蛋白质的液相色谱复性--《第四军医大学》2002年硕士论文
蛋白质的液相色谱复性
【摘要】：
本文研究了变性蛋白质在不同种类液相色谱上的复性情况。分别用高效疏水色谱(HPHIC)和高效离子交换色谱(HPIEC)对盐酸胍、尿素、SDS变性的11种蛋白质进行了复性和保留行为的研究。11种蛋白质中有5种可以在HPHIC上得到复性。结果显示：其中分子量小、结构简单的蛋白质复性效果好，分子量大、含有辅基、结构复杂的复性效果差。复性效果好的蛋白质不仅复性效率高，而且保留时间、峰型及Z值均与天然蛋白相似。盐酸胍变性的蛋白质复性后的质量回收率和活性回收率均高于尿素，SDS变性的蛋白质构象难以恢复，复性效果最差。在HPIEC上，复性的蛋白质也表现出相似的结果。但是只有3种蛋白获得复性，而且质量和活性回收率普遍低于HPHIC，Z值、保留时间虽然与天然蛋白相近，但峰型相对较差，复性条件的选择也较HPHIC困难。蛋白质在疏水作用色谱上的复性效果优于离子交换色谱。
其次，我们又用二硫苏糖醇(DTT)将胍变及脲变核糖核酸酶(RNase)的二硫键打断，加入氧化型谷胱苷肽(GSSG)，然后用HPHIC、HPIEC和排阻色谱(SEC)对其进行复性。对二硫键断裂的RNase在三种色谱上的复性效果进行比较的同时，还研究了色谱固定相、变性剂、氧化-还原剂对复性的
第四军医大学硕士学位论文
影响。研究发现：三种色谱固定相均对RNase的复性有所贡献。RNase在
HPHI、HPIEC上的质量和活性回收率高于SEC。用三种色谱法对RNase进
行复性时，在流动相中加人低浓度的变性剂门刀mow
GuHCI或ZomollL
Uea），可以提高RNase的复性效率。也可以通过选择合适的氧化剂、还原剂
的比例提高复性效率，如狐变RNase在Dry与GSSG的浓度比为1：2＊，
腺变RNase为1：2七时，RNase的质量和活性回收率较高。
【关键词】：
【学位授予单位】：第四军医大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2002【分类号】：R341【目录】：
英文缩略词表5-7
中文摘要7-9
英文摘要9-11
一 研究基因重组蛋白质复性的意义11-12
二 蛋白质的变性12-13
三 折叠复性机理及理论13-15
四 目前使用的蛋白质复性的方法15-25
五 复性过程的监测方法25-26
六 结束语26-27
理论部分27-31
一 高效疏水作用色谱的计量置换模型27-29
二 高效离子交换色谱的计量置换模型29-31
第一部分 变性蛋白质的液相色谱复性31-65
方法及材料31-35
实验第二部分 还原型变性蛋白质的液相色谱复性65-81
方法及材料65-66
参考文献83-88
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京公网安备75号重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子发酵工艺和液相色谱法对其复性并同时纯化--《西北大学》2005年硕士论文
重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子发酵工艺和液相色谱法对其复性并同时纯化
【摘要】：液相色谱(LC)对变性蛋白复性是近年来迅速发展起来的一种新的方法,它能够显著地提高蛋白复性效率,并同时使蛋白得到纯化,目前已成为国际上的研究热点。本论文先对大肠杆菌(E. coli)表达的rhGM-CSF进行了发酵工艺和放大工艺的研究和优化,得到高表达、高产量的包涵体,然后分别用疏水色谱(HPHIC)、离子交换色谱(HPIEC)、排阻色谱(SEC)对rhGM-CSF进行了复性并同时纯化。
论文包括以下五个部分:
简要的介绍了蛋白质复性的意义,对近年来发展起来的蛋白质复性新方法进行了系统地综述。对rhGM-CSF的复性及分离纯化研究进展进行了评述。引用文献99篇。
2.rhGM-CSF摇瓶发酵工艺和放大工艺的研究
通过摇瓶发酵对大肠杆菌DH5α/pDH生产rhGM-CSF的培养基、培养温度、诱导时机、诱导维持时间、接种量等进行了研究,选择了较好的摇瓶培养条件。结果表明,大肠杆菌适宜在32℃进行培养,在对数生长前期升温至42℃诱导4～5小时,可获得较高的表达量rhGM-CSF。同时进行了发酵工艺的放大研究。
3.HPHIC对rhGM-CSF复性并同时纯化
成功应用高效疏水色谱(HPHIC)对E. coli表达的rhGM-CSF进行了复性和纯化,研究了固定相、盐种类、流动相pH、流动相中脲浓度,GSH/GSSG比例等因素对rhGM-CSF复性和纯化的影响。在优化条件下,经一步HPHIC可以得到比活为1.58×10~7IU/mg,纯度为95.7%,质量回收率为56.8%的rhGM-CSF。
4.HPIEC对rhGM-CSF复性并同时纯化
采用HPIEC法成功对7.0mol/L盐酸胍变性的rhGM-CSF进行了复性并同时纯化,考察了流动相pH、流动相中脲浓度、GSH/GSSG比例等因素对rhGM-CSF复性的影响。结果表明,GSSG/GSH可有效提高rhGM-CSF二硫键的正确对接和复性效率,而低浓度的脲则可有效抑制蛋白沉淀,可大大提高质量回收率。在最优化条件下,HPIEC一步可使rhGM-CSF在分离纯化的同时进行复性,其比活为
【关键词】：
【学位授予单位】：西北大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2005【分类号】：TQ464【目录】：
第一章 前言11-26
1．1 蛋白质复性的意义11
1．2 蛋白质复性技术11-13
1．2．1 稀释复性12
1．2．2 辅助因子和添加复性技术12-13
1．2．3 固定化辅助因子复性13
1．3 蛋白质的液相色谱法复性13-16
1．3．1 HIC14-15
1．3．2 SEC15
1．3．3 IEC15-16
1．3．4 AFC16
1．4 二硫键的正确对接16-18
1．5 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)概述18-21
1．5．1 hGM-CSF基因的克隆和表达18-19
1．5．2 包涵体的处理19
1．5．3 rhGM-CSF的复性19-21
1．5．4 rhGM-CSF的纯化21
参考文献21-26
第二章 大肠杆菌生产rhGM-CSF摇瓶发酵工艺和放大工艺研究26-39
2．1 前言26
2．2 实验部分26-30
2．2．1 仪器与试剂26
2．2．2 菌株与主要试剂26-27
2．2．3 实验方法27-30
2．3 结果分析30-31
2．4 结果与讨论31-37
2．4．1 培养基种类对rhGM-CSF表达的影响31-32
2．4．2 培养温度对E． coli生长的影响32-33
2．4．3 诱导时机对E． coli生长和rhGM-CSF表达的影响33-34
2．4．4 诱导维持时间对E． coli生长和rhGM-CSF表达的影响34
2．4．5 接种量对E． coli生长和rhGM-CSF表达的影响34-35
2．4．6 优化条件下大肠杆菌DH5α/PDH/rh GM-CSF的培养35-36
2．4．7 rhGM-CSF发酵的放大36-37
2．5 结论37-38
参考文献38-39
第三章 疏水色谱法对rhGM-CSF的复性并同时纯化39-54
3．1 引言39
3．2 理论部分39-41
3．3 实验部分41-44
3．3．1 仪器和设备41
3．3．2 主要试剂41-44
3．4 结果与讨论44-51
3．4．1 用HPHIC色谱饼复性并同时纯化rhGM-CSF44-45
3．4．2 固定相的影响45
3．4．3 盐种类的影响45-46
3．4．4 流动相pH值的影响46-47
3．4．5 流动相中GSH/GSSG的比例对rhGM-CSF复性和纯化的影响47-48
3．4．6 流动相中脲浓度对rhGM-CSF复性和纯化的影响48-49
3．4．7 HPHIC与稀释法的比较49-50
3．4．8 rhGM-CSF的纯度和质量回收率50-51
3．4．9 HPHIC复性过程中rhGM-CSF的质量损失51
3．5 结论51-52
参考文献52-54
第四章 离子交换色谱法对rhGM-CSF的复性并同时纯化54-64
4．1 引言54
4．2 复性原理54-55
4．3 实验部分55-56
4．3．1 仪器55
4．3．2 试剂55-56
4．3．3 rhGM-CSF包涵体的洗涤、破碎、抽提56
4．3 4 Bradford法测定蛋白含量56
4．3．5 rh GM-CSF活性的测定56
4．3．6 离子交换色谱法对rhGM-CSF粗提物的复性和纯化56
4．3．7 稀释法56
4．4 结果与讨论56-62
4．4．1 HPIEC对rhGM-CSF包涵体提取液的分离纯化56-57
4．4．2 流动相pH值的影响57-58
4．4．3 流动相中GSH/GSSG对rhGM-CSF复性和纯化的影响58-60
4．4．4 流动相中不同脲浓度对rhGM-CSF复性和纯化的影响60-61
4．4．5 HPIEC与稀释法的比较61-62
4．4．6 rh GM-CSF的纯度和质量回收率62
4．5 结论62-63
参考文献63-64
第五章 排阻色谱法对rhGM-CSF的复性并同时纯化64-76
5．1 前言64
5．2 理论部分64-67
5．2．1 普通排阻色谱复性64-65
5．2．2 脲梯度排阻色谱复性65-67
5．3 实验部分67-68
5．3．1 仪器和材料67
5．3．2 主要试剂67
5．3．3 rhGM-CSF包涵体的洗涤、破碎、抽提67
5．3．4 Bradford法测定蛋白含量67
5．3．5 rhGM-CSF活性的测定67-68
5．3．6 用普通SEC复性rhGM-CSF68
5．3．7 用脲梯度SEC复性rhGM-CSF68
5．4 结果与讨论68-73
5．4．1 脲浓度对rhGM-CSF复性的影响68-69
5．4．2 流动相pH对rhGM-CSF复性的影响69-70
5．4．3 流动相流速对rhGM-CSF复性影响70-71
5．4．4 GSH/GSSG比例对rhGM-CSF复性的影响71-72
5．4．5 rhGM-CSF纯度和质量回收率72-73
5．4．6 脲梯度SEC复性rhGM-CSF73
5．5 结论73-75
参考文献75-76
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王海英;[D];安徽农业大学;2009年
邵玲莉;[D];江南大学;2004年
王瑞霞;[D];河南农业大学;2005年
陈文芳;[D];山东大学;2005年
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2015年新色谱柱及配件大盘点之生物色谱法
本文综述了匹兹堡展览会上介绍的上一年度新的液相色谱(LC)柱和配件。今年,这篇综述由前&创新高效液相色谱&和&观点验证&专栏的创始人Michael Swartz撰写。
由Ron Majors撰写的关于匹兹堡分析化学和应用光谱学学术报告会和展览会综述性文章的年刊已经发行了32年。这些综述首次出现在1983年5月的&Column Watch&专栏的第二部分。每年，Majors都会总结在匹兹堡会议上介绍的新的色谱柱和样品制备仪器，同时也会阐述这些技术发展的重要性并分析其未来的发展趋势。多年来，该综述文章已经成为该领域最新进展的参考标准，我很荣幸地成为今年综述的客座作者。
杂志LCGC(液相气相色谱)决定在一些方面做出改变。本文将围绕2014年匹兹堡会议上介绍的各种色谱法，所涉及的分离柱和相关设备分别进行介绍，包括样品的制备以及气相色谱法（GC）的相关内容。
按照色谱柱类型和色谱类型进行划分，大致分为:传统的反相、核-壳、亲水作用色谱(HILIC)、离子交换、超临界流体色谱、生物分子和离子色谱法等，以及相关的设备。本专栏的目的是总结过去一年中大多数供应商推出的新品以及目前的发展趋势，为以应用领域为代表的研究提供更多的信息。本部分主要介绍生物色谱。
生物色谱法（Biochromatography）是20世纪80年代中后期问世，由生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种极具发展潜力的新兴色谱技术。它利用药物产生效应（或毒性）一般是通过药物与靶点即生物大分子包括受体、通道、酶等结合的原理，应用于药物活性成分的筛选、药物作用机理的研究。它使效应成分的分离与筛选结合在一起，进而探讨药物的作用机理，是化学成分－效应－作用机理联动的一种药物研究方法，尤其适合于天然药物效应物质基础的研究，其独特的优点为其展示了光明的发展前景。
一些供应商在过去的一年中推出了称之为& biocolumn &的色谱柱。在该综述中,这系列柱子应归为其他类别，但我根据它们的预期应用范畴为生物分子，所以我让它们自成一类。该类别的柱子包括离子交换、反相、或&专用&柱；所谓的&专用&柱指用于尺寸排阻色谱（SEC）、疏水作用的层析色谱（HIC ）、亲和色谱和HILIC等。表1归纳了给予回应的供应商所推出的用于生物分子分离的新产品。
表1：生物分子柱
Agilent Technologies
AdvanceBio RP-mAb
C4, StableBond C8, diphenyl
50-150 mm & 2-4.6 mm
450 &A SPP的多孔结构可以允许单克隆抗体通过。SPP可以降低扩散距离，减少由于mAbs缓慢扩散导致的峰展宽；可与HPLC和UHPLC系统兼容。
BIA Separations
QA, DEAE, EDA, anion exchange
1.5 &m pore
用于生物大分子（病毒、lgG、lgM和其他大分子蛋白质）的分析。流量高达30 CV /min
CIMac Adeno
QA, anion exchange
外径5.0 mm & 5.2 mm, 0.106 mL柱床体积
用于腺病毒的分离。流量可达20 CV/min。
CIMac pDNA
DEAD, anion exchange
1.5 &m pore
外径15 mm & 5.2 mm, 0.32 mL柱床体积
用于质粒DNA的分离。流量可达10 CV/min。
SO3, cation exchange
1.5 &m pore
外径5.0 mm & 5.2 mm, 0.106 mL柱床体积
用于大分子蛋白质、质粒DNA、病毒、病毒样颗粒和噬菌体的检测和定量。流量可达30 CV/min
Es Industries
MacroSep HP
C4, C8, C18, PFP, and phenyl
2.1, 3, 5, 10 &m
毛细管柱到制备柱
用于蛋白质、肽和其它生物化合物的快速分离。
ProVance Pre-packed Disposable Protein A
直径1.2-45 cm
一种一次性生物分子柱，可以加快纯化步骤；由于避免了后续的柱填料清洗的操作程序，可以提高整体的工作效率。由不可压缩树脂构成，可在高流速的情况下使用。
Thermo Fisher Scientific
MAbPac HIC-10, HIC-20, HIC-Butyl
HIC, polyamide, alkylamide, butyl
100,& 250 mm & 4.6 mm
一款独一无二的可以提供高分辨率、良好生物兼容性和互补的选择性的生物分子柱，可广泛地适用于分析mAb相关物质，包括mAb变体、氧化mAbs、mAb的聚集、抗体片段、ADsC和其他蛋白质。
Tosoh Biosciences
Ca2+, PO4, and OH- (calcium phosphate)
一款基于羟基磷灰石（磷酸钙）混合模式的柱，可用于纯化mAb和DNA，去除聚集物。
Toyopearl NH2-750F
Methacrylic polymer, primary amine
45 &m, &100 nm pore
可在高盐浓度的流动相条件下使用，0.3 Mpa下机械性能稳定，用于生物分子的纯化。
Protein Pak Hi Res HIC
HIC polymeth-acrylate butyl
35, 100 mm & 4.6 mm
适用于分析mAbs和ADC样品，分辨率高。在酸性和碱性条件下都很稳定，适用pH值范围为2-12。
Xbridge Protein BEH SEC
Diol-coated, ethylene-bridged, hybrid
30 mm & 7.8 mm (guard), 150, 300 mm & 7.8 mm
通过使用乙烯-桥连BEH颗粒来降低离子间相互作用；相较之硅基SEC粒子，高流速可增加样品的通量。用于蛋白质、肽、mAb和ADC的SEC分离。
YMC Co., Ltd.
BioPro SmartSep Q
Quaternary ammonium, anion exchange
10 and 30 &m
分析柱和大体积柱
在广泛的流速范围内，具有极低的非特异性吸附能力和高键合能力。可用于分离蛋白质、肽和核酸。
BioPro SmartSep S
Sulfobutyl, cation exchange
该类生物柱新产品中大部分柱子用于单克隆抗体（mAb）的分离，其方法包括HIC、反相色谱、亲和色谱（蛋白A ） ，或基于混合模式分离机制的方法。Agilent Technologies、Grace、Thermo Fisher Scientific、Tosoh Bioscience和 Waters公司等推出的HIC柱都是用于mAb分离的。Tosoh Bioscience也首次推出了一种羟基磷灰石混合模式的柱子（磷酸钙）用于mAb和DNA的纯化及去除聚集的CaPure-HA 。Grace公司推出了prepacked disposable protein A 亲和柱系列，统称为ProVance系列。他们都是一次性柱子，具有各种尺寸规格，用于药品生产质量管理规范（GMP ）中单克隆抗体的净化。一次性柱有助于简化纯化步骤、提高整体生产力，因为使用一次性柱不再需要繁琐的化学清洗和填充的程序。ProVance系列柱填充的是一种不可压缩的树脂，该树脂可以维持高流速下良好的柱性能，与琼脂相比，该树脂成本更低。
Agilent Technologies 公司推出的SPP系列柱统称为AdvanceBio RP-mAb。可以填充三种不同的填料：C4、StableBond C8和二苯基，AdvanceBio RP-mAb系列柱专门为反相单克隆抗体分离设计。450&A的SPP多孔结构，完全可以作为单克隆抗体的通道。如标准的SPP，AdvanceBio粒子技术可以缩短扩散距离，从而减少mAbs缓慢扩散导致的带展宽，并可与HPLC和UHPLC系统完美的兼容。
Thermo Fisher Scientific 推出了MAbPac HIC 系列柱，其填料为三个特殊的化合物： MAbPac HIC-10(专有聚酰胺)，HIC-20(专有烷基酰胺)和HIC-Butyl；用于分析和表征大多数mAb相关样本，包括mAb变体、氧化的mAb、mAb聚集、抗体片段、抗体药物复合物(adc)和其他蛋白质。HIC-10和HIC-20柱固定相为多孔材料(孔径1000 &A)，HIC-Butyl柱的固定相则为无孔的亲水聚合物。这些独特的填充化合物都具有提高分辨率、生物相容性、增强选择性等作用，广泛地适用于mAbs及其相关物质的分离。
Waters 首次推出了ProteinPak Hi Res HIC 柱，用于分离mAbs和ADCs等蛋白质。填料为聚甲基丙烯酸酯，粒径为2.5 &m，ProteinPak Hi Res HIC 柱用强酸或强碱清洗都是稳定的，pH值可在2-12之间。最近Waters还推出了另一款色谱柱，XBridge Protein BEH SEC column。XBridge柱使用二元醇固载、乙烯为交联桥，填料微粒尽量最小化以消除离子间相互作用的干扰，可以在较高的流速下运行(相较之硅基SEC填料)。这些柱子的质量控制(QC)采用蛋白质和肽标准样品进行测试，也可用于直接从供应商处购买，常用于蛋白质、多肽、mAb和ADC的分离。图2出示了XBridge Protein BEH SEC column在实际样品分离中的一个示例。
图1:Waters公司的XBridge Protein BEH SEC柱（125 &A）在蛋白质分离中的示例图
柱规格：150 mm & 7.8 mm，3.5 &m；流动相：30%的乙腈，0.1%三氟乙酸；柱温：30 &C；流量：0.84 mL/min。各峰对应的物质：峰1=泛素(8565兆瓦)，峰2=抑肽酶(6511兆瓦)，峰3=血管紧张素(1296兆瓦)，峰4=缓激肽(1060兆瓦)，峰5=Asp-Leu-Trp-Gln-Lys(618兆瓦)。 (图由Waters公司。)
ES Industries 公司今年发布了一款面向生物分子的纯反相色谱柱。MacroSep HP包括C4、C8、C18、PFP和苯基固定相，具有各种常见的规格，尺寸从毛细管柱到制备柱。MacroSep HP 系列柱对于蛋白质、肽和其他生物化合物具有高分离度。
几种离子交换相被推出用于生物分子的分离。BIA Separations 公司推出了三种阴离子交换柱和一种阳离子交换柱。CIMac，CIMac Adeno，CIMac pDNA 柱为阴离子交换整体柱，用于分析大型生物分子和病毒、腺病毒和质粒DNA。CIMac SO3柱是一种阳离子交换整体柱，用于大分子蛋白质、质粒DNA、病毒、类病毒颗粒和噬菌体的监测和定量。整体柱的介质为对流作用的介质，不受扩散限制。所有的BIA柱都可以在各种配置的情况下通用，适用于低、高流速，是过程分析技术(PAT)中的可靠工具。
Tosoh Bioscience公司也推出了一款阴离子交柱，即Toyopearl NH2-750F。它以一种半刚性的甲基丙酸烯聚合物珠为固定相，可在压力高达0.3 MPa时运行。由于其可以承受高盐浓度的流动相，所以非常适合用于除杂、DNA的净化和mAb的净化。
YMC公司推出了名为BioPro SmartSep Q/S 系列的离子交换柱，用于分离蛋白质、多肽和核酸。其中&Q&代表一种季铵盐阴离子交换树脂，其中&S&代表一种丁磺基阳离子交换树脂。由于阴阳离子之间的平衡键合作用和填料自身的坚硬度导致该类柱子的机械稳定性高，故扩大了该系列柱子的使用流量范围。通过优化填料表面的修饰，可以获得更广泛的运行流量，大大地提高了色谱柱的净化能力。
译自：chromatographyonline
来源：材料与测试
译者：兔子小光
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