君，已阅读到文档的结尾了呢~~
(论文)杂色曲霉素对小鼠胸腺和脾脏转录因子foxp3 调节性t淋巴细胞的影响
effect of sterigmatocystin on transcription factor foxp3
regulatory t lymphocytes of thymus and spleen in mice
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
(论文)杂色曲霉素对小鼠胸腺和脾脏转录因子foxp3 调节性t淋巴细胞的影响
effect of sterigmatocystin on transcription factor foxp3
regulatory t lymphocytes of thymus and spleen in mice
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer--144.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究_甜梦文库
针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究
湖北中医药大学 博士学位论文 针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究 姓名：肖凌 申请学位级别：博士 专业：针灸推拿学 指导教师：王华
中文摘要目的：检测“双固一通”电针法延缓Ｄ一半乳糖诱导衰老模型大鼠的免疫 衰老（实验一）；探讨“双固一通’’针灸法对不同浓度百白破疫苗免疫大鼠 增强其疫苗免疫效应的作用，摸索针灸提高疫苗免疫效应的最佳疫苗浓度 （实验二）；检测Ｄ一半乳糖诱导衰老模型大鼠衰老相关指标的改变，鉴定 免疫衰老模型构建成功（实验三）；将百白破疫苗免疫衰老模型及正常大鼠，采用“双固一通”针灸法处理，探讨针灸是否能提高大鼠对疫苗的免疫应答效应，发挥疫苗佐剂的作用及延缓免疫衰老的效应（实验四）。方法： 实验一：雄性ＳＰＦ级ＳＤ大鼠４０只，随机取３０只大鼠经皮下注射Ｄ一 半乳糖４２ｄ制作衰老大鼠模型，剩余１ Ｏ只为正常对照组。造模结束后模型组再随机分为双固一通组（“关元’’、“后三里”穴接电针，“百会’’穴毫针针刺）、针刺对照组（“委中＂、“水分＂穴接电针，“印堂”穴毫针针刺）、衰老模型组，每组１ ｏ只大鼠。经３周治疗后处死动物检测脾脏指数、胸 腺指数、流式细胞法检测ＣＤ８＋Ｔ细胞占Ｔ细胞的百分率及ＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ占ＣＤ８＋Ｔ细胞的百分率。 实验二：雌性ＳＰＦ级Ｗｉ ｓ ｔａｒ大鼠４８只，随机分组为六组：１／１ ０疫 苗免疫针灸组、１／１０疫苗免疫对照组、１／２０疫苗免疫针灸组、１／２０疫苗免疫对照组、１／４０疫苗免疫针灸组、１／４０疫苗免疫对照组。每组注射相 应浓度的百白破疫苗，针灸组电针刺激大鼠“后三里竹、“百会”、“关元竹穴，并施以艾灸处理３周，第５周取材，心脏采血分离血清，用Ｖｅｔｏ细胞法测定白喉抗毒素的效价；ＭＴＳ比色法检测脾细胞特异性增殖能力；流 式细胞法检测ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值；ＲＴ－ＰＣＲ检测脾细胞热休克蛋白７ ｏ（ＨＳＰ７０）ｍＲＮＡ的相对表达量（同ＧＡＰＤＨ比较）。实验三：雌性ＳＰＦ级Ｗｉ Ｓ ｔａｒ大鼠２ ｏ只，随机取ｌ Ｏ只大鼠皮下注射 Ｄ一半乳糖４２ｄ制作衰老大鼠模型，剩余１０只为正常对照组。造模结束后， 进行水迷宫实验，实验结束后处死动物，检测血清超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的活性及甘油三脂（ＴＧ），胆固醇（ＣＨＯＬ）的含量，ＲＴ－ＰＣＲ检测脾细胞 ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ的相对表达量。 实验四：雌性ＳＰＦ级Ｗｉ Ｓ ｔａｒ大鼠４ ０只，随机分成４组：模型免疫针 灸组、模型免疫对照组、正常免疫针灸组、正常免疫对照组。模型免疫组 用Ｄ一半乳糖颈背部皮下注射６周，构建衰老大鼠模型。正常免疫组注射 等量生理盐水，第７周所有大鼠注射百白破疫苗，电针刺激大鼠“后三里’’、 “百会’’、“关元＂穴，并施以艾灸处理３周，针灸治疗结束后再继续喂养 ２周，至第１２周处死所有大鼠，心脏采血，分离血清检测ＳＯＤ活性、血 脂和蛋白含量，用Ｖｅｒｏ细胞法测定白喉抗毒素的效价；流式细胞法检测 ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值；ＲＴ－ＰＣＲ检测脾细胞ＨＳＰ７０ｍＲｂｌＡ的相对表达量。 结果： 实验一：衰老模型组大鼠脾脏指数、胸腺指数低于正常对照组（尸＜ Ｏ．０５）；Ｃ０８＋ＣＤ２８一Ｔ细胞占ＣＤ８＋Ｔ细胞百分率衰老模型组明显高于正常对照 组（尸＜０．０１）；ＣＤ８＋Ｔ细胞占Ｔ细胞百分率衰老模型组亦明显高于正常对 照组（尸＜０．０１）。双固一通组脾脏指数、胸腺指数较衰老模型组升高（尸 ＜０．０５），而ＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ细胞占ＣＤ８＋Ｔ细胞百分率显著降低（尸＜０．０１）； 针刺对照组ＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ细胞占ＣＤ８＋Ｔ细胞的百分率较衰老模型组亦降低（尸 ＜０．０１）；但双固一通组比针刺对照组的ＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ细胞占ＣＤ８＋Ｔ细胞比 值降低得更为显著（尸＜０．０５）。 实验二：１／２０疫苗免疫针灸组的抗体效价明显高于１／２０疫苗免疫对 照组（尸＜０．０１）；１／１０疫苗免疫针灸组和１／１０疫苗免疫对照组抗体效价 均高，无明显差异；而１／４０疫苗免疫针灸组和１／４０疫苗免疫对照组抗体 效价亦无明显差异。脾细胞增殖实验表明疫苗本身对细胞有毒性，不适宜 做特异性增殖实验，流式细胞法检测１／２０疫苗免疫针灸组ＣＤ４＋Ｔ细胞 ／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值较其对照组略有增加（尸＞０．０５）；ＲＴ－ＰＣＲ结果显示１／２０ 疫苗针灸组脾细胞ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ的相对表达量较其对照组略有升高（尸＞Ｏ．０５）。实验三：衰老模型组大鼠水迷宫实验（空间探索实验）经过平台次数Ｉｌ（尸＜Ｏ．０５）和有效区停留时间（尸＜０．０１）明显少于正常对照组；血清ＳＯＤ 活性明显低于正常对照组（尸＜０．０１），ＴＧ和ＣＨＯＬ含量高于正常对照组（尸 ＜Ｏ．０５）；脾细胞ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量低于正常对照组（尸＜Ｏ．０５）。实验四：模型免疫对照组较正常免疫对照组的ＳＯＤ活性明显降低（尸 ＜０．０１）；ＴＧ和ＣＨＯＬ的含量升高（尸＜ｏ．０５）；总蛋白（ＴＰ）和球蛋白（ＧＬＢ） 含量降低（尸＜０．０５）；抗体效价明显降低（尸＜Ｏ．０１）；ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ 细胞比值明显降低（尸＜０．０１）；脾细胞ＨＳＰ７ ０ ｍＲＮＡ的相对表达量明显降 低（尸＜ｏ．０１）。模型免疫针灸组较模型免疫对照组的ＳＯＤ活性升高（尸＜ ｏ．０５）；ＴＧ和ＣＨＯＬ含量降低（尸＜ｏ．０５）；ＴＰ和ＧＬＢ含量升高（尸＜０．０５）；抗体效价明显升高（尸＜０．０１）；ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值升高（尸＜Ｏ．０５）； 脾细胞ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ的相对表达量升高（尸＜０．０５）。正常免疫针灸组较正常免疫对照组的ＴＧ和ＣＨＯＬ含量降低（尸＜０．０５）；ＴＰ和ＧＬＢ含量升高（尸＜０．０５）；抗体效价升高（尸＜０．０５）。 结论：实验一：电针可通过提高胸腺指数、脾脏指数及调节Ｔ细胞亚群的比例，延缓Ｄ一半乳糖诱导衰老模型大鼠的免疫衰老。实验二：针灸能提高大鼠对百白破疫苗的免疫效应，且最佳疫苗免疫 浓度为１／２０倍，具有作为新型疫苗佐剂的潜能。实验三：Ｄ一半乳糖能降低大鼠认知水平，增高血脂，降低氧化应激水 平及应激蛋白ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ表达，是一种构建衰老动物模型的较好方法。 实验四：针灸能改善衰老大鼠的衰老相关生化指标，且能提高衰老机体对百白破疫苗的体液免疫和细胞免疫应答效应，其机制可能与通过增加内源性佐剂物质ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ表达有关。综上所述，针灸能有效延缓免疫衰老，且能通过诱生内源性佐剂 ＨＳＰ７０的表达，提高衰老模型大鼠和正常大鼠对百白破疫苗的体液免疫应 答和细胞免疫应答效应，发挥疫苗佐剂的效用及延缓免疫衰老的作用。关键词：免疫衰老；百白破疫苗；针灸；ＨＳＰ７０；佐剂Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒ ｉ ｍｅｎｔａ ｌ ｍｅｔｈｏｄ ｉ ｍｐｒｏｖ ｉ ｎｇ ｔｈｅ ｉ Ｓｐｅｃｉａ ｖａｃｃｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｉＲｅｉ１１１ｍｕｒｌｅｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｄｅ Ｉ ａｙ ｉ ｎｇ ｔｈｅｍｍｕｎｏｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｒａｔｓＩ ｉｔｙ：Ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ―Ｍｏｘ ｉ ｂｕｓｔ ｉａｏｏｎＡｕｔｈｏｒ：Ｘ ｉＬ ｉ ｎｇＴｕｔｏｒ：Ｐｒｏｆ．Ｗａｎｇ ＨｕａＡＢＳＴＲＡＣＴＯｂｊｅｃｔ ｉｖｅ：（１）Ｔｏ ｄｉＳＣＵＳＳｔｈｅＤｏｕｂｌｅ―ｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇａｎｄ Ｏｎｅ―ｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇｃｏｕｒｓｅａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｈｅｔｈｅｒ ｃｏｕｌｄ ｄｅｌａｙ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎ ａｇｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｒａｔｓｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙＤ―ｇａｌａｃｔｏｓｅ；（２）Ｔｏ ｄｉ ＳＣＨＳＳａｎｄ ｉｎｔｈｅｏｆ ｍｅｔｈｏｄｔｈｅｏｎＤｏｕｂｌｅ―’ｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅＯｎｅ―。ｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｒａｔＳｔｅｓｔｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＴａＰｖａｃｃｉｎｅ；（３）Ｔｏｔｈｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎｄｅｘｅｓ ｏｆ ａｇｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｒａｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｄ―ｇａｌａｃｔｏｓｅ， ａｎｄｔｏｉｄｅｎｔ ｉｆｙｔｈｅｍｏｄｅｌ Ｓａｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄ；（４）ＴｏｕｓｅｔｈｅＤｏｕｂｌｅ――ｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇ ａｎｄ Ｏｎｅ――ｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｇｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｒａｔＳ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌｒａｔｓ，ｔｏ ｄｉｏｎ ＳＣＵＳＳｏｎｂｏｔｈａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｗｈｅｔｈｅｒａｓｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｏｒａｔＳ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄａｄｊｕｖａｎｔ，ｔｈｅｄｉＳＣＵＳＳｃｏｕｒｓｅａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｗｈｅｔｈｅｒｒａｔｓ．ｃｏｕｌｄｄｅｌａｙｉｍｍｕｎｏｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ：ｉｎ ａｇｉｎｇ ｍｏｄｅｌ（１）４０ ＳＤｍａｋｅｔｈｅｒａｔｓ，ｍａ ｌｅ ｏｎｌｙ，３０ ｒａｔｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｔｏｌｙａｇｅｉｎｇ ｆｏｒｍｏｄｅｌｒａｔｓｂｙｉｎｊｅｃｔｅｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ３ｗｉ ｔｈＤ―ｇａｌａｃｔｏｓｅ４２ｄ，ａｎｄｗｅｒｅｇｒｏｕｐｓ：ｄｏｕｂｌｅｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇ―ｏｎｅＨｏｕｓａｎｌ ｉＳＴ３６ｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇ ＢａｉｈｕｉＧＶ２０ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｇｒｏｕｐ（ＧｕａｎｙｕａｎＣＶ４，ｅｌｅｃｔｒｏ―ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅａｎｄｐｏｉｎｔＳ，ｕｓｅｄＩＶｔｈｅｒａｐｙｏｎＧｕａｎｙｕａｎＣＶ４ ａｎｄ Ｈｏｕｓａｎｌ ｉＳＴ３６ｏｎｌｙ）；ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ＷｅｉｚｈｏｎｇＢＬ４０，ＳｈｕｉｆｅｎＣＶ９ ａｎｄ ＹｉｎｔａｎｇＧＶ２９，ｕｓｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏ―ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｔｈｅｒａｐｙｏｎＷｅｉｚｈｏｎｇＢＬ４０ ａｎｄ ＳｈｕｉｆｅｎＣＶ９ｗｅｒｅｏｎｌｙ）；ａｇｅｉｎｇｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｎ，ｔｈｅ ｌａｓｔ １０ ｒａｔｓｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．ｗｅｒｅＷｉ ｔｈ ３－ｗｅｅｋ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｓｐｌｅｅｎ ｉｎｄｅｘ ａｎｄ ｔｈｙｍｕｓ ｉｎｄｅｘ ａｎｄ ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｂｓｅｒｖｅｄ； ｏｆｏｆｗｅｒｅＣＤ８＋Ｔ／Ｔｔｅｓｔｃｅｌ１ａｎｄｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ／ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌ １（２）ＷｉＳｔａｒｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ． ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ６ ｇｒｏｕｐｓ，ｆｅｍａｌｅｒａｔｓ４８ｗａｓｎａｍｅｌｙ：１／１０ｃｏｎｔｒｏｖａｃｃｉｎｅ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｖａｃｃｇｒｏｕｐ；１／１０ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｍｍｕｎｅ ｇｒｏｕｐ；１／２ ０ｖａｃｃｌ ｇｒｏｕｐ；１ １２ ｏ ｃｏｎｔｒｏｌｉｎｅｉｍｍｕｎｅｖａｃｃａｃｕｐｕｎｃ ｔｕｒｅｉｎｅｉｍｍｕｎｅｇｒｏｕｐ；１／４０ｉｎｅ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｗｅｒｅｇｒｏｕｐ；１／４０ｖａｃｃｉｎｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｔｒ０１ ｇｒｏｕｐ．Ｅｖｅｒｙ ｇｒｏｕｐ ｖａｃｃｉｎｅ，ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐｓ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｍｏｘｉｂｕｓ ｔ ｉｏｎｏｎ ｗｅｒｅｉｎｊｅｃｔｅｄ Ｗｉ ｔｈ ＤＴａＰｔｒｅａｔｅｄ Ｗｉ ｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏ―ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅＢａ ｉＨｕｉＧＶ２０ Ｈｏｕｓａｎｌ ｉＳＴ３６ ａｎｄ ＧｕａｎｙｕａｎＣＶ４ｗｅｒｅｆｏｒ ３－ｗｅｅｋ．Ａｔ ５协ｗｅｅｋ，ａ １ １ ｒａｔｓｓｅｐａｒａｔ ｉｏｎ，ｄｉ ｐｈｔｈｅｒ ｉａｃｏｌ ｌｅｃｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ，ｓｅｒｕｍｗｅｒｅｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ ａｎｔ ｉｂｏｄｙ ｔ ｉ ｔｅｒｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙＶｅｒｏ ｃｅｌ １ ｓｅｐａｒａｔ ｉｏｎ．Ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ １ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉＣ ｐｒｏｌ ｉｆｅｒａｔ ｉｏｎｉｎｄｅｘ ｒａｔｉｏｗａｓｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＭＴＳ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉＣｍｅｔｈｏｄ，ＣＤ４＋Ｔ／ＣＤ８＋Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｗａｓｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｆ１０Ｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓＳｉｏｎ ｏｆｗａｓｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ ＨＳＰ７０ｍＲＮＡｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ―ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ（ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉ ｔｈＧＡＰＤＨ）．（３）Ｗｉ ＳｔａｒｒａｔＳ ２０，ｆｅｍａｌｅ ｏｎｌｙ，１０ ｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄｔｏ ｍａｋｅ ａｇｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｂｙｉｎｊｅｃｔｅｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｗｉｔｈ Ｄ―ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｆｏｒｃｏｎｔｒ０１ ｇｒｏｕｐ．Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ Ｍｏｒｒｉ Ｓ ｗａｔｅｒｓｅｒｕｍ４２ｄ，ｔｈｅ ｒｅｓｔｍａｚｅ，ｔｈｅｗｅｒｅ ｓｅｒｕｍｉｓｉｎ ｎｏｒｍａｌａｃｔＳＯＤｉｖｉ ｔｙ，ｔｈｅ１ ｉｐｉｄ，ＴＧ ａｎｄ ｔｈｅ ＧＨＯＬ １ｅｖｅｌｔｅｓ ｔｅｄ，ｔｈｅ ｒｅｌａｔ ｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓＳ ｉｏｎ ｏｆｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ ＨＳＰ７０ｍＲＮＡｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ―ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ．（４）Ｗｉ Ｓｔａｒ ｒａ ｔ Ｓ４８，ｆｅｍａ ｌｅ ｏｎｌ ｙ，ａ ｌ １ ｒａｔ Ｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌ ｙ ｄ ｉ ｖｉ ｄｅｄＶｉｎｔｏ ４ ｇｒｏｕｐｓ，ｎａｍｅｌｙ：ｍｏｄｅｌｉｍｍｕｎｅ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｏｘｉｂｕｓ ｔ ｉｏｎｇｒｏｕｐ；ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｅｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ；ｎｏｒｍａｌ ｍｏｘｉ ｂｕｓ ｔ ｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ａｎｄｗａｓ ｎｏｒｍａｉｍｍｕｎｅａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ａｎｄｓａ１ ｉｍｍｕｎｅｃｏｎｔ ｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ｎｏｒｍａ ｉｌ ｉｎｅｉｎｊｅｃｔｅｄｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｙ ｔｏ ｒａｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌｉｍｍｕｎｅ ｇｒｏｕｐ，ａｎｄｎ――ｇａｌａｃｔｏｓｅｇｒｏｕｐｗａｓｉｎｊｅｃｔｅｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｙｔｏ ｒａｔｓＳ ｗｅｒｅｉｎ ｔｈｅｉｍｍｕｎｅｍｏｄｅｌｆｏｒ ６ ｗｅｅｋｓ．Ａｔ ７他ｗｅｅｋ，ａ １ １ ｒａｔ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉ ｔｈｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉ ｔｈ ＤＴａＰｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄｖａｃｃｉｎｅ，ａｎｄ ｍｏｘｉｂｕｓ ｔ ｉｏｎｏｎｅｌｅｃｔｒｏ―ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅＧｕａｎｙｕａｎＣＶ４，Ｈｏｕｓａｎｌ ｉＳＴ３６ ａｎｄ ＢａｉｈｕｉＧＶ２０ ｐｏｉｎｔｓ ｆｏｒｒａｔｓ ｗｅｒｅ３－ｗｅｅｋ ｅｘｐｅｃｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐｓ．Ａｆｔｅｒ ｆｅｅｄ ｆｏｒ ２ ｗｅｅｋｓ，ａ１ １ ｃｏｌ ｌｅｃｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ，ｓｅｒｕｍａｎｔ ｉｂｏｄｙ ｔ ｉ ｔｅｒｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔ ｉｏｎ，ｄｉｐｈｔｈｅｒ ｉａｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｖｅｒｏ ｅｅｌ １ ｓｅｐａｒａｔ ｉｏｎ；Ｔｈｅ ｂｌｏｏｄｓｅｒｕｍ１ ｉｐｉｄ，ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉ ｔｙ ｏｆＳＯＤｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄ；ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｅｘｐｒｅｓＳ１ ｒａｔ ｉｏｗａｓｔｅｓ ｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔ ｉｖｅｗａｓｉｏｎ ｏｆ ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ ＨＳＰ７ ０ ｍＲＮＡｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ―ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：（１）Ｃｏｍｐａｒｅ ｗｉ ｔｈ ｎｏｒｍ １ｃｅｎｔ ｒｏｌｗｅｒｅｇｒｏｕｐ，ｉｎ ａｇｅ ｉｎｇ ｍｏｄｅ １ ｇｒｏｕｐ，ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓｐｌｅｅｎ ｉｎｄｅｘ ａｎｄ ｔｈｙｍｕｓ ｉｎｄｅｘ ｏｆｌｏｗｅｒ（尸＜０．０５）；ｔｈｅＣＤ８＋ＣＤ２８‘Ｔ／ＣＤ８＋Ｔ ｅｅｌ ｌｏｆｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｒｅｍａｒｋａｂｌｙ（Ｐ＜０．０１）：ｔｈｅ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ（尸＜０．０１）．ｄｏｕｂ ｌｅ ｉｎｄｅｘ ｏｆｒｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅＣＤ８＋Ｔ／Ｔａｇｅ ｉｎｇｅｅｌ ｌｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒ ｉｎＣｏｍｐａｒｅｗｉ ｔｈｍｏｄｅ ｌｇｒｏｕｐ，ｉｎｆｏｒｃ ｉｎｇ―ｏｎｅ ｔｈｙｍｕｓ ｉｎｄｅｘｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｇｒｏｕｐ，ｓｐｌｅｅｎ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）；ｔｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ／ＣＤ８＋Ｔ ｅｅｌ １ｇｒｏｕｐ，ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ（尸＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅ ｗｉ ｔｈ ａｇｅｉｎｇ ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ／ＣＤ８＋Ｔｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆｅｅｌ １ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙｔｏｏ（尸＜０．０１）．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｄｏｕｂｌｅ ｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇ―ｏｎｅｍｏｒｅ ＳＣＤ８＋ＣＤ２８一／ＣＤ８＋Ｔａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｅｅｌ １ｉｎｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｍｕｃｈｉｇｎｉｆ ｌｅａｎｔ ｌｙ． ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ（２）Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ１／２０ ｖａｃｃｉｎｅｉｍｍｕｎｅＶＩａｎｔ ｉｂｏｄｙＳｔ ｉ ｔｅｒｉｎ１／２０ ｖａｃｃｉｎｅｉｍｍｕｎｅａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｇｒｏｕｐｉＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｌｙｈｉｇｈｅｒ（尸＜０．０１）；ｔｈｅａｎｔ ｉｂｏｄｙ ｔ ｉ ｔｅｒ ｉｎ１／１０ ｖａｃｃｉｎｅａｒｅｉｍｍｕｎｅ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｈｉｇｈｅｒ，ａｎｄ ｔｈｅｒｅｗａｓ ｎｏ ｓ１／１０ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓ ｂｏｔｈｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ；ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄｔｈｅ ａｎｔ ｉｂｏｄｙ ｔ ｉ ｔｅｒ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ１／４０ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｍｍｕｎｅｎｏ ｓ１／４０ｉｍｍｕｎｅｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｈａｖｅｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．Ｔｈｅ ｉＳ ｔｏｘｉｃ ｆｏｒｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌ ｌ Ｓ ａｎｄ ｉＳｐｒｏｌ ｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｒｉｔｆｏｕｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｎｏｔ ＳＵｉ ｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃ ｉｆｉ ｃ ｐｒ０１ｉｆｅｒａ ｔ ｉｏｎ ｅｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉ ｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆＣＤ４＋Ｔ／ＣＤ８＋Ｔｃｅｌ １ ｉｎ１／２０ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｍｍｕｎｅａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｇｒｏｕｐｉｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｓ１ｉｇｈｔｌｙ（尸 １１２０＞０．０５）；ｔｈｅ ｒｅｌａｔ ｉｖｅｖａｃｃｉｎｅＳｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｎｏｃｙｔｅ ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ ｉｎ ｇｒｏｕｐｉｍｍｕｎｅａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ―ＰＣＲｉｎｃｒｅａｓｅｄ１ ｉ ｇｈｔｌｙ（尸＞０．０５）．ｓｐａｃｅ ａｎｄ（３）Ｃｏｍｐａｒｅ ｗｉ ｔｈ ｎｏｒｍ １ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｌｏｒｅｓｅａｒｃｈ １ａｔｅｎｃｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｒａｔＳ ｉｎ ｗａｔｅｒｍａｚｅｔｅｓｔｓｈｏｒｔｅｎｅｄｒｅｍａｒｋａｂｌｙ（尸＜０．０１）：ｓｅｒｕｍ ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ ＜０．０１）；ｔｈｅ ＴＧ ａｎｄ ｔｈｅ ＧＨＯＬ ｌｅｖｅｌ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（尸＜０．０５）；ｔｈｅ ｒｅｌａｔ ｉｖｅｅｘｐｒｅｓＳ ｉｏｎ ｏｆ ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅＨＳＰ７０ｍＲＮＡｄｅｃｒｅａｓｅｄ（尸＜０．０５）．（４）Ｃｏｍｐａｒｅ ｗｉ ｔｈｎｏｒｍａ１ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｉｎ ｍｏｄｅｌｉｍｍｕｎｅａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ＳＯＤ ａｃｔ ｉｖｉ ｔｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄｒｅｍａｒｋａｂｌｙ（尸＜０．０１），ＴＧＣＨＯＬ ｌｅｖｅｌｉｎｃｒｅａｓｅｄ（尸＜０．０５）；ＴＰ ａｎｄ ＧＬＢ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（尸＜０．０５）；Ｓａｎｔ ｉ ｂｏｄｙ ｔ ｉ ｔｅｒ ｄｅｃｒｅａｓｅｄｉ ｇｎｉｆｉ ｃａｎｔｌｙ（尸＜０．０１）；ＣＤ４＋Ｔ／ＣＤ８＋Ｔｃｅ１ ｌ ｏｆｄｅｃｒｅａｓｅｄｒｅｍａｒｋａｂｌｙ（尸＜０．０１）；ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓＳｉｏｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｇｒｏｕｐ，ｓｐｅｎｏｃｙｔｅ ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡｒｅｍａｒｋａｂｌｙ（尸＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅ ｗｉ ｔｈｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｅｌａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｍｏｄｅｌ ｍｏｘｉｂｕｓｉｍｍｕｎｅｔｃｏｎｔｒ０１ａｎｄｉｏｎ ｇｒｏｕｐ，ＴＧ ａｎｄ ＣＨＯＬａｃｔｄｅｃｒｅａｓｅｄ（尸＜０．０５）；ＴＰ ａｎｄ ＧＬＢ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）；ａｎｔ ｉｂｏｄｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ（尸＜０．０５）；ＳＯＤｔ ｉ ｔｅｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄＳｉｖｉ ｔｙｉｇｎｉｆｌｅａｎｔｌｙ（尸＜０．０１）；ＣＤ４＋Ｔ／ＣＤ８＋Ｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（ＰＶＩＩ＜０．０１）；ｔｈｅ ｒｅｌａｔ ｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｎｏｃｙｔｅ ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｄ（尸＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅ ｗｉ ｔｈ ｎｏｒｍｉｎｏｒｍａｌ ｉｍｍｕｎｅａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅａｎｄｍｏｘｉｂｕｓｔ ｉｏｎｇｒｏｕｐ，ＴＧａｎｄＣＨＯＬｔｉｔｅｒｄｅｃｒｅａｓｅｄ（尸＜０．０５）；ＴＰ ａｎｄ ＧＬＢ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）；ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（尸＜０．０５）．Ｃｏｎｅ ｌｕｓ ｉｏｎ：（１）Ｅｌｅｃｔｒｏ―ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｃｏｕｒｓｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｃａｎｄｅｌａｙ ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎ ａｇｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｒａｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｄ―ｇａｌａｃｔｏｓｅ，ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｏｆｓｐｌｅｅｎ ｉｎｄｅｘ ａｎｄ ｔｈｙｍｕｓ ｉｎｄｅｘ，ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｒ ｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔ ｉｏｎ ｏｆ Ｔｃｅｌ １ｓｕｂｇｒｏｕｐ．（２）Ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｏｘｉｂｕｓ ｔ ｉｏｎ ａｄｊｕｖａｎｔ，ｂｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ ｉｏｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｃｏｕｌｄｂｅａｎｅｗｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｒａｔＳ，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍｉｓ１／２０． ｉｎｊｅｃｔ ｉｏｎ ｏｆ Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅｉｎ ｒａｔｓ，ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｔ ｉＳａ ｃａｎ（３）Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ＨＳＰ７０ｍＲＮＡｉｍｐａｉｒｔｈｅｔｈｅｂｌｏｏｄ１ ｉｐｉｄ，ｒｅｄｕｃｅｏｎｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ，ｔｈｕｓｂｅｔｔｅｒｍｅｔｈｏｄｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｒａｔＳ．（４）Ｐｒｏｂａｂｌｙ ｂａｓｅｄｏｎｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ，ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅａｎｄ ｍｏｘｉｂｕｓｔ ｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎｄｅｘｅｓ，ａｎｄｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉ ｔｙ ａｎｄ ｃｅＩ ｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙｏｎａｇｉｎｇ ｒａｔｓ． Ｔｏｓｕｍｕｐ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｉｎｄｕｃｅｃａｎｔｈｅＨＳＰ７０ｅｘｐｒｅｓＳ ｉｏｎ，ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｏｘｉｂｕｓ ｔ ｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｄｅｌａｙ ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ， ｉｎｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎｄｅｘｅｓ，ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｉ ｔｙ ｅｆｆｅｃｔｏｎｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉ ｔｙ ａｎｄ ｅｅｌ ｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉ ｔｙａｇｉｎｇｒａｔｓａｎｄｎｏｒｍｌｒａｔＳ，ａｎｄａｓｖａｃｃｉｎｅａｄｊｕｖａｎｔ ｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓＳ．ｖａｃｃＫｅｙｗｏｒｄ：ｍｏｘＩ ｍｍｕｎｏｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ：ＤＴａＰｉＲｅ：Ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅａｎｄｉ ｂｕｓｔ ｉｏｎ：ＨＳＰ７０；Ａｄｊｕｖａｎｔ．ＶＩＩＩ缩略词表ＩＸＸ针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究．＾‘－Ｊ‘刚舌２ ０１０年中国人口普查结果６ ｏ岁及以上人口占１ ３．２ ６％，其中６５岁及以上人口占８．８ ７％，按国际上把６ ０岁以上的人口占总人口比例达到１ ０％，或６５岁以上人口占总人口的比重达到７％作为国家进入老龄化社会的标准，我国已进入老龄化社会，且老龄化进程日益加剧。随之而来衰 老及其相关疾病已经成为当今日益严重的社会和医疗问题。由于衰老机体 免疫功能失衡而导致免疫相关疾病的频发且更趋严重ｎ１，老年人免疫防御 功能降低，易发感染性疾病，且致死率高乜１，同时由于其对疫苗的应答水 平降低进一步导致其防控形势严峻∞１；老年人免疫监视功能障碍，易发肿 瘤Ｈ１；老年人免疫调节功能紊乱，易发慢性炎症性疾病及自身免疫病碡１。 因此，研究衰老的机理，开发延缓衰老的药物和方法，增强机体抗病能力，提高老年个体健康质量，预防疾病发生，不仅有益于个人，更有利于整个社会的和谐稳定和可持续发展。 人体老化是生命过程中不可抗拒的自然规律，西医认为机体的衰老是 体内各种器官组织和细胞随着年龄的增加而伴随出现的不可逆转的功能 衰退，逐渐趋向死亡的现象。而免疫衰老则是免疫系统全方位多系统的并 由基因严格控制的循序渐进的自然过程，其普遍性，内因性，进行性和有 序性被普遍接受№１，表现为随着年龄的进展免疫系统进行性损伤，对感染 的控制能力降低和对疫苗的应答能力减弱ｎ１。 中医认为衰老是指随年龄的增长，阳气衰弱，阴精亏损，气血不足，出现脏腑功能减退，气血阴阳失调，组织细胞缓慢性，进行性，退化性功能降低和发生紊乱的全身性，多系统，循序渐进的功能衰退过程的综合表现ｎ１。其进程取决于先天禀赋与后天调摄，其病机以虚为主，又以气虚、阳虚多见。衰老机体正气不固，邪气易犯的病 机与机体免疫功能失衡，抗病能力降低的免疫衰老如出一辙。 中西医对衰老的理解和阐述有很多相似之处，那么将中医养生保健方 法和治未病的理念用于延缓西医免疫衰老相关疾病，可望具有相当成效。湖北中医药大学２０１２届博士学位论文无论中医古籍文献还是临床科研都证实针灸医学，能调动人体潜在的整体 平衡能力、有效促使机体向自稳方向调整，具备有效延缓衰老的功效眇’１０１。而我们特别关注一点，即衰老机体对疫苗的应答能力降低，如果针灸 能延缓衰老，那么也可能能够提高衰老机体对疫苗的应答能力。如果针灸 能提高机体对疫苗的应答能力，那么针灸是否又可作为一种新型疫苗佐 剂，而将其引入疫苗研究领域，为中西医结合开辟又一新的方向，同时也 将进一步促进针灸效应机制的研究。本课题首先证实针灸是否能有效延缓Ｄ一半乳糖诱导的衰老模型大鼠的免疫衰老。其次探索针灸是否能提高正常大鼠对百白破疫苗的免疫效 应，及摸索疫苗最佳免疫浓度。再次进一步验证Ｄ一半乳糖诱导的衰老模 型符合衰老指针，可作为可靠的衰老模型进行研究。最后将疫苗最佳免疫 浓度免疫衰老模型大鼠，以导师王华教授“双固一通升针灸法进行干预， 探讨针灸是否能提高衰老模型大鼠对百白破疫苗的免疫应答效应，及进一 步探讨针灸发挥疫苗佐剂可能的效应机制。针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究实验一“双固一通＂电针法延缓衰老模型大鼠免疫衰老的实验研究免疫衰老表现为随着年龄的进展免疫系统进行性损伤。而免疫系统中 的Ｔ细胞及亚群的数量和功能的改变又是免疫衰老的重要表征，衰老机 体ＣＤ８＋Ｔ／Ｔ细胞比值是升高的，其中又以无能的ＣＤ８＋ＣＤ２ ８一Ｔ数量升高 为主…１。本实验拟从胸腺指数、脾脏指数、Ｔ细胞及其亚群入手探讨“双 固一通’’电针法是否能延缓Ｄ一半乳糖诱导衰老模型大鼠的免疫衰老，为 针灸应用于衰老的临床防治提供一定的实验依据。。１材料及方法１．１实验材料１．１．１实验动物 ＳＰＦ级ＳＤ（ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ）大鼠，雄性，体重１ ８ ０９－２ ００９购于由河北省实验动物中心，许可证号：ＳＣＸＫ（冀）２００８－１－００３。 １．１．２实验试剂 ◆Ｄ一半乳糖：购于上海国药集团化学试剂有限公司，批号Ｆ２０１００８１２，临用前用用ｏ．９％氯化钠注射液溶解，配成终浓度为２００ｍｇ／ｍＬ溶液使用。◆水合氯醛：武汉市合昌化工有限公司，临用前用０．９％氯化钠注射液溶 解，配成终浓度为１００ｍｇ／ｍＬ溶液使用。 ◆荧光抗体：Ａｌｅｘａａｎｔ ｉ－ｒａ ｔｆｌｕｏｒ６４７ ａｎｔｉ－ｒａｔｕＣＤ３（浓度为０．５“ｇ／“Ｌ）；ａｎｔ ｉ－ｒａｔＦＩＴＣｕＣＤ２８（浓度为Ｏ．５ｇ／ｕ Ｌ）；ＰＥＣＤ８（浓度为０．２ｇ／“Ｌ）单克隆抗体购于美国ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司。◆红细胞裂解液：购于江苏碧云天生物技术研究所。◆ｐＨ７．２的ＰＢＳ溶液（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ）：ＮａＣｌ８．Ｏ ｇ，ＫＣｌ ０．２ ｇ，Ｎａ：ＨＰＯ。１．４２ｇ，ＫＨ：ＰＯ ０．２４ｇ，加双蒸水溶解，定容至１０００ ｍＬ，１５磅高压灭菌后，４℃保存。 １．１．７实验仪器 电针仪，ＨＡＮＳ，ＬＨ２０２Ｈ型，北京华威有限公司生产；①０．３２ｍｍ×１５ｍｍ 华佗牌毫针，苏州医疗器械厂生产；大鼠固定衣、固定架和艾条，自制；湖北中医药大学２０１２届博士学位论文流式细胞仪，ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ，美国ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ生产；ＪＹｌ００２分析天平，上海精密科学仪器有限公司。ＬＤＺＸ－４０型立式电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。 １．２实验方法１．２．１实验动物分组 所有大鼠饲养在温度（１ ８－２５℃）和湿度（４５％－５５％）相对较为恒定 的动物饲养室，可自由摄食及饮水。ｓＤ大鼠４ Ｏ只，随机化分为４组，分组后各组动物适应性饲养１周后开始实验。 双固一通组（１０只）：注射Ｄ一半乳糖连续４２ｄ，造模后给予实验针刺处理；针刺对照组（１０只）：注射Ｄ一半乳糖连续４２ｄ，造模后给予对照针刺处理；衰老模型组（１ Ｏ只）：注射Ｄ一半乳糖连续４２ｄ造模；正常对照组（１０只）：注射等容积的生理盐水４２ｄ。 １．２．３实验动物造模 衰老大鼠造模方法：大鼠隔天称重，按体重每日给予３５ ０ｍｇ／ｋｇｎ２’１３１ 浓度为２００ｍｇ／ｍＬ的Ｄ一半乳糖于大鼠颈背部皮下注射，连续４２ｄ。正常对 照组同期进行颈背部皮下注射Ｏ．９％氯化钠注射液（Ｏ．５ｍＬ／只），每日一次。１．２．４针刺治疗处理造模结束后第二天开始电针治疗，大鼠穴位定位均参照华兴邦等所著 大鼠动物穴位图谱的研制ｎ耵，穴区剪毛备皮，穿自制鼠衣并固定架上固定。７５％医用酒精常规消毒不锈钢毫针，双固一通组取大鼠“关元静（剑突至耻骨联合下２／１３，向前斜刺３ｍｍ）、“后三里竹（膝关节后外侧腓骨小 头下５ｍｍ，直刺７ｍｍ）和“百会”（顶骨正中，向前斜刺２ｍｍ）穴，接ＨＡＮＳ 电针治疗仪，左右“后三里＂每天交替与“关元＂为一对电极，“关元升接负极，“后三里＂接正极（双侧“后三里＂隔日交替接电针），选用连 续波，频率２Ｈｚｎ５’“１，强度为ｌｍＡｎ＂，通电１０ｍｉｎ。针刺对照组取“印堂＂（两眉内侧中间凹陷处）、“委中＂（膝后区，胭横纹中点）和“水分力穴 （前正中线上，脐上ｌｍｍ），左右“委中升每天交替与“水分＂为一对电 极，“水分’’接负极，“委中”接正极（双侧“委中∞隔日交替接电针），针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究电针强度、频率和时间同双固一通组。每日１次，６日１疗程，疗程间休 息１ｄ，共３疗程，连续２１ｄ。衰老模型组和正常对照组以相同的方法、 相同时间段内抓取固定，悬挂１０ｍｉｎ，但不做电针处理。 １．２．５实验动物取材 ３周针刺处理治疗结束后禁食２４ｈ，第２ｄ终止实验。每组１ ｏ只称重， 每只大鼠按０．４ｍＬ／ｌ ＯＯｇ注射浓度为１ ＯＯｍｇ／ｍＬ的水合氯醛麻醉后，将大鼠浸泡于７５％医用酒精３ｍｉｎ，消毒后置于无菌手术台，大头丁固定四肢，７５％医用酒精消毒皮肤，使用高压灭菌的手术器械（眼科剪，眼科镊）开 胸，暴露心脏，用采血针和真空负压采血管（肝素抗凝），每只大鼠抽取５ｍＬ抗凝全血留做流式细胞检测。快速取胸腺、脾脏放入冻存管，置于分析天平中称重后，立即放入液氮中保存。 １．２．６胸腺指数和脾脏指数的计算 记录每只大鼠体重、胸腺重量和脾脏重量。计算公式：胸腺指数（ｍｇ／ｇ）＝（胸腺重量／体重）×１０００；脾脏指数（ｍｇ／ｇ）＝（脾脏重量／体重）×１０００。 １．２．７流式细胞法检测Ｔ细胞亚群的比例每１００“Ｌ抗凝全血中加入三种抗体：Ａ１ｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－ａｎｔｉ－ＣＤ３单克隆抗体２ｐＬ（浓度为０．５ｐｇ／“Ｌ），ＦＩＴＣ－ａｎｔ ｉ－ＣＤ２８单克隆抗体２“Ｌ（浓度为Ｏ．５“ｇ／¨Ｌ）和ＰＥ－ａｎｔ ｉ－ＣＤ８单克隆抗体５“Ｌ（浓度为ｏ．２“ｇ／“Ｌ）混匀闭光放置１５ｍｉｎ使抗体与相应细胞表面分子结合，每管加入ｌｍＬ红细胞 裂解液震荡混匀放置５ｍｉｎ破除红细胞，再加入３ｍＬ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）震荡混匀，以１０００ｒｐｍ／ｍｉｎ的转速离心５ｍｉｎ，去上清洗涤细胞一次，重复上述步骤再洗涤一次。最后加入４００ ｕ Ｌ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）滤膜过滤细胞后上机检测。 １．２．８统计学处理 所有实验数据用平均值±标准差（ｉ±ｓ）表示，使用ＳＰＳＳ１ ２．０软件进行统计学分析，采用方差齐性检验，组间比较采用ｆ检验，显著性水平设为Ｏ．０５。２结果湖北中医药大学２０１２届博士学位论文２．１大鼠脾脏指数和胸腺指数的比较 ２．１．ｉ各组大鼠胸腺指数的比较 用分析天平称量各只大鼠的胸腺重量除以各只大鼠体重，得出胸腺指数。由表Ｉ－Ｉ，图Ｉ－１可知，双固一通组和正常对照组胸腺指数高于衰老 模型组，有显著性差异（尸＜０．０５），双固一通组胸腺指数略低于正常对照 组，无显著性差异（尸＞０．０５），针刺对照组胸腺指数略高于衰老模型组，无显著性差异（尸＞０．０５）。 ２．１．２各组大鼠脾脏指数的比较 用分析天平称量各只大鼠的脾脏重量除以各只大鼠体重，得出脾脏指 数。由表ｉ－１，图Ｉ－２可知，双固一通组和正常对照组脾脏指数高于衰老模型组，有显著性差异（尸＜０．ＯＳ）；双固一通组脾脏指数略低于正常对照 组，无显著性差异（尸＞ｏ．０５）；针刺对照组脾脏指数略高于衰老模型组，无显著性差异（尸＞０．０５）。表Ｉ－Ｉ各组大鼠脾脏指数和胸腺指数的比较ｉ±ｓ（ｒａｇ／ｅ）注：与衰老模型组比较１’尺ｏ．０５；与正常对照组比较”ＪＤ＞０．０５；与衰老模型组比较”尸＞０．ＯＳ．图卜１各组大鼠胸腺指数直方图图卜２各组大鼠脾脏指数直方图针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究汪：Ａ：双固一通组：Ｂ：针刺对照组；Ｃ：正常对照组；Ｄ：衰老模型组２．２大鼠Ｔ细胞亚群流式细胞图谱的比较 ２．２．１各组大鼠ＣＤ８＋Ｔ细胞占Ｔ细胞百分率的比较 如表１－２、图１－３、图Ｉ－５所示，双固一通组、针刺对照组和衰老模 型组ＣＤ８＋Ｔ细胞占Ｔ细胞的百分率较正常对照组明显增高，有非常显著性差异（尸＜Ｏ．０１）；双固一通组和针刺对照组较衰老模型组稍有降低，无 显著性差异（尸＞０．０５）。 ２．２．２各组大鼠Ｃ０８＋ＣＤ２８一Ｔ细胞占ＣＤ８＋Ｔ细胞百分率的比较 如表ｉ－２、图１－４，图１－６所示，在ＣＤ３＋细胞（Ｔ细胞）群中，ＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ细胞占ＣＤ８＋Ｔ细胞的百分率，正常对照组、双固一通组和针刺对照组都较 衰老模型组明显降低，有非常显著性差异（尸＜０．０１）；双固一通组 ＣＩ）８＋ＣＤ２８一Ｔ细胞占ＣＤ８＋Ｔ细胞百分率低于针刺对照组，有显著性差异（尸＜Ｏ．０５）；双固一通组ＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ细胞占ＣＤ８＋Ｔ细胞百分率较正常对照组 略有增高，无显著性差异（尸＞Ｏ．０５）。表１－２各组大鼠ＣＤ８３＂细胞占Ｔ细胞百分率及ＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ细胞占ＣＤ８＋Ｔ细胞百分率的 比较更±ｓ（％）注：ＣＤ８＋Ｔ细胞／Ｔ细胞：与正常对照组比较”Ｐ＜０．０１；与衰老模型组比较２’尸＞０．０５ ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ细胞／ＣＤ８７细胞：与衰老模型组比较”Ｐ＜０．０１；与针刺对照组比较∞Ｐ＜０．０５；与正 常对照组比较”尸＞０．０５７湖北中医药大学２０１２届博士学位论文４ＡＢＣＤＡＢＣＤ图１－３ ＣＤ８７＂／Ｔ细胞直方图比较图１－４ ＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ／ＣＤ８＋Ｔ细胞直方图比较注：Ａ：双固一通组；Ｂ：针刺对照组；Ｃ：正常对照组；Ｄ：衰老模型组１０Ｉ４．８８。ｏ－－?．． Ｋ，：ｌ？；，ｏ瓣＿一。‘、’．．。２４ ２＇一正ＭＪ１ ０．２谚‰●．ｉ．．．ｊ≮努ｊ一’：：?ｉ．龋。２６．．’．！．：｜｜‘ｉ． ：‘。’：．，ｊ旷 ｕ乱∞ｏｕ．Ｈｊｋ旷ｊ：：ｉｉ＿ｉ：≮’：：；。’‘以‘一。ｓ一，ｊ∥?：蕞｝詈，萨芏；＋∥００Ｉ：．。：．？、：一一１－１。’：。．．１１０ｕ溱１０９１０ｔ璺１０＇ｔｊ√ｊ：豢：，０２ １０＇ｚ．’工笛３５．４１０１瓣 ：‘：ｊ，溪２．８３０．９：：＝≯１０＿ ＇０＇ １０ｚ ＦＬ牛Ｈ：ＣＤ３ １０ａＦＬＵ－０４７囊凄：≯ｊ＇Ｏ‘∞ＦＬｄ－Ｈ：ＣＤ３ＦＬＵ．６前’Ｑ Ｕ双固一通１０ｔ针剌对照 ５．１ １时?ｉ?５．３５。礴密．１７．７时．? 。● 。●＋● ●：．毒麟二“．，’一．”上，’．。：．２４．９岂∞８舻车星１０Ｉ叠簿鬈≯。壤曩掰既。；‘●｝ｏ?‘：．ｒ４’ｉ’？：‘√：．．。？矗；。．？山山∞ｂｕ主．９ｋ。蠢≯。：ｊ?舄＜ ；’．：：：！．．≯０：。”’－ｔ漆！。争３５．８１０Ｉ４１．２‘’１００ １０１ １０２ ＦＬ一＿Ｈ：Ｃ０３｝｝缫ｊ ≮Ｉ鬻＋４３．Ｊ‘？‘＋：ｊ＇Ｏｌ ＇０２ １０１ ＦＬ斗Ｈ：ＣＤ３ ＦＬＵ弓年７１０－ｉ＿２６．９１０＆ＦＬＵ．６岍’正常对照?―－－――－－－――――－－－―－―－―－―－―－―――－－－―－―－－―――－―－―――－――――－－―－―－―－－－―――－－―――－―一，衰老模型．ＩＩＩ―ＣＤ３图卜５各组大鼠ＣＤ８＋Ｔ细胞占Ｔ细胞百分率流式细胞双参数散点图注：ＰＥ―ａｎｔ卜ＣＤ８，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ一６４７一ａｎｔｉ－ＣＤ３分别标记ＣＤ８和ＣＤ３分子．每个点表示一个细胞，全图划分为四个象限，左下象限（ＬＬ）数值为双阴性细胞（ＣＤ８一ＣＤ３一）占淋巴细胞百分 率、左上象限（ＵＬ）数值为Ｙ轴阳性细胞（ＣＤ８＋ＣＤ３一）占淋巴细胞百分率、右下象限（ＬＲ）数８针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究值为ｘ轴阳性细胞（ＣＤ８一ＣＤ３＋）占淋巴细胞百分率、右上象限（ｕＲ）数值为双阳性细胞（ＣＤ８＋ＣＤ３＋） 占淋巴细胞百分率，ＣＤ８＋Ｔ细胞占Ｔ细胞百分率计算公式为：ＵＲ／ＵＲ＋ＬＲ”５３．２”３５．５蚺ｕ匕ｋ．∞ｇｕ藤ｊｌ’：ｊ 灌‘．．‘：．ｏ一‘．‘?’：＾＿７。：鬻叭蚺ｌＯ＿３．５５１０１ １０ｔＣＤ｝ＰＥ １ＤＩ７．７１０Ｉ针刺对照ｔＯ● ＇Ｏ‘６８．３１０Ｉ２５．６ｔＯＩ４９．２～，，●，●３３．８－一●星；；ｔ０２８１０Ｉ??Ｉ≮醇。一ｊ。，。■：墨‘？；？。。二苎；；１０２８ｔ口＇囊鳝００．？：＊’：－。’雾。：，．．ｔＯ－１．９４ＩＰ口 １０＇ １０ｌ４．２１，Ｏ－ ＇Ｏｊ １０●７．９５１００ Ｉｐ ｓ ＩＤ！ ＣＤ８．ｐｉ＝９．０２１０１Ｃ∞一ＰＥ’Ｏ●正常对照模型对照－?＿－＿＿－－?＿－－＿＿－＿－－－＿－＿＿＿－?＿?＿＿－＿－＿－＿＿＿－－－＿－－－－＿－－＿＿－＿＿－－＿＿－＿??＿?＿－－－??＿－＿－－＿－＿－－＿＿＿＿－－－＿＿??－＿－＿一ｌａ．＿ ＣＤ８图Ｉ－６各组大鼠ＣＤ８＋ＣＤ２８‘Ｔ细胞占ＣＤ８＋Ｔ细胞百分率流式细胞双参数散点图比较注：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７－ａｎｔｉ－ＣＤ３、ＰＥ－ａｎｔｉ－－ＣＤ８和ＦＴＩＣ－ＣＤ２８分别标记ＣＤ３、ＣＤ８和ＣＤ２８分子。左上图红色椭圆型中细胞为ＣＤ３＋细胞（Ｔ细胞）占外周血中淋巴细胞的百分率，右四图 进一步分析Ｔ细胞中各细胞亚群的比例。左下象限（ＬＬ）数值为双阴性细胞（ＣＤ８－ＣＤ２８一） 占Ｔ细胞百分率、左上象限（ＵＬ）数值为Ｙ轴阳性细胞（ＣＤ８‘ＣＤ２８＋）占Ｔ细胞百分率、右 下象限（ＬＲ）数值为ｘ轴阳性细胞（ＣＤ８＋ＣＤ２８一）占Ｔ细胞百分率、右上象限（ｕＲ）数值为 双阳性细胞（ＣＤ８＋ＣＤ２８＋）占Ｔ细胞百分率，ＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ细胞占ＣＤ８＋Ｔ细胞百分率计算公式为：ＬＲ／ＬＲ＋ＵＲ３小结本实验研究结果提示，“双固一通＂电针法可通过提高衰老机体的胸 腺指数和脾脏指数，明显降低衰老机体免疫无能的ＣＤ８＋ＣＤ２８一Ｔ细胞占Ｔ 细胞的百分率，有效延缓了免疫衰老的进程，且效果优于针刺对照组。９湖北中医药大学２０１２届博士学住论文实验二“双固一通”针灸法增强大鼠对百白破疫苗免疫效应的初探针灸可通过调节淋巴细胞功能，激活免疫应答，发挥增强机体免疫功 能和防治疾病的作用。但国内尚无针灸是否能增强机体对疫苗的免疫应答 效应的研究报道。本课题拟从经典白百破疫苗入手，探讨“双固一通”针 灸法是否能提高正常大鼠对白百破疫苗的免疫效应，及探索免疫的最佳疫 苗浓度，及探讨可能的调控机制，为针灸应用于临床疫苗领域提供实验依据。１材料及方法 １．１实验材料 １．１．１实验动物：ＳＰＦ级Ｗｉ ｓ ｔａｒ大鼠，雌性，体重２ ３０９－２８０９购于湖北 省实验动物研究中心，许可证号：ＳＣＸＫ（鄂）２００８－０００５。 １．１．２实验试剂 ◆疫苗：无细胞吸附百白破联合疫苗（由无细胞百日咳疫苗原液，白喉类 毒素原液及破伤风类毒素原液加氢氧化钠铝等佐剂制成，百日咳效价不低 于４．ＯＩＵ，白喉类毒素效价不低于３０１Ｕ，破伤风类毒素效价不低于４０１Ｕ） 由武汉生物制品研究所责任有限公司提供。 ◆荧光抗体：Ａｌｅｘａａｎｔｆｌｕｏｒ６４７ ａｎｔｉ－ｒａｔＣＤ３（浓度为０．５“ｇ／ｕ Ｌ）ＦＩＴＣｕｉ－ｒａ ｔＣＤ４（浓度为０．５“ｇ／ｕ Ｌ）ＰＥ ａｎｔ卜ｒａｔ ＣＤ８（浓度为０．２ｇ／“Ｌ）单克隆抗体购于美国ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司。 ◆引物序列：由大连宝生物ＴａＫａＲａ公司设计并合成。 目标基因ＨＳＰ７ ０ ｊ二游弓Ｉ物：ＧＣＴＣＧＡＧＴＣｃＴＡｃＧＣＣＴＴＣＡＡＴＡ： 目标基因ＨＳＰ７ ０下游引物：ＴｃｃＴＧＧｃＡｃＴＴＧＴｃＣＡＧｃＡＣ； 内参基因ＧＡＰＤＨ ｊ二游弓ｌ物：ＧｃＡＡＧＴＴｃＡＡｃＧＧｃＡｃＡＧ； 内参基因ＧＡＰＤＨ下游引物：ＧＣＣＡＧＴＡＧＡＣＴＣＣＡＣＧＡＣＡＴ。 ◆胎牛血清（ＦＢＳ）：郑州百宁生物制品有限公司产品，临用前置于５６℃水 浴３０ｍｉｎ，灭活补体。针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究◆双抗：青霉素与卡那霉素素用灭菌ＰＢＳ配成浓度为１×１ ０７ Ｕ／Ｌ原液。◆改良型ＲＰＭＩ１ ６４０：购于赛默飞世尔公司，临用时９０ ｍＬ基础ＲＰＭＩ １ ６４０中加入１ ｏ ｍＬ胎牛血清，双抗ｌｍＬ，使其终浓度为１×１ ０５ Ｕ／Ｌ。 ◆刀豆蛋白Ａ（ＣｏｎＡ，美国Ｇｉｂｃｏ公司产品）：将ＣｏｎＡ用无菌ＰＢＳ稀释成浓度为２５０／．ｔ ｇ／ｍＬ的原液过滤备用。ＯＭＴＳ试剂盒：购于美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司◆ＲＮＡＤＰ４１９。ｓｉｍｐｌｅｚ总ＲＮＡ提取试剂盒，购于北京天根生物科技有限公司，◆ｅＤＮＡ第一链合成试剂盒：购于美国Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，Ｋ１６２１。◆ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉｍｉｘ荧光定量ＰＣＲ试剂盒：购于德国Ｒｏｃｈｅ公司。◆异丙醇、无水乙醇：购于天津市东丽区天大化学试剂厂。１．１．３实验仪器ＫＨＢ酶标仪，上海华联试验系统有限公司产品；ＣＯ：培养箱，德国 Ｈｅｒａｒｕｓ公司产品；相差倒置显微镜ＩＸ７１，日本ＯＬＹＭＰＵＳ公司产品；７９００ＨＴ荧光定量ＰＣＲ仪，美国ＡＢＩ公司产品；５４１ ７Ｒ高速冷冻离心机，德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ产品；ＮＤｌ ０００核酸测定仪，美国Ｎａｎｏｄｒｏｐ产品。（其他见前） １．２实验方法 １．２．１动物分组所有大鼠饲养在温度（１ ８－２５℃）和湿度（４５％－５ ５％）相对较为恒定 的动物饲养室，并适应性饲养１周。将百白破疫苗用生理盐水稀释１ ｏ倍、 ２０倍、４０倍后，每只大鼠按分组浓度腹部皮下注射百白破疫苗０．５ｍＬ， 注射终浓度分别为人用疫苗剂量的１／１ ０、１／２０、１／４ ｏ倍。再将注射疫苗 大鼠分为针灸组和对照组。４８只大鼠随机分为Ａ－Ｆ六组，每组８只，分组如下： Ａ组：１／ｌＯ疫苗针灸组；Ｂ组：１／ｌＯ疫苗对照组； Ｃ组：１／２０疫苗针灸组；Ｄ组：１／２０疫苗对照组； Ｅ组：１／４０疫苗针灸组；Ｆ组：１／４０疫苗对照组。 １．２．２针灸处理湖北中医药大学２０１２届博士学位论文大鼠穴位定位均参照华兴邦等所著大鼠动物穴位图谱的研制，穴区剪毛备皮，穿自制鼠衣并固定架上固定。７５％医用酒精常规消毒不锈钢毫针， 双固一通组取大鼠“关元＂（剑突至耻骨联合下２／１ ３，向前斜刺３ｍｍ）、“后三里＂（膝关节后外侧腓骨小头下５ｍｍ，直刺７ｒａｍ）和“百会升（顶骨正中， 向前斜刺２ｍｍ）穴，接ＨＡＮＳ电针治疗仪，左右“后三里”每天交替与关元为一对电极，“关元＂接负极，“后三里”接正极（双侧“后三里竹隔日交替接电针），选用连续波，频率２Ｈｚ，强度为ｌｍＡ，通电１ ０ｍｉｎ。后采用自制艾条（直径约０．６ｃｍ），于“百会”、“后三里＂、“关元丹上方２－３ｃｍ 处悬灸，每个穴位持续５ｍｉｎ，皮温约４２±１℃（温度计监控）。每日１ 次，６日１疗程，疗程间休息１ｄ，共３疗程，连续２１ｄ。对照组以相同的 方法、相同时间段内抓取固定，悬挂１５ｍｉｎ，但不做电针处理。 １．２．３动物取材 针刺处理治疗结束后，继续饲养２周，于第５周终止实验。每组８只 称重，麻醉后开胸，用采血针和真空负压采血管（肝素抗凝和不加抗凝剂各一管）采血，每只大鼠收获约ｉｍＬ抗凝全血做流式细胞检测，其他不加 抗凝剂的全血约５ｍＬ，分离血清做抗体效价测定。无菌取脾脏，部分放入冻存管置于液氮中保存，其他研磨成脾细胞悬液，检测致敏脾细胞特异性增殖能力。１．２．４白喉抗毒素效价的检测 全血离心２０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，分离血清， ５６℃水浴３０ｍｉｎ灭活补体，－２０。Ｃ保存备用，用于白喉抗毒素效价的测定。采用Ｖｅｒｏ细胞微量中和法测定疫苗应答产生的白喉抗毒素的效价。在９６孔细胞培养板上，将免疫血清按倍比稀释至适宜滴度，５ ｏ“Ｌ Ｉ，Ｌ，加入等量１／ｌ ００００Ｌｃｄ的白喉试验毒素，同时设置标准白喉抗毒素对照、白喉试验毒素对照和细胞对照。待免疫血清和毒素结合１ ｈ后，再加入制备的Ｖｅｔｏ细胞悬液，摇匀，于３７℃，５％Ｃ０２培养箱中培养６ｄ后从孵箱中取出，置于倒置显微镜下观察细胞产生病变情况并拍照，鉴别正常细胞孔，效价孔和病变细胞孔数。以细胞全部死亡的前一孔（细胞半数死亡孔）的稀释倍数记为抗体针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究效价ｎ引，并用其几何均数ｌｏｇ：Ｘ进行统计学分析。 １．２．５致敏脾细胞特异性增殖能力检测 取脾脏放入盛有红细胞裂解液的瓶皿中，放入钢网进行研磨，红细胞 裂解液作用５ｍｉｎ，加入ＰＢＳ后１２００ｒｐｍ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，去上清，加入ＩｍＬＰＲＭＩ １ ６４０混悬，取１００“Ｌ于ＥＰ管中记数，调整细胞浓度为１×１ ０９／Ｌ，于９６孔板中每孔加入２００ ｕ Ｌ细胞悬液，同一脾脏细胞再分为４个抗原处理组：加入１“Ｌ疫苗原液、加入２ＩＪＬ疫苗原液、不加疫苗原液对照孔和加入浓度为２５ ０ ｕ ｇ／ｍＬ ＣｏｎＡ原液２“Ｌ，使其终浓度为２．５“ｇ／ｍＬ，作为阳性对照孔。３７＂Ｃ、５％ＣＯ：培养箱中培养７２ｈ。ＭＴＳ比色法检测脾细胞增殖能力，每孔加入２０“Ｌ ＭＴＳ试剂，３ｈ后酶标仪４９０ｎｍ波长检测ＯＤ值。１．２．６Ｔ细胞亚群比例的检测Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－ａｎｔ每１００“Ｌ抗凝全血中加入三种抗体：ｉ－Ｃ０３单克ｕ隆抗体２“Ｌ（浓度为ｏ．５“ｇ／“Ｌ），ＦＩＴＣ－ａｎｔ ｉ－ＣＤ４单克隆抗体２ 为０．５ｕＬ（浓度ｇ／ｕ Ｌ）和ＰＥ－ａｎｔ ｉ－ＣＤ８单克隆抗体５“Ｌ（浓度为ｏ．２“ｇ／“Ｌ）混匀闭光放置１５ｍｉｎ使抗体与相应细胞表面分子结合，每管加入ｌｍＬ红细胞 裂解液震荡混匀放置５ｍｉｎ破除红细胞，再加入３ｍＬ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）震荡混匀，以１０００ｒｐｍ／ｍｉｎ的转速离心５ｍｉｎ，去上清洗涤细胞一次，重 复上述步骤再洗涤一次。最后加入４００“Ｌ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）滤膜过滤细胞后上机检测。１．２．７实时定量ＰＣＲ检测ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量（同ＧＡＰＤＨ）比较１．２．７．１总ＲＮＡ提取 严格按照ＲＮＡｓｉｍｐｌｅｚ总ＲＮＡ提取试剂盒进行，将８０ｍｇ脾脏组织加ｌｍＬ裂解液Ｒｚ，用均浆器处理，将均浆样品在室温放置５ｍｉｎ，加入２００ ¨Ｌ氯仿，剧烈震荡１５ｓｅｃ，室温放置３ｍｉｎ。４℃，１２０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，离心１ ０ｍｉ ｎ，将上层无色水相转移到新管中。缓慢加入Ｏ．５倍体积无水乙醇，混匀，将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱ＣＲ３，４＂Ｃ，１２０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，离心３０ｓｅｃ，弃掉收集管中的废液。向吸附柱ＣＲ３中加入５００ Ｉｌ Ｌ去蛋白液 ＲＤ，４℃，１２０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，离心３０ｓｅｃ，弃废液。向吸附柱中加７００“Ｌ漂湖北中医药大学２０１２届博士学位论丈洗液ＲＷ，室温静置２ｍｉｎ，４Ｃ，１２０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，离心３０ｓｅｃ，弃废液。将 吸附柱放入２ｍＬ收集管中，４℃，１２０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，离心２ｍｉｎ，弃废液，将 吸附柱ＣＲ３转入一个新的离心管中，加４０ｕ Ｌ ＲＮａｓｅ―ｆｒｅｅｄｄＨ：０室温静置２ｍｉｎ，４＂Ｃ，１２０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，离心２ｍｉｎ。得到脾细胞总ＲＮＡ，取５¨Ｌ用核酸测定仪检测ＲＮＡ的纯度和浓度，其他立即放入一２０。Ｃ冰箱保存。１．２．７．２逆转录依照试剂盒说明书进行，采用逆转录二步法，反应总体积为４ ｏ ｕ Ｌ。模板ＲＮＡ０１ ４ｕ ｇｐｒ ｉｍｅｒｉｇｏ（ｄＴ）ｌｓ２“Ｌ ２４ ｕ ＬＤＥＰＣ水（补至）６５℃，５ｍｉｎ，迅速冰上ｌｍｉｎ。 按以下顺序加入：５Ｘ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ Ｒｉｂｏｌｏｃｋ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉ ｔｏｒ １ ０ｍｌＶｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ８ＵＬ ２“Ｌ ４“Ｌ ２“Ｌ混匀并离心，４２℃，６０ｍｉｎ，７０。Ｃ，５ｍｉｎ终止反应。产物可立即ＰＣＲ，部分产物于－２０＂Ｃ保存。１．２．７．３ Ｒｅａ １－ｔ ｉｍｅＰＣＲ检测ＰＣＲ总体系２４“Ｌ，将各反应物加入后，轻柔震荡混匀，短暂高速离心后分装２孔，做２复孔（１ ０２ＸＳＹＢＲ ｍｉｘ Ｆ―ｐｒ ｉｍｅｒ １２ＵｕＬ／孔）。Ｌ９５度，１ Ｏｍｉｎ２“ＬＲ－ｐｒｉｍｅｒ）Ｔｅｍｐｌａｔｅ９５度，１ ５ ｓｅｃ 姆０ｃｙｃｌｅｓ１ ＵＬ ９ ＵＬ５８度，ｌｍｉｎ熔解曲线分析ｕＪ上下游引物分别配成１ ０Ｍ的工作液，实验开始时以１：ｌ／Ｖ：Ｖ混合（则１４针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究终浓度分别为５“Ｍ），实验时取混合液２“Ｌ（则ＰＣＲ时终浓度各约为 ４００ｎＭ）。实验前将ｍｉＸ和ｔｅｍｐｌａｔｅ混合：样本用ｄｄＨ２０ １：１０稀释后，与ｍｉｘ混合。实验开始，按配方混合，混匀离心分装孔后，ＰＥ薄膜手套覆盖，冰上避光至上机。利用相对定量法分析ＨＳＰ７０的相对ｍＲＮＡ的表达水平，以ＧＡＰＤＨ基因为内参，利用△ｃｔ值计算ＨＳＰ７ ０的ｍＲＮＡ的表达量。计算公式¨引：相对ｍＲＮＡ表达量＝２“ｎ，△Ｃ ｔ＝样本ｃｔ均值一内参ｃｔ均值。 １．２．８统计学处理（同实验一） ２结果２．１白喉抗毒素效价检测由表２－１，图２－１，２－２，２－３可见，１／２ ０疫苗针灸组白喉抗毒素效价 明显较其对照组升高，有非常显著性差异（尸＜０．０１）；１／１ Ｏ疫苗针灸组 和其对照组，白喉抗毒素效价均高，无显著性差异（尸＞０．０５）；１／４ ０疫苗 针灸组和其对照组白喉抗毒素效价均较低，亦无显著性差异（尸＞０．０５）。表２―１针灸对不同浓度疫苗产生的白喉抗毒紊效价的影响ｉ±Ｓ（Ｉ ｏｇ：ｘ）注：与１／１ ０疫苗对照组比”尸＞０．０５；与１／２０疫苗对照组比２’尸＜０．０１；与１／４０疫苗对照组比”尸＞０．０５。６５每．辍 垃３挥．ＩＯ湖北中医药大学２０１ ２届博士学位论文图２－１针灸对不同浓度疫苗产生的白喉抗毒素效价影响的直方图比较注：Ａ：１／１ ０疫苗对照组；Ｂ：１／１０疫苗针灸组；Ｃ：１／２０疫苗对照组；Ｄ：１／２０疫苗针灸组；Ｅ：１／４０癌苗对照鲴：Ｆ：１ １４０疫苗针餐鲴ｌ８，１６，３２，６４，效价孔稀释倍数为４，ｌｏｇ。Ｘ为２。．ｊ图２－２ １／２０疫苗对照组效价判断图，放大倍数：２００ Ｘ倍，血清稀释倍数依次为２，４，图２－３１／２０疫苗针灸组效价判断图放大倍数：２００Ｘ倍，血清稀释倍数依次为２，４，８，１６，３２，６４。效价孔稀释倍数为３２，Ｉｏｇ：Ｘ为５。２．２１／２０疫苗组致敏脾细胞特异性增殖能力检测细胞增殖率与ＯＤ值的大小呈正相关。如表２－２，图２－４可见，加入１６针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究ＣｏｎＡ的致敏脾细胞增殖率最高，而加入１¨Ｌ和２“Ｌ的百白破疫苗（ＤＴａＰ） 后，Ｔ细胞的增殖率反而较不加刺激物的对照组明显降低（尸＜ｏ．０１），其 中加２“Ｌ的百白破疫苗（ＤＴａＰ）较加入１ｐＬ百白破疫苗（ＤＴａＰ）组细胞增殖率更低（尸＜ｏ．０５）。百白破疫苗制备过程中加入硫柳汞等防腐剂，可 能对细胞产生细胞毒作用，提示百白破疫苗原液不适宜做为脾细胞特异性增殖实验的抗原液，需使用提纯的成分抗原为刺激物。表２―２ １／２０疫苗组致敏脾细胞特异性增殖能力比较ｉ±Ｓ组别１¨Ｌ ＤＴａｐ组 ２ ｐ Ｌ ＯＴａｐ组ＯＤ值ＣｏｎＡ组对照组 注：与对照组比较，１’户＜０．０１；与２Ｏ．９ｐ ＬＤＴａｐ组比较２’尸＜０．０５．Ｏ．８ Ｏ．了捌玑６吕ｏ．５Ｏ．● Ｏ．３ Ｏ．２ Ｏ．＇Ｏ．Ｏ图２―４ １／２０疫苗组致敏脾细胞特异性增殖能力直方图比较注：Ａ：１ｌｌ ＬＤＴａｐ组；Ｂ：２“Ｌ ＤＴａｐ组：ｃ：ＣｏｎＡ组；Ｄ：对照组２．３１／２０疫苗组Ｔ细胞亚群比值的比较我们先用ＣＤ３抗体进行射门处理后，计算ＣＤ３＋细胞（Ｔ细胞）中ＣＤ４＋细胞／ｃＩ）８＋细胞的比值，也就是ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值。如表２－３，图 ２－５，２－６可见，针灸处理后ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值有所升高，但与对 照组比较无显著性差异（尸＞Ｏ．０５）。湖北中医药大学２０１２届博士学位论文表２―３ １／２０疫苗组外周血ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞的比值比较ｉ±ｓ注：与１／２０疫苗对照组比较，１’尸＞０．０５．＋∞口ｕ＋∞口譬＋甘口ｕ＋ｎ口ｕＡ Ｂ图２－５ １／２０疫苗组外周血ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＊Ｔ细胞比值直方图比较 注：Ａ：１／２０疫苗针灸组；１／２０疫苗对照组ｌＩ１４０．８＇ｐｊ０．８８｝缝ｊ囊 ｊ憎一”?‘１ｊ’．＇－们 ∽ ｎ 啕 ∽ ｎ００憎，１．９．３一 ●一●ｌ＇韭５６一，Ｒ’．一Ｉ－Ｍ＇一叫口 Ｕｗ－｛ ＿十灸２８－７Ⅳ．档、＊，“．１．０７ｐ＇ｐ?：。．Ｊ３．２１蒸ＩＵ?■…１Ｍ’，玉’，晶’，玉６７ 。．玉 ■一ＣＤ４图２―６ １／２０疫苗组ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值双参数散点图比较注：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７－ａｎｔ ｉ－ＣＤ３、ＰＥ－ａｎｔ ｉ－ＣＤ８和ＦＴＩＣ－ＣＤ４分别标记ＣＤ３、ＣＤ８和ＣＤ４分子．左上图红色方框中细胞为ＣＤ３＋细胞（Ｔ细胞）占外周血中淋巴细胞的百分率，右四图进一步１８针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究分析Ｔ细胞中备细胞亚群的比例．左下象限（ＬＬ）数值为双阴性细胞（ＣＤ４一ＣＤ８一）占Ｔ细胞 百分率、左上象限（ＵＬ）数值为Ｙ轴阳性细胞（ＣＤ４－ＣＤ８＋）占Ｔ细胞百分率、右下象限（ＬＲ） 数值为ｘ轴阳性细胞（ＣＤ４＋ＣＤ８一）占Ｔ细胞百分率、右上象限（ｕＲ）数值为双阳性细胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋） 占Ｔ细胞百分率，ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值计算公式为：ＬＲ／ＵＲ２．４实时定量ＰＣＲ检测ＨＳＰＴ０ｍＲＮＡ相对表达量（同ＧＡＰＤＨ）比较 ２．４．１脾细胞总ＲＮＡ完整性鉴定将提取的脾细胞总ＲＮＡ，用核酸测定仪检测ＲＮＡ的纯度和浓度，结果 Ａ２６０／Ａ２８０比值均在１．８―２．０之间，显示总ＲＮＡ有较好完整性和较高纯度。 各组总ＲＮＡ浓度在１０００－３０００ｎｇ／“Ｌ之间，含量较高，每组根据总ＲＮＡ 浓度调整为４“Ｌ模板浓度用于后续逆转录实验。２．４．２脾细胞ＨＳＰ７ ０ｍＲＮＡ相对表达量（同ＧＡＰＤＨ）比较 脾细胞中ＨＳＰ７ ０ｍＲＮＡ阳性表达标本荧光定量扩增曲线呈典型的Ｓ形曲线（图２－７）。熔解曲线为单峰，排除非特异性扩增及引物二聚体的干扰 （图２―８），显示ＲＴ―ＰＣＲ结果可靠。由表２－４，图２－９可见，经过针灸处理，脾细胞ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量有所升高，但与对照相比无显著性差异（尸＞Ｏ．０５）。蓉≤≥箨／／，．４／ｆ／：。?一ｊ??４，．■ｊ。一。：：‘；：’。∥‘√，？ ，＾，，，，…～一一“……一…，ｖ：…｝，ｔ，，，７ｐ嚣，， …，一；十‘ ＝ｔ一“：１。ｔ：：’，“Ｆ钟；打‘’ｊ…？‘’ｊ‘１’“３二 ？ ：，７７Ⅳ。’，。溅麟鎏参｛蔓弧Ｖ－．一ｊ．≯参■；；。≥＿一：：≥图２－８ＨＳＰ７０图２―７ ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ荧光定量扩增曲线ｍＲＮＡ荧光定量熔解曲线１９湖北中医药大学２０１２届博士学位论文表２－７ １／２０疫苗组ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量（同ＧＡＰＤＨ）比较ｉ±ｓ（２－ＡＣｔ）注：与１／２０疫苗对照组比较，”尸＞０．０５．ｍ刚Ｌ６蝈’。‘僻Ｉ．２ 挺．．。霉¨鼋。．６昌ｏ．Ｉ器ｏ．２雹Ｏ．Ｏ图２―９ １／２０疫苗组ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量（１司ＧＡＰＤＨ比较）直方图 注：Ａ：１／２０疫苗对照；Ｂ：１／２０疫苗针灸３小结本实验通过“双固一通’’针灸法处理百白破疫苗免疫大鼠，观察到其 能增强疫苗产生抗体的效价，最佳免疫浓度为人用疫苗的１／２０倍。我们 还观察到１／２ ０疫苗组针灸处理组与其对照组相比，大鼠外周血ＣＤ４＋Ｔ细 胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞的比值略有升高，脾细胞ＨＳＰ７０ＲＮＡ的相对表达量亦略有增 加，但均无显著性差异。针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究实验三Ｄ一半乳糖诱导大鼠衰老的实验观察衰老及其相关疾病已经成为当今日益严重的社会和医疗问题。为了更 好的研究衰老的机制，许多模型动物被应用到实验中。目前构建的衰老动 物模型主要有一下几种：Ｄ一半乳糖致衰老动物模型、ＳＡＭＰ系小鼠衰老模 型、臭氧损伤衰老模型、去胸腺衰老模型、自然衰老模型等。与其他几种 模型相比，Ｄ一半乳糖造模简单、试验周期相对较短，故目前广泛应用于衰 老试验研究。本实验选用Ｄ一半乳糖诱导的衰老动物模型，研究其相关免 疫衰老指标的变化，进一步丰富和证实该方法构建衰老动物模型的可靠性。 １材料及方法１．１实验材料 １．１．１实验动物ＳＰＦ级Ｗｉ Ｓｔａｒ大鼠，雌性，体重２３０９－２８０９购于湖北省实验动物研 究中心，许可证号：ＳＣＸＩ（（鄂）２００８―０００５。 １．１．２实验试剂ＯＳＯＤ（超氧化物歧化酶）试剂盒：购于南京建成生物工程公司； ◆ＣＨＯＬ（胆固醇）生化检测试剂盒，ＴＧ（甘油三酯）生化检测试剂盒：均购自中生北控生物科技股份有限公司。 ◆Ｏ－半乳糖：同实验一。 ◆引物序列及ＲＴ－ＰＣＲ提取试剂盒：同实验二。 １．１．３实验仪器：Ｍｏｒｒｉ Ｓ水迷宫ＭＴ一２００，成都泰盟科技有限公司生产； 全自动生化分析仪ＧＳ－４００，深圳锦瑞医疗器械股份有限公司生产；５５０ｎｍ 分光光度计：日本岛津公司生产。ＨＨ．Ｗ２１．４２０型电热恒温水箱天津市泰斯特仪器公司。其他同前ｏ１．２实验方法１．２．１实验动物及造模分组动物造模同实验一。２ ｏ只大鼠随机分为２组：湖北中医药大学２０１２届博士学位论文衰老模型组（１０只）：颈背部皮下注射Ｄ一半乳糖３５０ｍｇ／ｋｇ；正常对照组（１０只）：皮下注射等容积的生理盐水。 １．２．３游泳水迷宫进行行为学检测采用环形水池，水池直径为（１２０ｃｍ）水池中放一低于水面１．５ ｃｍ左 右的逃避平台。将水池划分为４个象限，在前４天为定位导航试验，每只 大鼠在四个象限各入水一次，从入水开始计时直到大鼠到达逃避平台停留 ２秒自动结束，记录数据，每只大鼠每日进行一组实验，一组实验为四个象限各入水一次。在第５天进行空间探索实验，取出逃避平台，在逃避平台位置设定一个平台区域，并以平台半径１．５倍设定区域为有效区，将大 鼠于任意象限入水，游泳至时间满足１２０ｓｅｃ后实验停止，每只大鼠仅进 行一次实验。实验检测指标为：经过平台次数和有效区内停留时间。 １．２．４实验动物取材造模结束第２ｄ终止实验。每只大鼠按０．４ｍＬ／１ ００９注射浓度为 １００ｍｇ／ｍＬ的水合氯醛麻醉后，将大鼠浸泡于７５％医用酒精３ｍｉｎ，消毒后置于无菌手术台，大头丁固定四肢，７５％医用酒精消毒皮肤，使用高压灭 菌的手术器械（眼科剪，眼科镊）开胸，暴露心脏，用采血针和真空负压 采血管，每只大鼠抽取５ｍＬ全血，待其自然凝固后分离血清，检测生化指 标。快速取脾脏放入冻存管，立即放入液氮中保存，留做ＲＴ－ＰＣＲ检测。 １．２．５血清中血脂含量检测 心脏采血３ｍＬ，２０００ｒｐｍ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，分离血清，采用全自动生化分析仪检测ＣＨＯＬ和ＴＧ的含量。１．２．６血清中ＳＯＤ活性的比较 参照试剂盒说明书在血清中按顺序加入试剂，混匀，置３７℃水浴４０ｍｉｎ，再加入显色剂２ｍＬ，室温放置１０ｒａｉｎ，放入比色杯，蒸馏水调零， 于５５０ｎｍ分光光度仪上比色检测吸光度（ＯＤ值），血清ＳＯＤ的活性。总ＳＯＤ活力＝（对照管吸光度一测定管吸光度）／对照管吸光度÷５ ０％×反应体系的 稀释倍数ｘ样本测试前的稀释倍数。 １．２．７实时定量ＰＣＲ检测ＨＳＰＴＯｍＲＮＡ相对表达量（同ＧＡＰＤＨ）比较（同实验针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究二）１．２．８统计学处理（同实验一）２结果２．１游泳水迷宫进行行为学检测结果比较空间探索实验中衰老模型组与正常对照组比较经过平台次数降低，有显著性差异（尸＜０．０５）；衰老模型组与正常对照组比较有效区停留时间明显降低，有非常显著性差异（尸＜０．０１）见表３－１，图３－１，３－２。表３―１两组大鼠水迷宫实验经过平台次数和有效区停留时间比较ｉ±ｓ注：经过平台次数：与正常对照组比较”Ｐ＜０．０５；有效区停留时间：与正常对照组比较玎Ｐ＜０．０１。８ ２２ ２０ ７簌。螽ｓｌ斗?匣博 岔怕 鼬¨捌３ 蜊：， Ｏ｜ ｜：｜２ ＯＡ日Ａ日图３－１大鼠经过平台次数直方图注：＾：正常对照组；Ｂ：衰老模型组图３－２大鼠有效区停留时间直方图２．２两组大鼠血脂含量及ＳＯＤ活性的比较衰老模型组与正常对照组比较ＳＯＤ活性明显降低，有非常显著性差异（尸＜０．０１）；衰老模型组与正常对照组比较ＣＨＯＬ、ＴＧ含量亦升高，有显 著性差异（尸＜Ｏ．０５）；见表３－２，图３－３、３―４、３－５。湖北中医药大学２０１２届博士学位论文表３－２两组大鼠ＳＯＤ活性及血脂ＴＧ、ＣＨＯＬ含量的比较（ｉ±ｓ）注：Ｓ０１）活性：与正常对照组比较”Ｐ＜Ｏ．０１；ＴＧ含量：与正常对照组比较２’尺０．０５；ＣＨＯＬ含量：与 正常对照组比较∞Ｐ＜Ｏ．０５。Ｏ．Ｂ １８０ ＯＪ ＇６０Ｉ‘０ｔ点＇．●Ｏ．５＇．２掣ｍ警－ｏｏ易８０６０ ●Ｏ ２０ Ｏ Ａ Ｂ埋０５ 兰ｏ．．Ｄ．３ Ｏ’２蹭ｆ．０一呈ｏ’８ＵＯ．６Ｏ．‘０．ｔ００Ｄ．Ｏ ＾Ｏ且图３―３ ＳＯＤ活性直方图图３－４ ＴＧ含量直方图图３－５ ＣＨＯＬ含量直方图注：Ａ：正常对照组；Ｂ衰老模型组２．３实时定量ＰＣＲ检测ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量（同ＧＡＰＤＨ）比较２．３．１脾细胞总ＲＮＡ完整性鉴定将提取的脾细胞总ＲＮＡ，用核酸测定仪检测ＲＮＡ的纯度和浓度，结果 Ａ２６０／Ａ２８０比值均在１．８―２．０之间，显示总ＲＮＡ有较好完整性，和较高纯 度。各组总ＲＮＡ浓度在１０００－３０００ｎｇ／ｐ Ｌ之间，含量较高，每组根据总 ＲＮＡ浓度调整为４“Ｌ模板浓度用于后续逆转录实验。 ２．３．２脾细胞ＨＳＰＴＯｍＲＮＡ相对表达量（同ＧＡＰＤＨ）比较 脾细胞中ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ阳性表达标本荧光定量扩增曲线呈典型的Ｓ形曲 线（图３－６）。熔解曲线为单峰，排除非特异性扩增及引物二聚体的干扰 （图３－７），显示ＲＴ－ＰＣＲ结果可靠。由表３－３，图３－８可见，与正常对照组 比较，衰老模型组脾细胞的ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量降低，有显著性差异（尸＜０．０５）。针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究图３－６ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ荧光定量扩增曲线图３－７ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ荧光定量熔解曲线表３－３两组脾细胞ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量（同ＧＡＰＤＨ）的比较ｉ±ｓ（２－．Ａ．Ｏｔ）注：与正常对照组比较”／ＫＯ．０５．酬Ｌ‘ 蝈Ｌ２ １ＩＩ《：加 韶 霉玑８卜 山０．２ 们 雹Ｏ．０Ｅ图３―８两组脾细胞ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量直方图比较注：Ａ：正常对照组：Ｂ：衰老模型组３小结本实验从大鼠的行为认知方面，氧化应激及脂质代谢紊乱方面证实了Ｄ一半乳糖诱导衰老大鼠模型的有效性，同时我们从一个新的角度，即 ＨＳＰ７０表达含量方面力证了Ｄ一半乳糖能有效模拟免疫衰老的危险表型，可 作为一种较好的衰老动物模型用于衰老实验研究。湖北中医药大学２０１２届博士学位论文实验四针灸提高衰老大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的研究 随着年龄增长，机体代谢障碍及清除氧自由基的能力下降，血液内脂 类物质堆积，使生物膜功能发生障碍，诱发重要器官的衰老及多种疾病的 发生旺们。而免疫衰老表现为免疫系统进行性损伤，对感染的控制能力降低 和对疫苗的应答能力减弱。本实验采用Ｄ一半乳糖致衰老的大鼠模型，并 用百白破疫苗进行免疫，采用“双固一通”针灸法进行干预，一方面观察其对ＳＯＤ活性、血脂含量的影响；另一方面检测其对疫苗免疫后的体液免 疫应答效应（白喉抗毒素的效价、球蛋白含量）、细胞免疫应答效应（ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞的比值）及对内源性佐剂物质（ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量） 的影响，探讨针灸是否能增强衰老机体对疫苗的免疫效应、延缓衰老以及 相关机制。１材料及方法 １．１实验材料１．１．１实验动物ＳＰＦ级Ｗｉ Ｓｔａｒ大鼠，雌性，体重２３０９－２８０９购于湖北省实验动物研究中心，许可证号：ＳＣＸＫ（鄂）２００８－０００５。 １．１．２实验试剂（其他同前） ◆ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（编号７０５０３Ｒ）：购于美国Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司。◆ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ：ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ公司产品◆琼脂糖：上海伯奥生物科技公司。 １．１．３实验主要仪器（其他同前） 凝胶成像系统，购于法国Ｖｉ ｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ公司。１．２实验方法 １．２．１实验动物分组 所有大鼠饲养在温度（１ ８－２５℃）和湿度（４５％－５ ５％）相对较为恒定的动物饲养室，可自由摄食及饮水。Ｗｉ ｓ ｔａｒ大鼠４ ｏ只，随机分为４组， 分组后各组动物适应性饲养１周后开始实验。针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究模型免疫针灸组（１０只）：注射Ｄ一半乳糖连续４２ｄ，造模后给予百白破疫 苗注射，再予以针灸处理；模型免疫对照组（１０只）：注射Ｄ一半乳糖连续４２ｄ，造模后给予百白 破疫苗注射，不予以针灸处理； 正常免疫针灸组（１０只）：与模型组同时给予百白破疫苗注射，并予以针灸处理；正常免疫对照组（１０只）：与模型组同时给予百白破疫苗注射，不予以针灸处理。１．２．３实验动物造模（同实验一）１．２．４疫苗免疫造模结束后第二天将百白破疫苗用生理盐水稀释２０倍，每只大鼠腹 部皮下注射稀释白百破疫苗０．５ｍＬ，使其疫苗注射剂量为人用剂量的１／２０ 倍（实验二得出的最佳疫苗免疫浓度）。１．２．５针灸处理（同实验二） １．２．５实验动物取材针灸处理结束后，大鼠再正常喂养２周，至第１２周大鼠禁食２４ｈ，第２ｄ终止实验。每组１ ｏ只称重，每只大鼠按０．４ｍＬ／ｌ ００９注射浓度为１００ｍｇ／ｍＬ的水合氯醛麻醉后，将大鼠浸泡于７５％医用酒精３ｍｉｎ，消毒后置于无菌手术台，大头丁固定四肢，７５％医用酒精消毒皮肤，使用高压灭 菌的手术器械（眼科剪，眼科镊）开胸，暴露心脏，用采血针和真空负压 采血管（肝素抗凝及无抗凝剂各一管），每只大鼠抽取ｌｍＬ抗凝全血留做流式细胞检测。５ｍＬ不抗凝的全血，待其自然凝固后，２０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，离心 １０ｍｉｎ，分离血清，留做生化指标及抗体检测；快速取脾脏放入冻存管，立 即放入液氮中保存，留做ＲＴ－ＰＣＲ检测。 １．２．６血清中ＳＯＤ活性的比较（同实验三） １．２．７血脂及蛋白含量检测（同实验三）１．２．８白喉抗毒素的检测（同实验二）１．２．９外周血Ｔ细胞亚群比例的检测（同实验二）湖北中医药大学１０１２届博士学位论文１．２．１０实时定量ＰＣＲ检测脾细胞ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量（同ＧＡＰＤＨ）比较（同实验三） １．２．８统计学处理（同实验一）２结果２．１各组大鼠血清ＳＯＤ活性的比较 如表４－１，图４－１所示，各组大鼠血清ＳＯＤ活性，模型免疫针灸组较 模型免疫对照组升高，有显著性差异（尸＜０．０５）；模型免疫对照组较正常免疫对照组明显降低，有非常显著性差异（尸＜０．０１）；正常免疫针灸组较 正常免疫对照组略有升高，但无显著性差异（尸＞Ｏ．０５）。表４－１各组大鼠ＳＯＯ活性比较ｉ±ｓ（Ｕ／ｉｎｋ）注：与模型免疫对照组比较＂尺０．０５；与正常免疫对照组比较２’尺０．０１；与正常免疫对照组比 较∞尸＞０．０５２５０２００蚶 蟪博。口 。 们ＩＯＯ５０Ｏ图４―１各组大鼠ＳＯＤ活性直方图比较注：Ａ：模型免疫针灸组；Ｂ模型免疫对照组；Ｃ：正常免疫针灸组；Ｄ：正常免疫对照组２．２各组大鼠血脂含量的比较 模型免疫针灸组与模型免疫对照组比较，ＣＨＯＬ、ＴＧ含量降低，有显针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究著性差异（尸＜０．０５）；模型免疫对照组与正常免疫对照组比较，ＣＨＯＬ、ＴＧ 含量升高，有显著性差异（尸＜０．０５）；正常免疫针灸组与正常免疫对照组比较ＣＨＯＬ、ＴＧ含量降低，有显著性差异（尸＜０．０５）。见表４－２，图４―２、４－３。表４－２各组大鼠血脂ＣＨＯＬ、ＴＧ含量的比较ｉ±Ｓ（ｍｍｏＬ／Ｌ）注：ＣＩｔＯＬ含量：与模型免疫对照组比较Ｄ尺０．０５；与正常免疫对照组比较２’只０．０５． ＴＧ含量：与模型免疫对照组比较１’尺０．０５；与正常免疫对照组比较２’ｊ日（０．０５¨ ９¨ ¨¨ ６”７喇他智ｍ呈啪Ｕ¨ ６ ¨ ５喇如。卜¨ ‘ 吣 ３ 眦 ２¨１¨ ¨ ＂ 啪Ａ Ｂ Ｃ Ｄ叫 ＤＡ Ｂ Ｃ Ｄ图４―２各组大鼠ＣＨＯＬ含量直方图图４―３各组大鼠ＴＧ含量直方图注：Ａ：模型免疫针灸组；Ｂ模型免疫对照组；Ｃ：正常免疫针灸组；Ｄ：正常免疫对照组２．３各组大鼠蛋白含量的比较模型免疫针灸组与模型免疫对照组比较，其ＴＰ，ＧＬＢ含量升高，有显 著性差异（尸＜０．０５）；模型免疫对照组的ＴＰ，ＧＬＢ含量较正常免疫对照组 降低，有显著性差异（尸＜ｏ．０５）；正常免疫针灸组与正常免疫对照组比较， 其ＴＰ、ＧＬＢ含量升高，有显著性差异（尸＜ｏ．０５）；白蛋白ＡＬＢ之间比较均无显著性差异（尸＞Ｏ．０５）。见表４―３、图４－４、４―５、４－６。湖北中医药大学２０１２届博士学位论文表４－３ 组别 模型免疫针灸组 模型免疫对照组 正常免疫针灸组 正常免疫对照组 例数１０ １０ １０ １０各组大鼠蛋白含量的比较（ｇ／Ｌ）ｉ±ｓＴＰ ＡＬＢ ＧＬＢ６８．９０±４．４５８１’ ６４．５０±４．１１６２’４３．７０ ４－３．１２８ ４２．７０ ４－３．３３５２５．２０±３．６７５” ２１．８０±３．４２５２’ ２８．７０士３．０５６２’ ２５．５０ ４－２．５９２７３．００±３．８５８”４４．３０±３．２６７ ６９．２０±３．６７５ ４３．７０ ４－２．５４０注：ＴＰ含量：与模型免疫对照组比较１’尺０．０５；与正常免疫对照组比较２’尺０．０５；ＧＬＢ含量：与 模型免疫对照组比较Ｄ尺０．０５；与正常免疫对照组比较２’只０．０５．∞ ：；茔 伯∞∞∞ 毳享 ：；；笛 ∞酬如ｄ工∞∞ ∞仲喇扣曲ｊ ∞帕喇却Ⅱ１０幅∞５。。ｏＡＢＣＤＡＢＣＤＡ日ＣＤ图４－４ ＴＰ含量直方图图４－５ ＡＬＢ含量直方图图４―６ ＧＬＢ含量直方图注：Ａ：模型免疫针灸组；Ｂ模型免疫对照组；Ｃ：正常免疫针灸组；Ｄ：正常免疫对照组２．４白喉抗毒素效价检测由表４－４，图４―７可见，模型免疫针灸组与模型免疫对照组比较抗体 效价明显升高，有非常显著性差异（尸＜０．０１）；模型免疫对照组与正常免疫对照组比较抗体效价明显降低，有非常显著性差异（尸＜０．０１）；正常免疫针灸组与正常免疫对照组比较抗体效价升高，有显著性差异（尸＜０．０５）。针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究表４－４各组白喉抗毒素效价的比较（Ｉｏ＆Ｘ）ｉ±ｓ注：与模型免疫对照组比较１’Ｊ日（０．０１；与正常免疫对照组比较∞只０．０１；与正常免疫对照组比 较３’只０．０５。７６鑫ｓ藿?搐３２ ●Ｏ图４―７各组白喉抗毒素效价的比较直方图注：Ａ：模型免疫针灸组；Ｂ模型免疫对照组；Ｃ：正常免疫针灸组；Ｄ：正常免疫对照组２．５针灸刺激对疫苗免疫大鼠ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值比较 如表４－５、图４－８、４－９所示，在ＣＤ３＋细胞（Ｔ细胞）群中，ＣＤ４＋Ｔ细 胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值，模型免疫针灸组较模型免疫对照组升高，有显著性差 异（尸＜０．０５）；模型免疫对照组较正常免疫对照组明显降低，有非常显著性差异（尸＜ｏ．０１）；正常免疫针灸组较正常免疫对照组略有增高，但无显著性差异（尸＞０．０５）。湖北中医药大学２０１２届博士学位论文表４－５各组大鼠外周血ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值的比较ｉ±Ｓ注：与模型免疫对照组比较１’尺０．０５；与正常免疫对照组比较２’尺０．０１；与正常免疫对照组比 较∞尸＞０．０５．霉导工＋冒是雷再工＋苫ｕＡ Ｂ Ｃ Ｄ表４－８各组大鼠外周血ＣＤ４１细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值直方图比较注：Ａ：模型免疫针灸组；Ｂ模型免疫对照组；ｃ：正常免疫针灸组；Ｄ：正常免疫对照组。３１．１ ２．７４ ：４６．５ １．６５｝：：‘ｉｊ‘’●譬１．２６荔憎６５＿２．０３囊４９．８懈之１２二．模型免疫针灸｛２５．８ ３．０４’‘’媳柑’一 模型免疫对照－２７．８３铲、。瞄，‘●●蓥１．６４髫６９．５０．８４’一’矿蕊憎讲 正常免疫针灸ＣＤ４甜’ｐ晶一憎 正常免疫对照Ｌ６８一．图４－９各组大鼠外周血ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ细胞比值流式细胞双参数散点图３２针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究注：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ一６４７一ａｎｔ ｉ―ＣＤ３、ＰＥ―ａｎｔｉ―ＣＤ８和ＦＴＩＣ―ＣＤ４分别标记ＣＤ３、ＣＤ８和ＣＤ４分子。左上图红色椭圆型中细胞为ＣＤ３＋细胞（Ｔ细胞）占外周血中淋巴细胞的百分率，右四图迸一 步分析Ｔ细胞中各细胞亚群的比例。左下象限（ＬＬ）数值为双阴性细胞（ＣＤ８一ＣＤ４一）占Ｔ细 胞百分率，左上象限（ＵＬ）数值为Ｙ轴阳性细胞（ＣＤ８＋ＣＤ４一）占Ｔ细胞百分率、右下象限（ＬＲ） 数值为Ｘ轴阳性细胞（ＣＤ８一ＣＤ４＋）占Ｔ细胞百分率、右上象限（ＵＲ）数值为双阳性细胞（ＣＤ８＋ＣＤ４＋） 占Ｔ细胞百分率，ＣＤ４＋Ｔ细胞／ＣＤ８＋Ｔ比值计算公式为：ＬＲ／＋ＵＬ２．６实时定量ＰＣＲ检测ＨＳＰ７ ０ｍＲＮＡ相对表达量（２．６．１脾细胞总ＲＮＡ完整性鉴定ＧＡＰＤＨ）比较将提取的脾细胞总ＲＮＡ，经１％琼脂糖凝胶电泳，如图４－１０，总ＲＮＡ 琼脂糖电泳图可见，各泳道均为三个不同片断的条带，即５Ｓ，１ ８ ５，２ ８Ｓ， 说明样品的ＲＮＡ均为完整的，未被ＲＮＡ酶降解。用核酸测定仪检测ＲＮＡ 的纯度和浓度，结果Ａ２６０／Ａ２８０比值均在１．８－２．０之间，显示总ＲＮＡ有较 好完整性，和较高纯度。各组总ＲＮＡ浓度在１０００－３０００ｎｇ／ｕ Ｌ之间，含量 较高，每组根据总ＲＮＡ浓度调整为４“Ｌ模板浓度用于后续逆转录实验。 ２．６．２脾细胞ＨＳＰ７０ ＲＴ－ＰＣＲ产物琼脂糖电泳结果 ＰＣＲ产物经琼脂糖电泳，在凝胶成像仪下观察与ＤＮＡｍａ ｒｋｅｒ（编号 ７０５０３Ｒ）对照显示，可见，在１０５ｂｐ处有清晰的条带，为ＨＳＰ７０基因扩增 产物，与预先设计的结果相符。同时在１ ３９ｂｐ处可见清晰的内参（ＧＡＰＤＨ） 条带，见图４－１１ ２ ３１。ｌ２ ３４５ ６７８９２００１００ ７５０１｝一２８Ｓ．（－－－１８Ｓ５００２５０ｏ１００５Ｓ，．１３９ｂｐ ――１０ｂ＂ｂｐ图４－１０ＲＮＡ电泳图图４－Ｉ １各组脾细胞ＨＳＰ７０及内参ＲＴ－ＰＣＲ产物电泳图３３湖北中医药大学２０１２届博士学位论文１：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ１：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；２：正常免疫针灸ＨＳＰ７０；３：正常免疫对照ＨＳＰ７０；２：样本 ３：样本４：模型免疫针灸ＨＳＰ７０；５：模型免疫对照ＨＳＰ７０； ６：正常免疫针灸内参ＧＡＰＤＨ；７：正常免疫对照内参ＧＡＰＤＨ； ８：模型免疫针灸内参ＧＡＰＤＨ；９模型免疫对照内参ＧＡＰＤＨ。２．６．３脾细胞ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量（同ＧＡＰＤＨ）比较脾细胞中ＨＳＰ７ ０ｍＲＮＡ阳性表达标本荧光定量扩增曲线呈典型的ｓ形曲线（图４－１ ２）。熔解曲线为单峰，排除非特异性扩增及引物二聚体的干扰 （图４－１ ３），显示ＲＴ－ＰＣＲ结果可靠。如表４－６，图４－１ ４所示，各组大鼠脾细胞ＨＳＰ７ ０ｍＲＮＡ相对表达量，模型针灸组较模型对照组升高，有显著性差 异（尸＜０．０５）；模型免疫对照组较正常免疫对照组明显降低，有非常显著 性差异（尸＜０．０１）；正常免疫针灸组较正常免疫对照组略有升高，但无显 著性差异（尸＞Ｏ．０５）。图４－１ ２ ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ荧光定量扩增曲线图４－１３ ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ荧光定量熔解曲线表４－８各组大鼠脾细胞ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量（同ＧＡＰＤＨ）比较ｉ±ｓ注：与模型免疫对照组比较”尺０．０５；与正常免疫对照组比较２’尺０．０１；与正常免疫对照组比针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究１．６翼¨｛ＩＩ《：１。２贺ｔ．ｏ署¨鼋。．６２山ｏ．‘警ｏ．ｚＯ．Ｏ表４―１ ４脾细胞ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ相对表达量（同ＧＡＰＤＨ）比较直方图注：Ａ：模型免疫针灸组；Ｂ模型免疫对照组；ｃ：正常免疫针灸组；Ｄ：正常免疫对照组３小结本实验Ｄ一半乳糖诱导的衰老模型大鼠对百白破疫苗的体液免疫应答和细胞免疫应答全面降低，且ＨＳＰＴ０表达也降低，进一步证实了Ｄ一半乳糖 诱导的衰老模型大鼠具备免疫衰老的特点，是一种比较可靠的复制衰老的动物模型。同时我们证实“双固一通’’针灸法能提高衰老大鼠对百白破疫苗的免疫}