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标题: 质谱问题求助
摘要: [质谱问题求助] 一维电泳染色后做二次质谱鉴定分子，报告出来一系列分子，但是分子量少了一半，他们解释说是蛋白修饰，如糖基化问题等，但是不会相差这么大把（50KD）？而且排在前面几个可信度高的分子，一看就不是啊。请各位高手解答，急等 关键词:[质谱 分子量 二聚体 单体 目的蛋白 条带 电泳 抗体]……
一维电泳染色后做二次质谱鉴定分子，报告出来一系列分子，但是分子量少了一半，他们解释说是蛋白修饰，如糖基化问题等，但是不会相差这么大把（50KD）？而且排在前面几个可信度高的分子，一看就不是啊。请各位高手解答，急等回复
只要MS鉴定出来分数高的话，就可以确定是这个蛋白，至于表观MW和pI的差异,可以不用理会.因为蛋白有可能形成复合体(MW变大)、降解(MW变小)等等其他多种原因造成MW和pI的变化.
只要MS鉴定出来分数高的话，就可以确定是这个蛋白，至于表观MW和pI的差异,可以不用理会.因为蛋白有可能形成复合体(MW变大)、降解(MW变小)等等其他多种原因造成MW和pI的变化. ... 可是MS和WESTERN，IP相比较，分子量相差的这么大（50KD），不好解释啊
质谱其实对样品纯度要求挺高的。由于你的样品来自一维电泳，理论上讲可能是一个混合蛋白，这样鉴定出来的就可能是一系列各不相同的蛋白。而且对于混合蛋白的鉴定，一级质谱的可靠性本来就差。
另外质谱的结果只是给我们提供一个参考，它并不能象WB或者PCR一样给予我们一个非常准确可靠的回答，质谱的结果往往是你所提供的样品中经过MS解析后产生的PMF中混合的肽段与目的蛋白中相匹配的肽段数是多少以及可信度是多少等等。所以最终还得通过PCR或者WB的方法对质谱的结果进行验证。
除此之外影响质谱结果的因素非常多。
因此建议楼主采用其他方法进行验证或者进行二级质谱解析。
试验目的是找抗原分子，用的就是二级质谱啊，理论上是找出所有可能的分子，可是分子量相差太大，可信吗？还有什么方法啊，急啊
我也遇到了lz的类似的问题。我的质谱结果中有两个蛋白分数分别是200多和300多，但是理论分子量远远大于胶中的位置。我考虑是不是蛋白断裂造成的。我想问：如果这样，那么分析这个差异蛋白还有意义吗？能否用蛋白的某一片段来预测整个蛋白呢？谢谢
Sorry I can not type in Chinese.
If 一维电泳 is SDS PAGE, one spot may contain multiple components. No matter what, the molecular weight of the protein from SDS PAGE reflects the real molecular weight of the protein except the protein is dissociated during denature or electrophoresis. The molecular weight of protein in database is the theoretical molecular weight predicted from sequence, where the signal peptide removal or various modification is not considered until it is reported by some paper. Thus the molecular weight is a very important parameter to Verify the modifications. For example, the theoretical MW of insulin or bovine serum albumin in database is more than their experimental MW due to signal peptide removal.
I think the result you get is very interesting. If database match gives very good score, one of the proteins may contain this fragment, but definitely, the protein given is not the protein you are looking for since such huge discrepancy on molecular weight, especially the theoretical MW much less than experimental MW. You could do a FASTA or BLAST homology search to see if there is any other proteins contain this peptide. However, this only can give you some clue, not the final answer.
There are several ways to verify:
1. get better separation of proteins using 2D gel or affinity(maybe more specific since you are looking for antibody, assuming you already know the antibody)
2. multiple peptides fragmentation in MS/MS to improve match, or using instruments with better mass accuracy.
If you could find proteins with multiple modifications, it will be more interesting. Anyway, good luck.
质谱鉴定出来的蛋白理论分子量比实际1D胶预测出来有差别是很常见的。
蛋白比理论分子量低：
1。通常是蛋白断裂（在生理条件被酶切断），或降解。
2。检索出的蛋白是蛋白前体， 实际上存在的是修饰过的蛋白。如果是蛋白前提，但报告的是蛋白，就是相反。
3。胶分离不好。 见下。
蛋白比理论分子量高：
1。蛋白量太大， 或胶跑的不好，造成蛋白分离不好，拖尾。丰度高的蛋白会在整个胶出现。 最多见。
2。蛋白修饰，会改变分子量， 但通常是使这个蛋白条带变宽。
3。蛋白前提， 没有修饰的蛋白会比检索的蛋白分子量高。
4。二聚体或多聚体形式。
所以你的监测的蛋白是在实际分子量2倍，一个考虑是蛋白分离不好，另外考虑是2聚体形式。 这都可以用western证实。
如果有做够的多的多肽片断，质谱检测蛋白是相当可靠的。 蛋白存在在与理论分子量相差很大的必定有其原因。
哦，对了。 我说的是指的你的质谱数据可靠，多肽和蛋白匹配都很好的情况下。 所以首先要确定质谱和检索是正确的。
谢谢，怎么检测是聚体形式呢？一般来说跑胶后，二聚体间的二硫键是被破坏掉的啊
二聚体可以是共价键结合的, SDS下加热也并不完全破坏二聚体结构. 具体原因我不清楚, 可能是加热后冷却过程,重新形成二聚体, 或根本不破坏二聚体.
有2个例子可以证明, Lamban是5聚体, 做western前要加热变性蛋白, 但western结果上可以看到多个条带,对应5聚体到单体.
下面的图示是一个单一蛋白, 可以看到2条带, 上面那条就是二聚体, 分子量在75KD左右, 单体在38K左右.
二聚体检测用western就可以看到, 如果看到单体成分和二聚体2条带, 分子量正好是倍数关系, 加上质谱结果, 没有人会否认不是二聚体.
非常感谢，我的分子一个是100KD，现在质谱回报是50KD，可能是二聚体，单体与重链重合。
另一个分子是120KD，现在质谱回报是某个蛋白分子的亚基，这个蛋白分子约64KD，可能是二聚体，抗体重链比较粗，单体可能与重链重合或无单体形式
这应该是个比较合理的解释吧
WESTERN验证用单体就可以了吧
可能，western应该看到的和质谱鉴定的一样。
紧急求助,又做了一次质谱
再次请教大家,目的是检测肿瘤的抗原,IP的一维电泳染色目的条带的二次质谱的结果为---某种抗体的重链,分子量为50KD,而做WESTERN和IP的目的蛋白分子量都为100KD,是否有可能?如何解释?谢谢
质朴是maldi tof 还是maldi tof tof,用pmf很难鉴定一个蛋白,你做串联后再说
western ip于你的抗体质量有关,可能是交叉反应的结果.
我有点不是很明白，你的目的应该是鉴定一个蛋白，从你告诉我的信息看，你已经做了IP和WB，这说明你已经鉴定了呀！
质谱分析只是辅助，其最终鉴定还得借助于WB，既然WB已经有结果，那么质谱可以不用管了，再说影响质谱的因素那么多。
是ESI二次串联质谱，不是pmf，目的是鉴定抗原是什么分子（抗原未知），但是分子量差50KD，即使是交叉反应，比如假阳性，和不应该反应的分子反应了，那分子量不应该相差太多啊，下一步怎么办，大家出出主意啊
这样想就简单了:
ms 数据库是已知蛋白或假定蛋白的肽段库,未知的蛋白应该先纯化后转膜做edman 测N端序列,反转序列后去total mRNA中pcr找基因.
交叉反应是相似表位就可以了,当然于分子量没太大关系.
二聚体在SDS中通常也存在,解聚的关键是Reducing agent,而不是detergent.
加大DTT或beta-ME的量才可以减少这个的比例.
看了半天没有明白你什么意思。
你说：目的是检测肿瘤的抗原,IP的一维电泳染色目的条带的二次质谱的结果为---某种抗体的重链,分子量为50KD,而做WESTERN和IP的目的蛋白分子量都为100KD。
我理解的是你质谱只找到了用于IP的抗体, 而没有找到目的蛋白. 因为用于pull down的抗体量比目的蛋白量多很多, SDS PAGE会出现丰度高的蛋白在整条带都出现. 所以无论在100 KD 或 20KD 的位置都可以找到Ig G. 不知道你在胶上看到了100 KD附近有条带没有?
maldi-tof 应该是很好的啊，不用怀疑啊
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&&请教一个关于质谱的问题
请教一个关于质谱的问题
质谱的分子离子峰一般都是 分子量+1
那么对于含氮化合物来说呢？我做了一系列类似的化合物，用HPLC-MS的质谱做了，我就认为的挑选分子量+1 的峰作为分子离子峰， 可是文章审回来说，所有的HRMS都是错误的！！郁闷，想请教一下，分子量一般在什么时候+1，&&+2？？？
还有就是HPLC-MS中的质谱数据可以用来发表文章，替代高分辨质谱吗？一般他的准确数值是整数部分，还是小数点后一位？？
对质谱实在是太搞不懂了！！唉，惭愧:rol:
是ESI阳离子， 可是在分子量周围出现了好几个峰，比如分子量是200，结果在200，201，202 都出来了峰，虽然高低不一，但是实在难说哪个是分子离子峰，写文章到底该写成200？201？202，
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主题：【已应助】【求助】关于质谱图相似度的问题
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发表于： 22:00:28
小弟原来作GCMS的。现在作个LCMS的质谱图。我知道LCMS是没有标准谱图库的。可我进完了标准品得到一个质谱图。再进样品，又得到一个质谱图。那么怎么对这两张图进行比较呢？不会只是口头上给人家说一下。这两个很相似就完了吧。是不是也应该有一个相似度的概念？还是说不要这种相似度，只要有共同的碎片，丰度看上去差不多就完了。（这样是不是觉得太不科学了？）我以前用GCMS把实验得到的谱图和标准图比较的时候可以得到一个相似度。那么这相似度是如果得到的？有公式吗？在进行液质定性的时候是不是也要进行这种计算？虽然不是和标准库对。可样品是不是也应该和标准品对照一下？计算一下？
15:49:43 Last edit by hujiangtao
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液质一般是看相对离子丰度的偏差,如下图这个:
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上图为引用自附件“GB/T
鳗鱼及制品中十五种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法”的“页面５”，请查看，希望对你写文章有用，呵呵！以后还是尽量用发帖吧，又没有什么隐私内容的不必用站内短信，而且大家可以共同讨论，谢谢啦！
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不是因为怕别人知道。是怕老大你没工夫看小弟的帖子第二回。嘿嘿。我急用所以就找了。嘿嘿。知道了。以后会照你说的作的。
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原文由 anpangzi 发表:不是因为怕别人知道。是怕老大你没工夫看小弟的帖子第二回。嘿嘿。我急用所以就找了。嘿嘿。知道了。以后会照你说的作的。呵呵，这么说就受不起了，大家都是一样的，互相学习嘛~―~　只要有在的话能帮的上的一定都会做的。
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原文由 capinter 发表:液质一般是看相对离子丰度的偏差,如下图这个:又长见识啦
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气质的质谱条件是统一的，即EI70ev，但LC-MS的条件参数相对会多一点，并且不同厂家的参数值并不是统一的，这也是其没有建立统一谱库的原因，所以如果要说明物质的匹配度，首先要将仪器的型号，条件详细说明，然后再给出的特征离子的匹配度
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原文由 capinter 发表:液质一般是看相对离子丰度的偏差,如下图这个:又学一招啊
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我想问一下，测定分子质量1000左右的肽段并且想要得到它的一级氨基酸组成，可以用质谱吗？哪种类型的质谱比较好?另外质谱可以分析游离氨基酸吗？
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modi-tof和ESI是什么质谱，现在哪种质谱的灵敏度最高？ maldi是基质辅助激光解析电离，特别适合与飞行时间质谱仪（tof）组成maldi-tof& && && && && && && &esi是电喷雾离子源& &
建议你找本质谱的书看看
不可以恨这个世界。因为你那么爱它它不会让你失望的。美丽的并非这个世界。而是接受了这个世界的你的眼神。
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飞行时间质谱，先做一级质谱，再做二级，可以分析，不过需要自己认真比对
爱人者被爱，敬人者人敬
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质谱的条件和检测有关吗，有什么具体的关系吗？
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