 0.05% PBS二甲苯 梯度酒 精实验步骤石蜡切片脱蜡、水化 ddH2O或PBS洗 抗原修复冰冻切片37度烤片预 处 理3%H2O2孵育10 min去除内源性过氧化物酶孵育一抗即 用 型 二 步 法 孵二抗试剂1 37度20分钟 孵二抗试剂2 37度30分钟 梯度酒精 二甲苯 DAB显色 复染 脱水、透明 封片血清封闭（试剂A）室温2 h孵一抗孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h 孵ABC液（试剂C） 37度40分钟ABC放 大 法一?抗首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的信息，选择所需试剂的型号?购置抗体的注意事项? ? ? ? ? ?种属：单克隆抗体，多克隆抗体 能否用于石蜡切片 稀释度特异性，交叉反应用何种组织前处理形式（如抗原修复形式等） 包装单位，价格一 抗?孵育浓度：首先不同的稀释度摸条件，如1U50、 1U100、1U200等。选择合适的稀释度完成后续 实验。（选择表达较高的组织进行此步实验）孵育时间：可先选择短时间如2 h，若结果不理想， 则适当延长时间。但确定后不要更改。??孵育温度：室温为宜（25 ℃左右），如过夜则置 于4℃孵育，加二抗前复温至少0.5 h。37℃孵育 可能会使染色过强，或产生非特异性着色。对 照?阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做。 用于排除方法和实验系统有无问题；?阴性对照一般是用PBS替代一抗来进行反应，其 余步骤均一致。用于排除有无一抗外的非特异性 染色。二甲苯 梯度酒 精实验步骤石蜡切片脱蜡、水化 ddH2O或PBS洗 抗原修复冰冻切片37度烤片预 处 理3%H2O2孵育10 min去除内源性过氧化物酶 孵育一抗 即 用 型 二 步 法 血清封闭（试剂A）室温2 h DAB显色 复染 脱水、透明 封片 孵一抗孵二抗试剂1 37度20分钟 孵二抗试剂2 37度30分钟梯度酒精 二甲苯放 大 法孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h 孵ABC液（试剂C） 37度40分钟二 抗PV即用型 SP生物素放大PV9000：鼠、兔通用 PV9003：羊来源一抗 SP9000：鼠、兔通用 SP9003：羊来源一抗二甲苯 梯度酒 精实验步骤石蜡切片脱蜡、水化 ddH2O或PBS洗 抗原修复冰冻切片37度烤片预 处 理3%H2O2孵育10 min去除内源性过氧化物酶 孵育一抗 即 用 型 二 步 法 孵二抗试剂1 37度20分钟 孵二抗试剂2 37度30分钟 梯度酒精 二甲苯 血清封闭（试剂A）室温2 hDAB显色复染 脱水、透明 封片孵一抗 孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h 孵ABC液（试剂C） 37度40分钟ABC放 大 法DAB显色??DAB试剂盒：浓缩液：稀释液=1：20量取50 mL PBS 置于有毒区棕色瓶，再称取DAB粉末0.02 g溶 于PBS，振荡混合，避光过滤到专用玻片缸中，加入200 μL H2O2摇晃均匀，即可开始显色。根据显微镜下观察的结果终止 染色，记录显色时间。?注意：? ?1.粉末DAB显色阳性信号可能会在显色1-2 min时才出现，请勿过早终止。 2.DAB的有效作用时间为半小时，如果超过15 min未产生阳性信号，则 可以提高一抗浓度或延长一抗孵育时间。?? ?3.同一分子在不同处理组的显色时间要保证一致。4.DAB为一次性试剂，用后自觉将液体倒掉，并将玻片缸放于固定位置。 5.DAB粉末放于有毒冰箱-20度，用后放回原处。二甲苯 梯度酒 精实验步骤石蜡切片脱蜡、水化 ddH2O或PBS洗 抗原修复冰冻切片37度烤片预 处 理3%H2O2孵育10 min去除内源性过氧化物酶 孵育一抗 即 用 型 二 步 法 孵二抗试剂1 37度20分钟 孵二抗试剂2 37度30分钟 梯度酒精 二甲苯 DAB显色 血清封闭（试剂A）室温2 h 孵一抗 孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h 孵ABC液（试剂C） 37度40分钟ABC复染 脱水、透明放 大 法封片?苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗5分钟?脱水、透明、封片、镜检。? 脱水：70%酒精3分钟，80%酒精3分钟，95%酒精5分钟，无水乙醇5分钟，拿出晾干。? 透明：二甲苯各8分钟 ? 封片：中性树脂 ? 镜检结果判定?原则? 必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。? 抗原表达必须在特定部位。如人白细胞共同抗原LCA和上皮膜抗原EMA应定位在细胞膜上；肌酸激酶CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内，等等。不在抗原所在部位的阳性着色， 一概不能视为阳性。? 尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。? 阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。?免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际 工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，与抗 原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标，与功能有关。一、阳性标记免疫特征：分&弱(+)、中(++)、强(+++)&三级。免疫酶标记（HRP- DAB/H2O2）表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易 见。 + +++++二、阳性标记细胞学特征（以 HRP-DAB/H 2 O2 为例） 可分 为①胞膜型；②胞核型；③ 胞质(浆)型；④微绒毛型和⑤复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞质 兼有）等五种阳性细胞类型 。这与抗原所在部位相关联 ，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。三、阳性标记组织学特征（以HRP-DAB/H2O2为例） 免 疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有 如下7种：①局灶型；②弥漫型；③片块型；④网状型 ；⑤腺管型；⑥腔缘型和⑦菊团型，等。这主要取决 于抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细胞在组织 内的群体分布特点。四、阳性标记强度特征依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为弱阳性（+）┅1分；中等阳性（++）┅2分；强阳性（+++）┅3分。依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性（+，指阳性细胞总数在25%以下）；中等阳性（++,指阳性细 胞总数在25%―49%)；强阳性（+++ ，指阳性细胞总数在 50%以上)。此外，还有++++ ，指阳性细胞总数在75%以上) 。? IS染色结果=染色强度×阳性细胞百分比。结果为0-12分，其中0-3分为低表达组，4-12分为高表达组。? 只有一种评判标准，具体的可参考文献。 ? 平均值：随机选择5个高倍视野，计数1 000~2 000个细胞 ，取其平均值为该病例的细胞表达率，高于均值为高表达 ，低于为低表达 ? 统计软件统计是否差异有统计学意义? SPSS/state注意事项?二甲苯在烘箱中加热时必须将鼓风关掉，防止二甲苯挥发溢出。切片放入二甲苯及换缸时必须在通风橱中 进行，然后再拿到烤箱中。夏季二甲苯可不加热。 烤箱温度不要超过62度??抗原修复后，切片不能直接放到冷水中，要在修复液中冷却到室温。?抗原修复后一定不要干片， 尤其是涂唇膏或指甲油的过 程中，否则易产生非特异性 着色。?DAB显色后直接将切片放入自来水中，以免弄到湿盒内 造成污染。做好个人防护。?二甲苯更换时直接倒在通风橱内的空瓶子中，可用卷纸将缸内蜡渍擦净，然后倒入新的二甲苯。脱蜡和透明的二甲苯不能混用。?通风橱两侧的二甲苯及梯度酒精不能混用左 侧 脱 蜡右 侧 透 明?封片脱水时从无水乙醇中拿出后必须晾干，才能放入二甲苯中。而在二甲苯中浸泡到时间不要干片，滴加中性树脂盖盖玻片。?在通风橱中吹干后再拍摄， 否则影响拍摄效果。拍摄 时调整好合适的仪器参数。?有毒区域物品勿拿到无毒 区域。免疫组化问题解答?非特异性背景染色? ?操作过程中冲洗不充分，每步冲洗3次每次5分钟 组织中含过氧化物酶未阻断，可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育 时间延长 组织中含内原性生物素，正常非免疫动物血清再封闭? ? ? ? ?血清蛋白封闭不充分，延长血清蛋白封闭时间标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色 DAB孵育时间过长或浓度过高 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗 体看看?染色弱?抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不 能少于1 h??试剂超过有效使用时间，应更换试剂操作中添加试剂时缓冲液未沥干，每步滴加试剂前沥干切片 中多余的缓冲液，防试剂稀释（应防止切片干燥） 室温太低，低于15度，要改放在37度孵育箱孵育30-60 min 或4 度冰箱过夜 蛋白封闭过度，封闭时间减少???染色过强?抗体浓度过高或孵育时间过长，降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1 h或4度过夜 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度??染色阴性?操作步骤错误，应重试，设阳性对照?? ? ?组织中无抗原或含量低，设阳性对照以验证试验结果抗原修复不全，换修复液或延长时间 血清封闭时间过长 一抗与二抗种属连接错误，仔细确定一抗二抗种属无误内? ? ?容免疫组化免疫荧光显微镜的使用免疫荧光组织荧光冰冻切片 37度烤片 抗原修复 ddH2O或PBS预处理 血清封闭（勿洗）室温2 h 敷一抗过夜 敷荧光二抗4度2 h 甘油封片：盖玻片 敷二抗时根据个人需要选择是否标记细胞核，DAPI或Hoechst染色细胞荧光取出24孔板，弃培养基4%细胞多聚固定0.5-1 h 血清封闭2 h 敷一抗过夜 敷荧光二抗4度2 h甘油封片：载玻片荧光二抗?根据物种：不同来源的一抗，所用的二抗不同。小 鼠、兔、山羊、绵羊、大鼠等。?根据颜色：红、绿、紫? Cy2/FITC：绿色荧光? Cy3：红色荧光? AlexaFluor：红色（568）、绿色（488）phalloidin，标记细胞骨架F-actin，不? 鬼笔环肽：加一抗，本身以二抗标记。荧光双标：两种一抗 的来源要不同，二抗 选择不同的颜色。?1、非特异性染色产生原因及其解决方案：?⑴游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。购买高质量、高纯度的荧光素二抗。?⑵抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。?⑶组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血 清封闭时间。?⑷从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。?⑸抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。? ?⑹一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。 ⑺一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。?2、阴性染色产生的原因有：? ?⑴一抗和二抗浓度不合适或孵育条件不妥。 ⑵荧光素提前衰退。荧光素质量不佳或操作过程中没有注意避光等防止荧光 素衰退的事项。? ? ? ?⑶血清封闭时间过长。 ⑷抗体稀释液pH值不合适，影响抗原抗体反应。 ⑸组织切片不平、裂片或脱片很严重，易引起大块阴性着色。 ⑹组织标本不新鲜或已经冷冻组织制成的切片中抗原易弥散，易引起本来表 达的部位阴性染色或弱着色。?⑺荧光显微镜不会使用，激发波长选择错误。内? ? ?容免疫组化免疫荧光显微镜的使用显微镜程序的使用? ? ?打开汞灯预热（如拍组化则不用打开） 打开显微镜开关 打开电脑程序图标?图像预览?设置参数?采集图片/保存? ? ?组化/荧光的切换 荧光不同颜色通道的切换 关闭程序??关闭显微镜开关关闭汞灯物镜的切换?观察位置的切换 ?拉出为电脑上观察 ?推进为显微镜内观察可能遇到的问题???? ??图像预览打不开 ? 任务栏中右键点击窗口，最大化或还原即可。 组化颜色不正常， ? 点自动白光平衡，曝光时间不要太大，否则颜色偏红 汞灯不能启动 ? 汞灯关闭后一般等半小时以后才能再次打开。否则易出 现不能启动的现象，也减少汞灯的寿命。 荧光颜色不正，可用组化片子将颜色调整，再拍荧光。 图像模糊，用擦镜纸蘸无水乙醇擦拭。 图片保存不了，可能是所存盘内存已满，存入其他盘即可。 拍摄图片及时拷走，并删除电脑中的，清理回收站。
免疫组化原理、步骤及要注意的事项_生物学_自然科学_专业资料 暂无评价|0人阅读|0次下载|举报文档免疫组化原理、步骤及要注意的事项_生物学_自然科学_专业资料。...免疫组化临床意义_临床医学_医药卫生_专业资料。临床免疫组化意义 1、恶性肿瘤免疫组化耐药预后标志全套 4 项:P-gP,GSTπ ,TOPOⅡ,Ki-67。 2、 乳腺癌免疫...细胞免疫组化步骤_生物学_自然科学_专业资料。细胞免疫组化步骤 ( 21:40:50) 细胞免疫组化(SABC 法)步步看:细胞冻存够了,且状态良好!咋们就开始...免疫组化的作用_基础医学_医药卫生_专业资料。免疫组化的作用日期: 标签: 免疫组化 相关专题:如何实现完美的免疫组化实验摘要 : 由于免疫组化具有特异...免疫组化步骤_生物学_自然科学_专业资料。免疫组化的标准步骤发布日期: 免疫组化步骤(ABC 法) 1。4%多聚甲醛常规灌注固定,取材并置 20%蔗糖溶液(...病理科免疫组化常用抗体_临床医学_医药卫生_专业资料。病理科免疫组化常用抗体 免疫组织化学常用抗体标记谱系 第一节 上皮细胞标志 1.细胞角蛋白 Cytokeratin(CK)...免疫组化 是融合了免疫学原理(抗原抗体特异性结合)和组织学技术(组织的取材、固定、 包埋、切片、脱蜡、水化等) ,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶...临床常用免疫组化指标的意义本贴收到 1 朵 临床常用免疫组化指标的意义 鲜花 临床病理工作中,我们常用到“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”,但是许多单位只写阳性...免疫组化原理及概述
16:42:35| 分类: 细胞频道 |字号 订阅 一、免疫细胞化学技术的概述 *免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC) -是利用抗原与...免疫组化和免疫荧光的区别_生物学_自然科学_专业资料。两者都是蛋白定位的检测(也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜) 。 区别是: 1、概念和基本原理 免疫组织...
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免疫组化实验步骤及配方日期：
免疫组化步骤 1. 多聚甲醛灌流取材，多聚甲醛后固定，30%多聚糖溶液沉糖;2. 冰冻切片（1d-14d 脊髓>=2014d-28d>=10DRG d=10um）3. 0.01M PBS洗 10min×3次;4. 1N HCL 暴露抗原 30min；5. 去离子水洗，0.01M PBST洗 10min×3次；6. 3%双氧水(0.01M PBS配制)洗10min，灭活内源性HRP；7. 0.01M PBST洗 10min×3次；8. 5%-10%血清封闭30min（0.01M PBST 配制）；9. 一抗过夜，一抗用PBST稀释；10. 0.01M PBS洗 10min×3次，二抗3孵育小时；11. 0.01M PBS洗 10min×3次，HRP-亲和素3小时；12. 0.01M PBS洗 10min×3次，DAB显色 12-18min。 免疫组化常用试剂配制 1. 0.1M PB: 14.5g Na2HPO4·12H2O500mL H2O1.5g NaH2PO4·2H2O2. 0.1M PBS : 500mL 0.1M PB45g NaCl3. 0.01M PBST: 100mL 0.01M PBS10滴 Triton X-1004. IN HCL: 盐酸：水=1：105. 4%多聚甲醛： 13.6g KH2PO43.6g NaOH40g 多聚甲醛1000mL H2O注：1). 需要60°C加热溶解，过滤使用；2).多聚甲醛每次比需要多称10g，以弥补后面过滤的损失；3).现将多聚甲醛溶于1000mL水中，然后一边加热搅拌一边缓慢加入多聚甲醛的助溶剂NaOH，待NaOH和多聚甲醛都完全溶解后再加入KH2PO4，溶后过滤备用。6.DAB液：以0..1M PB配制，DAB浓度0.05%，H2O2浓度0.03%。 注：1). H2O2临用时再加；2).用DAB染后用0.01M PB洗。 7. 30%蔗糖： 150g 蔗糖500mL 4%多聚甲醛注：可同时沉糖后固定。8.封闭液： 10%山羊血清（做免疫荧光时另加0.1%BSA）。本文由()首发，转载请保留网址和出处！
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【求助】大鼠脑冰冻切片做免疫组化
我刚开始做冰冻切片，有很多地方不太明白，查过了一些学长们的帖子还是有些疑问，希望大家能帮帮忙。十分感谢。1.我见到免疫组化的说明书上说只能用于冷丙酮固定的冰冻切片，那还能不能用多聚甲醛灌注固定呢？是不是取新鲜脑组织然后用冷丙酮浸泡就可以了呢？2.蔗糖的脱水应该在哪个阶段？先固定再脱水好像比较多见，那么用冷丙酮固定时也应该按这个顺序么？能否配成10%的蔗糖液直接在多聚甲醛后灌注呢？3.冰冻切片的保存。我的实验室里没有液氮和-80度冰箱，直接用OCT包埋组织块置于-20度可以么？另外如果切成了片该如何保存呢？期待回帖！1.应该是可以的。做石蜡切片过程中的脱水、浸蜡及二甲透明的过程中，部分要在60度进行，对某些抗原的破坏性较大。用多聚甲醛灌注固定后，蔗糖脱水，对抗原的影响较前者小很多。2，所谓用丙酮固定，其意思应该是取新鲜组织后直接冰冻切片，然后4度冷丙酮固定，然后-20度保存，我们保存1月后后，有些抗原照样做的出来。3，丙酮固定好的冰冻切片一般在-20度保存即可。如果是组织的话，最好在-70度或者液氮中保存，半年没有问题。GOOD LUCK!十分感谢！还有一点不明白，想请教一下天道酬勤站友：切完片保存是指贴片后保存还是漂在什么液体中保存呢？各需要什么条件呢？多谢！我说的是指贴片。如果要用漂片的话，最好多聚甲醛灌注固定后，蔗糖梯度脱水，性冰冻切片，切好的片子一般置于多聚甲醛中，4度保存，一般一周之内做完。时间过长可能导致抗原丢失。这次明白了，我会斟酌选择的，十分感谢。
您的位置： &&求助：冰冻切片免疫组化问题 -
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求助：冰冻切片免疫组化问题
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楼主 发表于
根据文献，我准备做大鼠脑fos基因免疫组化染色。实验步骤大体是：大鼠分批戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉，先用生理盐水心脏灌流以去除血液，再用多聚甲醛灌注固定，取脑，多聚甲聚后固定，蔗糖浸泡至沉底，冰冻切片。因为大鼠分批处死，所以，切片在冰冻液中-20C保存。等全部动物处理完毕后，一起免疫组化染色。 请各位指教： 1。根据文献，切片可以在冰冻液中-20C保存数月至一年，仍保留免疫活性。那么我们先不切片，把脑组织放入冰冻液中，能不能长时间保存？ 2。石蜡切片免疫组化染色时，是先裱片、固定，再染色。请问：冰冻切片也是先裱片再染色吗？ 其它问题及注意事项，请一并指教。 多谢！ &
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1 楼 &&&发表于 17:47:00|
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2 楼 &&&发表于 23:57:00|
1。根据文献，切片可以在冰冻液中-20C保存数月至一年，仍保留免疫活性。那么我们先不切片，把脑组织放入冰冻液中，能不能长时间保存？只好如此保存了，至于抗原能保持多长时间未知。
2。石蜡切片免疫组化染色时，是先裱片、固定，再染色。请问：冰冻切片也是先裱片再染色吗？裱片，除非你用漂染。
粉蓝豆：21
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3 楼 &&&发表于 20:59:00|
以下是引用sdnick在 10:54:00的发言：
根据文献，我准备做大鼠脑fos基因免疫组化染色。实验步骤大体是：大鼠分批戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉，先用生理盐水心脏灌流以去除血液，再用多聚甲醛灌注固定，取脑，多聚甲聚后固定，蔗糖浸泡至沉底，冰冻切片。因为大鼠分批处死，所以，切片在冰冻液中-20C保存。等全部动物处理完毕后，一起免疫组化染色。
请各位指教：
1。根据文献，切片可以在冰冻液中-20C保存数月至一年，仍保留免疫活性。那么我们先不切片，把脑组织放入冰冻液中，能不能长时间保存？
2。石蜡切片免疫组化染色时，。请问：冰冻切片也是先裱片再染色吗？
其它问题及注意事项，请一并指教。
&对于你的问题我的建议是，将所有动物标本取材后有液氮保存，在你需要时一并切片。但是有个问题是你在做所有动物标本前要先做预实验啊。
&至于免疫组化方法学并不困难，就是先裱片、固定，再染色，不过固定最好用丙酮，要不你可能做不出来的，还有过氧化氢阻断后要注意多水洗，把那些气泡洗去才行啊。
&不知对你是否有帮助，望你成功。
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4 楼 &&&发表于 09:09:00|
&感谢诸位帮助！
根据文献，冰冻切片先免疫组化染色，最后一步裱片（mounting）。请教各位：切片是游离在液体中的，如何染色？
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5 楼 &&&发表于 09:10:00|
&请问怎样漂染？
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6 楼 &&&发表于 10:23:00|
&采用细胞培养皿-采用漂片法染色呀
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7 楼 &&&发表于 08:32:00|
扎实打基础
粉蓝豆：69
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8 楼 &&&发表于 18:07:00|
&漂片染法是后裱片，在培养皿中染色最好用小筛子，用小筛子可以省去每次洗片时需要涝片的麻烦，如果将小筛子隔为几个，这样可以同时多染几组，这个方法可能浪费抗体，先裱片省抗体。
回复：8 阅读：3005
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