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摘要 : Western Blot常见问题之Marker问题
1. 我用的是可视(BIO_RAD)，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因?怎样改善?胶用过8%，10%，12%，都是这样。marker是新买的。
解答：一般来说，是小Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。
2. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。用80V进行，用恒压10V45min转印的。前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体(Anti-V5-HRP)。但就是出不来结果，我很茫然。谢谢您过给予指点!
解答：1、“我用的是Roche
Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。”有的时候，Prestained Marker 放久了效果就会变差，电泳是条带不清晰，扩散。但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多加点甲醇。
2、“前几次做 Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好。
3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用C端的V5表位的酶联抗体(Anti-V5-HRP)。”
是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性对照?你要做这么大的最好转移时间延长到1.5hrs。
作者：xilu 点击：次
热门文章TOPWestern&Blot常见问题及处理-非常有用！
以下内容来自于em.ureach的博客，新手们值的一看：
Blot常见问题及处理(二)
1．电泳中常出现的一些现象：
　　●︶ 条带呈笑脸状
原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。
　　●︵ 条带呈皱眉状
原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
　　●拖尾
原因：样品溶解不好。
　　●纹理（纵向条纹）
原因：样品中含有不溶性颗粒。
　　●条带偏斜
原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。
　　●条带两边扩散
原因：加样量过多。
2．Western blot结果中背景较高
可能的原因及建议：
　　●膜封闭不够
延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
　　●一抗稀释度不适宜
对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
　　●一抗孵育的温度偏高
建议4℃结合过夜。
　　●选择的膜容易产生高背景
一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。
　　●膜在实验过程中干过
实验过程中要注意保持膜的湿润。
　　●检测时曝光时间过长
减少曝光时间。
3．Western blot结果中杂带较多
可能的原因及建议：
　　●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
　　●目的蛋白有其它剪切本
查阅文献或生物信息学分析可能性。
　　●样本处理过程中目的蛋白发生降解
加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
　　●上样量过高，太敏感
适当减少上样量。
　　●一抗特异性不高
重新选择或制备高特异性的抗体。
　　●一抗不纯
　　●一抗或者二抗浓度偏高
降低抗体浓度。
4 . Western blot结果中无信号或显示信号弱
可能的原因及建议：
　　●检测样本不表达目的蛋白
选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
　　●检测样本低表达目的蛋白
提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
　　●转移不完全或过转移
可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
　　●抗体不能识别测试种属的相关蛋白
购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
　　●一抗孵育时间不足
建议4℃结合过夜。
　　●二抗与一抗不匹配
选择针对一抗来源的种属的抗体。
　　●洗膜过度
洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
5. 其它现象：
　　●膜上多处出现黑点或黑斑
原因：抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。
　　●反白（条带显白色）
原因：目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。
　　●蛋白分子量偏低或偏高
原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。
6．安全问题：
操作有毒试剂时，带手套和口罩，且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。
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【求助】western blot 较多条带原因分析
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这个帖子发布于9年零314天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教各位高手：我做的蛋白为66kD,一抗为兔多抗，60ug上样，80V积层胶电泳，180V分离胶电泳，转膜为70V 2.5h，一抗4度过夜，一抗用封闭液稀释，1：200（santa公司原装），二抗1：4000稀释。显影结果示一个泳道上有多条蛋白条带，不知哪条是目的条带，还是根本就没有？请教是哪个环节有问题，有什么好的建议？谢谢！
另外，之前还做了两次实验，一抗均为1：500稀释，没有过夜，结果没有条带显示，但actin较明显。
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如果前两次在一抗孵育的过程中在4度没有过夜的话，那肯定是造成没有条带现实的最直接原因。不知道你用的是什么表达载体，而且你的胶上应该加上标准蛋白，这样即使出了问题也可以参考。如果这些条带的位置比目的蛋白的位置低，有可能有下列原因：一，很有可能说明你的蛋白出现了截短表达，也就是转录本中有稀有密码子或出现了二级结构的影响，导致翻译过程中移码或者核糖体分裂。二，蛋白在表达过程中发生了水解，或者在细胞裂解的过程发生了水解，加入蛋白酶抑制剂或者保持低温状态以及迅速操作都有助于减少蛋白水解。具体的解决方法可以搜索本站或者其它文献。
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非常感谢！分析得很有道理，我会参考你的建议。另外，条带较多是否有可能与封闭不好有关，我是用5%脱脂奶粉（TBST稀释），室温1h，时间是否过短？二抗作用也是室温1h，时间是否合适？一抗和二抗最好是用封闭液稀释吗？我只有一抗用封闭液稀释的。请不吝赐教！谢谢！
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不可能是因为封闭的问题，如果封闭不好，显色的条带不仅仅会出现在一个泳道上不是吗。温度不是很低的话，一般1hour都可以，当然有些实验可能要稍微延长下。关于稀释液的问题，最好还是使用封闭液，毕竟能够提供一个很好的反应体系么。
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