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基于β-环糊精的pHGSH响应羧甲基壳聚糖胶束的研究.pdf 61页
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基于β-环糊精的pHGSH响应羧甲基壳聚糖胶束的研究
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独 创 性 声 明
本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及
取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，
论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得
武汉理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一
同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说
明并表示了谢意。
学位论文使用授权书
本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即
学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，
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关机构或论文数据库使用或收录本学位论文，并向社会公众提供信息
（保密的论文在解密后应遵守此规定）
研究生（签名）：
导师（签名）：
中 文 摘 要
6-巯基嘌呤是一种广泛应用于临床的抗代谢药物，然而因该药物存在水溶性
差、生物利用度低、选择性差和毒副作用严重等缺点，在临床中的应用受到了
极大限制。针对这些问题，目前比较常见的方法是通过某种共价键连接臂，将
药物与高分子载体进行连接而制得高分子前药。然而，这类方法普遍存在制备
方法复杂、操作繁琐以及有毒物质残留等缺点。针对这些缺点，本文采取两亲
性包合物自组装策略，利用 β-环糊精与 6-巯基嘌呤二聚物之间的包合作用，设
计制备出一种 pH/GSH
响应羧甲基壳聚糖胶束，该胶束在血液循环系统中可保
持稳定，进入癌细胞中，可响应癌细胞内较低的pH 与较高的谷胱甘肽（GSH ）
浓度而快速释放出6-巯基嘌呤。主要工作与结论如下：
一、制备了一种两亲性包合物，对该包合物的结构进行了表征，对相关性
质进行了测定。
将壳聚糖（CS ）与β-环糊精（β-CD ）分别羧甲基化后，得到羧甲基壳聚糖
（CMCS ）与羧甲基-β-环糊精（CM-β-CD ）。通过CM-β-CD 的羧基与CMCS 上
氨基之间的酰胺反应，制得亲水性的环糊精羧甲基壳聚糖（CMCS-g-β-CD ）。6-
巯基嘌呤（6-MP ）经碘单质氧化后得到疏水性的 6-巯基嘌呤二聚物（DMP ）。
在水溶液中，疏水性的DMP 仅部分嵌入β-CD 内腔，与亲水性的CMCS-g-β-CD
形成一种两亲性包合物（CMCS-g-β-CD·DMP ），利用红外光谱、差示热分析法
以及核磁共振波谱对中间产物与目标产物的结构进行了表征。通过调整DMP 与
CMCS-g-β-CD
之间的投料比，制得 DMP
含量不同的三组包合物，经元素分析
法测得DMP 的含量分别为7.34wt%、9.37wt%和10.21wt%。
二、采取两亲性包合物自组装策略，制备pH/GSH 响应羧甲基壳聚糖胶束，
对该胶束的形貌进行了观察，对该胶束的稳定性、pH 敏感性、还原响应性进行
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标题: PH值过低会对细胞有多大影响?(培养液)
摘要: [PH值过低会对细胞有多大影响?(培养液)] 我今天测配好的DMEM培养液PH值,不到6 7,这对细胞到底会产生多大的影响?我现在只有一瓶细胞,该怎么办呢?就用那个培养液么?望各位高手指点!!!不甚感激! 关键词:[培养液]……
我今天测配好的DMEM培养液PH值,不到6.7,这对细胞到底会产生多大的影响?我现在只有一瓶细胞,该怎么办呢?就用那个培养液么?望各位高手指点!!!不甚感激!
回复培养基随着放置的时间加长CO2就会析出，就会变碱性，再说细胞一般是耐酸不耐碱的回复我的培养液是用ＮＡＯＨ调定的ＰＨ，所以不用考虑ＣＯ２析出这个因素．我想知道ＰＨ过低了会对细胞有多大影响呀？回复如果已用过此培养基目前细胞状态还可以,就赶紧重调pH值接着用,反正你也就一瓶细胞了,试试看.有一段时间我们实验室pH计测的不准,肉眼观察明明怀疑偏酸,可却显示7.2,我们也就那样用了,细胞也还可以.回复影响细胞生长吧,就像细胞不换液,代谢产物积聚,导致细胞生长缓慢甚至不生长回复最好还是调一下,目前你的细胞状态若还好,长期这样,生长就可能影响,我以前也遇过
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电话：021-丝酵母生产谷胱甘肽过程控制与优化_甜梦文库
丝酵母生产谷胱甘肽过程控制与优化
江南大学 博士学位论文 产朊假丝酵母生产谷胱甘肽过程控制与优化 姓名：梁国斌 申请学位级别：博士 专业：发酵工程 指导教师：堵国成
摘要摘要谷胱甘肽（ＧＳＨ）作为一种具有丫．谷氨酰基和巯基的生物活性三肽，是由谷氨 酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成。ＧＳＨ可清除胞内超氧物因离子和自由基，保护细胞膜的完整性，具有抗脂质氧化作用，使细胞免受伤害，从而维持细胞正常代谢。因而，ＧＳＨ在食品、医药、保健、抗衰老方面的应用日益广泛。与其他生产ＧＳＨ的方法（活性组织提取、化学合成和酶转化法）相比较，微生物发酵法是目前ＧＳＨ工业化生产的最普遍方法之一。本论文以一株高积累ＧＳＨ 的产朊假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌ西ＷＳＨ ０２．０８）为出发菌株，以实现ＧＳＨ发酵高产 量、高得率和高生产强度为目标，采用增加细胞密度（流加培养）、提高胞内ＧＳＨ 含量（前体氨基酸添加、ＡＴＰ再生）以及环境胁迫等一系列技术与策略，对ＧＳＨ发酵过程进行优化控制，主要研究内容如下： （１）考察了分批培养、指数速率流加和恒速流加对细胞生长和ＧＳＨ合成的影 响，并提出了三阶段（分批培养、指数速率流加和恒速流加）细胞高密度培养策 略。分批培养时初糖（葡萄糖）浓度为１５ ｅ，ｍ，发酵９ ｈ时葡萄糖消耗完毕，经过１２ｈ指数速率流加（比生长速率为０．２ ｈ。１），和２４ ｈ恒数流加（补糖速度为５．５ ｇ／Ｌ／１１）， 发酵培养４５ ｈ后，细胞密度达１０２ ｅ，ｍ，ＧＳＨ浓度为９８１ ｍｇ／Ｌ。（２）在细胞高密度培养基础上，考察了半胱氨酸添加对ＧＳＨ合成的影响，一次 性添加半胱氨酸为５０ ｍｍｏｌ／Ｌ时，ＧＳＨ产量达最大值１５３４ ｍｇ／Ｌ；由于胞内ＧＳＨ的大量积累会对谷氨酰半胱氨酸合成酶（ＧＳＨ Ｉ）活性产生反馈抑制作用，因而进一步考察低ｐＨ胁迫与半胱氨酸添加相结合对ＧＳＨ合成的影响，将５０ ｍｍｏｌ／Ｌ半胱 氨酸分两次（每次２５ｍｍｏｌ／Ｌ）添加并与低ｐＨ胁迫结合促进ＧＳＨ合成，最终ＧＳＨ 总产量达１８２５ ｍｇ／Ｌ。（３）当半胱氨酸添加量为５０ ｍｍｏｌ／Ｌ时，发现用于ＧＳＨ合成的半胱氨酸仅为其 添加量的４％，为此，考察了溶氧对半胱氨酸吸收和ＧＳＨ合成的影响，并提出了 两阶段溶氧水平控制与半胱氨酸添加相结合的策略来促进ＧＳＨ合成，结果半胱氨酸的添加量由５０ ｍｍｏｌ／Ｌ减少到３０ ｍｒｎｏｌ／Ｌ；添加量降低了４０％，而ＧＳＨ产量却 达到１７３４ ｍｇ／Ｌ，比对照提高了１３％。最后将ｐＨ胁迫和溶氧控制同时与半胱氨酸添加（添加浓度为３０ ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ）相组合，通过低ｐＨ胁迫和两阶段溶氧控制，ＧＳＨ终产量达１９３６ ｍｇ／Ｌ，比对照提高了２６％。（４）研究摇瓶条件下细胞生长阶段谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸对细胞生长和ＧＳＨ合成的影响，与添加谷氨酸和半胱氨酸相比，添加甘氨酸对细胞生摘要长和ＧＳＨ合成均有促进作用，当２ ｈ时添加６ ｍｍｏｌ／Ｌ甘氨酸，发酵到第１０ ｈ时，细胞密度和ＧＳＨ产量达１０．４１ ｇ／Ｌ和１２５ ｍｇ／Ｌ，分别比对照提高了１０．１％和３４．１％。 （５）细胞停止生长后，加入三种氨基酸，并通过Ｃｅｎｔｒａｌ．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ实验优化得 到三种氨基酸最佳浓度配比（谷氨酸６ ｍｍｏｌ／Ｌ、甘氨酸５．５ ｍｍｏｌ／Ｌ、半胱氨酸６．５ｍｍｏｌ／Ｌ），经过３０ ｈ培养，ＧＳＨ总产量达２７８ｍｇ／Ｌ。两阶段氨基酸添加使细胞干 重和ＧＳＨ产量达到１０．４ ｇ／Ｌ和２７８ ｍｇ／Ｌ，将此策略应用于７ Ｌ罐上，细胞干重和 ＧＳＨ产量分别为１２．８１９／Ｌ和３２８ ｍｇ／Ｌ，进一步将两阶段氨基酸添加策略与细胞高 密度培养相结合时，最终ＧＳＨ产量可高达１９５２ ｍｇ／Ｌ，胞内ＧＳＨ含量为１．８１％。（６）在两阶段氨基酸添加基础上，考察了发酵后期胞内前体氨基酸浓度、ＡＴＰ含量和ＧＳＨ Ｉ活性变化，发现ＧＳＨ停止合成的主要原因是由于ＡＴＰ不足所致。 通过添加ＡＴＰ促进ＧＳＨ继续合成，当ＡＴＰ添加量为３ ｇ／Ｌ时，ＧＳＨ总产量达２１４１ｍｇ／Ｌ：细胞进一步经ＳＤＳ处理后，ＡＴＰ添加量为２ ｇ／Ｌ时，ＧＳＨ总产量可达２１５３ｍｇ／Ｌ，而ＡＴＰ用量则可减少３３％；此外，通过补加葡萄糖和硫酸铵再生ＡＴＰ促 进ＧＳＨ合成，结果ＧＳＨ总产量为２１６３ ｍｇ／Ｌ，与直接添加ＡＴＰ相比，成本显著下降，说明该策略具有很好的实用性。（７）Ｈ２０２胁迫对ＧＳＨ合成影响结果表明，Ｈ２０２可促进ＧＳＨ合成但同时又会抑制细胞生长，为此提出在细胞生长期添加低浓度Ｈ２０２和细胞停止生长时添加高浓度Ｈ２０２的Ｈ２０２多次（６ ｈ添加１ ｍｍｏｌ／ＬＨ２０２、８ｈ添加２ ｍｍｏｌ／ＬＨ２０２、１０ｈ添加４ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈ２０２）胁迫策略，摇瓶分批发酵结束时（３０ ｈ），ＧＳＨ产量为１８８ ｍｇ／Ｌ，胞内ＧＳＨ含量达２．０５％。将此策略应用于７ Ｌ罐上，发酵３０ ｈ时细胞干重和ＧＳＨ产量分别为１０．２１９／Ｌ和２５８ ｍｇ／Ｌ，进一步将此策略应用于７ Ｌ罐上和细胞高密度 培养相结合，发酵结束（６０ ｈ）时，ＧＳＨ产量高达１４８２ ｍｇ／Ｌ，胞内ＧＳＨ含量为 １．５２％，分别比对照提高了３２％和３８％。同时，Ｈ２０２胁迫使胞内过氧化氢酶和ＧＳＨ还原酶活性明显增强，说明ＣＡＴ和ＧＳＨ直接参与了清除胞内Ｈ２０２和其它活性氧离子。（８）对Ｎａ２Ｓ０４胁迫促进ＧＳＨ合成机理进行初步探讨，结果表明Ｎａ２Ｓ０４胁迫可 使胞内半胱氨酸含量、ＧＳＨ Ｉ酶活性、ＧＳＨ还原酶（ＧＲ）活性显明提高，进而促进ＧＳＨ合成。关键词：谷胱甘肽，产朊假丝酵母，发酵过程优化，细胞高密度培养，氨基酸添加，ＡＴＰ再生，环境胁迫ⅡＡｂｓｔｒａｃｔＡｂａｔｒａｃｔＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ＧＳＨ），ａｓ （ＧＳＨ Ｉ）ａｎｄａｃｔｉｖｅ ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ，Ｃａｌｌ ｂｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｆｒｏｍ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃａｌｌａｃｉｄ，Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｉｎｅ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅｌｙ ｂｙ ７－ｇｌｕｔａｍｙｌ―ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ＧＳＨ ＩＩ）ｉｎｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＡＴＥ ＧＳＨ ｐｌａｙｓ ｍａｎｙａｓｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ，ｓｕｃｈｃｌｅａｒ ａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄａｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ，ｐｒｏｔｅｃｔ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｄｅｌａｙ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｔ ａｃｉｄｓ．Ａｓｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅｄｅｍａｎｄｆｏｒ ＧＳＨ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄｓ ｏｆ ｆｏｏｄ ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅａｎｄａｎｔｉａｇｉｎｇ ｉＳ ｅｖｅｒ－ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉＳ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｂＰ ＷＳＨ ０２－０８，ａ ｓｔｒａｉｎ ｔｈａｔＣａｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＳＨ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ，Ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆｏｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ａ ｓｅｒｉｅｓｏｆ ｆｅａｓｉｂｌｅ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｗｅｒｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｔｏ ｍａｘｉｍｉｚｅＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｏｆｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ ＷＳＨ ０２－０８ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｍａｉｎａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ（１）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｗａｙｓｏｎｅｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈａｎｄＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｈｉｇｈ ｅｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ（ＨＣＤ）ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｉｔｉａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｗａｓ １５９／Ｌ ｆｏｒｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ．ｏｐｔｉｍａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ（“）Ｗａｓ０．２ ｈ－１ ｆｏｒ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｆｅｅｄｉｎｇ，ａｎｄｏｐｔｉｍａｌｇｌｕｃｏｓｅｒａｔｅＷａｓ ５．５９／Ｌ／ｈ ｆｏｒｃｏｎｓｔａｎｔｆｅｅｄｉｎｇ．Ｂｙ ａｐｐｌｙｉｎｇ ｔｈｒｅｅ―ｓｔａｇｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｆｅｅｄｉｎｇｍｏｄｅ（９ｈ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｔａｇｅ，１ ２ ｈａｎｄ ２４ｈｃｏｎｓｔａｎｔｆｅｅｄｉｎｇ），ａｆｔｅｒ ４５ｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｅｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｓ １ ０２ ｇ／ＬａｎｄＧＳＨ ｙｉｅｌｄ ｉｓ ９８ ｌ ｍｇ／Ｌ．（２）Ｈｉ曲ｃｅｌｌｄｅｎｓｉｔｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｓ ｐｒｅｆｅｒａｂｌｅ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｂｕｔｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＧＳＨ ｃｏｎｔｅｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｅｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｓｉｎｇｌｅ．ｓｈｏｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｗａｓ ｕｔｉｌｉｚｅｄ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｔ ４５ ｈ ａｓ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｏｐｐｅｄ．Ｒｅｓｕｉｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ａｓ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｓ ５０ＩｎｍｏⅥ。．ＧＳＨ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｓ ｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｏｆ １ ５３４ｍｅＣＬａｎｄ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＧＳＨ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｓ １．５０％（ｗ／ｗ）ａｆｔｅｒ ６０ ｈ ｃｕｌｆｉｖａｔｉｏｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ．ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＧＳＨｓｈｏｔｓ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｆｕｒｔｈｅｒｃｏｎｔｅｎｔ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ．Ｓ胃Ｉ．ＡｅａｃｈｓｔｒａｔｅｇＹｔｈａｔ ｃｏｍｂｉｎｅｓ ｔｗｏａｄｄｉｔｉｏｎ（２５ ｍｌｎ０１／Ｌ ｆｏｒｔｉｍｅ）ｗｉｔｈｌＯＷ．ｐＨ ｓｔｒｅｓｓ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｏｅｎｈａｎｃｅＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ａｎｄ ｔｈｅ ｆｍａｌ ＧＳＨ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｓ １ ８２５ ｍｇ／Ｌ．（３）Ｂａｓｅｄｏｎｃｙｓｔｅｉｎｅ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）ａｄｄｉｔｉｏｎｏｎｉｎ ａｂｏｖｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｉｔ Ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｆｏｒ ＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｗａｓ ｖｅｒｙ ｌｏｗ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎ（ＤＯ）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＧＳＨｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｙｓｔｅｉｎｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｗｅｒｅⅡＩＡｂｓｔｒａｅｔｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ．Ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ｌｏｗｅｒ Ｄ０ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆａｖｏｒｓ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｂｕｔ ｒｅｔａｒｄｓ ＧＳＨｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＨｉｐｅｒａｔＤＯｐｒｏｍｏｔｅｓ ＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｕｔｆａｖｏｒｓ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒｏｔｈ．Ａ ｔｗｏ．ｓｔｅｐ ＤＯ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｆｔｅｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ．ｉｎ ｗｈｉｃｈ ＤＯ ｗａｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ５％ｉｎ ｔｈｅ ｆｌｒＳｔ ３ ｈ ａｎｄ ｔｈｅｎａｔ２０％ｉｎ ｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇ １ ２ ｈ，Ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ａｓａｒｅｓｕｌｔ．ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｉＳ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ５０ｍｍｏⅥ。ｔｏ ３０ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｗｈｉｌｅ ＧＳＨ ｙｉｅｌｄ ｒｅａｃｈｅｓ １ ７３４ ｍｇ／１ ａｆｔｅｒ ６０ ｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｓｏ，ｂｙ ｕｓｉｎｇｔｗｏ．ｓｔｅｐＤＯ ｃｏｎｔｒ０１ ｓｔｒａｔｅｇｙ，ａ ４０％ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｄｄｉｔｉｏｎａｎｄａ１ ３％ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｂａｔｃｈ ＧＳＨｗｉｔｈｔｈａｔｗｉｔｈｏｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌｏｆ ＤＯ（４）Ｗｈｏｌｅｇｒｏｗｔｈｏｎ ａｌｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＷａｓ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏｔｗｏｐｈａｓｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌａｎｄＧＳＨ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａｔ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ，ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓｅｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈａｎｄＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ．Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｓｈｏｗｓｏｎｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｆｅｃｔｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈａｎｄ ｅｎｈａｎｃｉｎｇＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ；Ａｌｓｏ，ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ＧＳＨ ｃｏｎｔｅｎｔ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ ｂｕｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｅｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｎｏｔａｂｌｙ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄａｎｄｃｙｓｔｅｉｎｅ，ｇｌｙｃｉｎｅｃａｎｐｒｏｍｏｔｅ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓｅｎｈａｎｃｅ０．１％ａｎｄｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＧＳＨｃｏｎｔｅｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ａｔ ２ ｈｗｉｔｈ ６ ｍｌＴＩＯＩ／Ｌ ｇｌｙｃｉｎｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ＤＣＷａｎｄ ＧＳＨｙｉｅｌｄ ｒｅａｃｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｖａｌｕｅ ｏｆ １ ０．４ １ ｇ／Ｌ ａｎｄ １ ２５ｍｅｇＬ，ｗｈｉｃｈ ａｒｅ１３４．１％ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒ０１．（５）Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ａ ｍｉｘｔｕｒｅ （ｇｌｕｔａｍｉｃｏｆ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，ｇｌｙｃｉｎｅａｎｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅＷａＳａｄｄｅｄａｔ １ ２ ｈ ａｔｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｃｉｄ ６ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｇｌｙｃｉｎｅ ５．５ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｃｙｓｔｅｉｎｅ ６．５ｍｍｏｌ／Ｌ）ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ＧＳＨ ｙｉｅｌｄｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ）．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｗｏ?ｓｔｅｐ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ，ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ １ ０．４ １ ｅｅｌ ａｎｄ ２７７．９ ｍｇ／Ｌ ｉｎ ｆｌａｓｋ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ３０ ｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ １０．１％ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ ｂａｔｃｈ１２９．８％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，雏ｃｏｍｐａｒｅｄ澌ｔ１１ｔｈｅｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｄｄｉｔｉｏｎ．Ｂｙａｐｐｌｙｉｎｇ ｔｈｉｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎ ７ Ｌｆｅｒｍｅｎｔｏｒ，ＧＳＨｙｉｅｌｄ ｒｅａｃｈｅｓ ３２８．１ ｍｇ／Ｌ ｍｇ／Ｌ，ｗｈｉｃｈ ｉＳｔｈｉｓ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ＨＣＤ１ １ ８．７％ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒ０１．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｆｕｒｔｈｅｒ ａｐｐｌｙｉｎｇｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ａｆｔｅｒ ６０ ｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ａ ＧＳＨ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １ ９５２ ｍｅｇＬ ｉｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ａｎｄｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＧＳＨ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｓ １．８ １％（６）Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｗｏ．ｓｔｅｐａｍｉｎｏａｃｉｄｓ ｔｈｒｅｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＴＰａｎｄａｄｄｉｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ａｂｏｖｅ， ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｇ．娜Ｉ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ４５ ｈ ｔｏ ６０ ｈ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｃｅｓｓａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＳＨｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｔ ６０ ｈ ｗａｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＡＴＰ ｓｈｏｒｔａｇｅ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ Ｇ．Ｓ日Ｉ．Ｈｏｗｅｖｅｒ．ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｄｅｃｒｅａｓｅｉｎ伽Ｉａａｃｔｉｖｉｔｙ，ＡＴＰ ｓｈｏｒｔａｇｅ ａｃｃｏｕｎｔＳ ｆｏｒａｌｉｏｎ ｓｈａｒｅｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｓｏｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇａｄｄｉｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓ ａｄｄｉｔｉｏｎ、ⅣｉｔＩｌ ＡＴＰ Ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｏ ｆＲｒｔｈｅｒ ｅｎｈａｎｃｅ ＧＳＨ ｙｉｅｌｄ ａｓ ｉｔｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｏｐｐｅｄ ａｔ ６０ ｈ．ＩＶＡｂｓｔｒａｃｔＷｉｔｌｌ３ ｇ／Ｌ ＡＴＰ ａｄｄｉｔｉｏｎ ａｔ ６０ ｈ，ａｆｔｅｒ ７２ ｈ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ＧＳＨ ｙｉｅｌｄ ｒｅａｃｈｅｓ ２ １ ４ １ ｍｇ／ｎａｎｄ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＧＳＨ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉＳ１．９８％（ｗ／ｗ）．Ｂｙｆｕｒｔｈｅｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｔｈｅｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｉｏｎｉｃ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｅｅｌｌ ｏｓｍｏｓｉｓ ｆｏｒ ＡＴＰ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，ａ ＧＳＨ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ２ １ ５３ｍｇ／Ｌ ｉｓａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙａｄｄｉｎｇ２ｇ／ＵＡＴＰ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｂｙ ｆｅｅｄｉｎｇｓｕｉｔａｂｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅａｎｄ州Ｈ４）Ｓ０４ｆｏｒ ＡＴＰ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ＧＳＨ，ＧＳＨａＳｙｉｅｌｄ ｒｅａｃｈｅｓ ２ １ ６３ ｍｇ／Ｌ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｂｏｖｅ ｓｔｒａｔｅｇｙｂｅｉｎｇ ｆｅａｓｉｂｌｅ．（７）Ｅｆｆｅｃｔｏｆ Ｈ２０２一ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓｃａｌｌ ａｏｎＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＷａＳ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｈ２０２ ｇｒｏｗｔｈ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ．Ｓｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ＧＳＨ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ｃｅｌｌｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｈ２０２ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（１ ｍｍｏｌ／Ｌ ａｔ ６ｈ，２ ｍｒｎｏｌ／Ｌ ａｔ ８ｈ，ａｎｄ ４ ｍｍｏｌ／Ｌ ａｔ １ ０ ｈ）ｗｅｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｏｍａｘｉｍｉｚｅ ＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｓａａｒｅｓｕｌｔ，ａ ｍａｘｉｍａｌ ＧＳＨ ｙｉｅｌｄ ｏｆ １ ８８ ｍｇ／Ｌ ＷａＳａｃｈｉｅｖｅｄ ａｎｄｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＧＳＨ ｃｏｎｔｅｎｔ ＷａＳ ２．０５％．Ｂｙ ａｐｐｌｙｉｎｇ ｔｈｉｓｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ７ Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ，ＧＳＨ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＧＳＨ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗｅｒｅ ２５ ８ ｍｇ／Ｌａｎｄ２．５３％．Ｆｕｒｔｈｅｒ ａｐｐｌｙｉｎｇ ａｂｏｖｅ ｓｔｒａｔｅｇｙｔｏ ＨＣＤ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ａｆｔｅｒ ６０ ｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ａＧＳＨ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １ ４８２ ｍｇ／Ｌ ｉｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＧＳＨｃｏｎｔｅｎｔ ｉｓ１．５２％．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄＧＳＨａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆｃａｔａｌａｓｅ（ＣＡＴ）ａｎｄＧＳＨ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＲ）ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔａｎｄＣＡＴ ｗｅｒｅ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｇａｉｎｓｔｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｂｙ Ｈ２０２．（８）Ａｌｓｏ，ｉｍｐａｃｔｔ１１ａｔ Ｎａ２Ｓ０４ｃａｒｌｏｆ Ｎａ２Ｓ０４ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ＧＳＨｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＷａＳ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄｅｎｈａｎｃｅ ＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ ｂｕｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ｅｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｔ ｔｈｅ ｋｅｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ ＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅｓａｍｅｔｉｍｅ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ Ｎａ：Ｓ０４ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆ伽Ｉｓｔｒｅｓｓ ｃａｎｌｅａｄｔｏ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｒｅａｓｏｎｉｎｃｒｅａＳｅ ｉｎａｎｄＧ＆ｅｘｐｌａｉｎｉｎｇ ｔｈｅｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆ ＧＳＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｎａ２Ｓ０４ ｓｔｒｅｓｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ＧＳＨ），ＣａｎｄｉｄａＨｉｇｈ ｃｅｌｌｕｔｉｌｂａ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅＰｒｏｃｅｓｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ｄｅｎｓｉｔｙ（ＨＣＤ）ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｍｉｎｏｓｔｒｅｓｓａｃｉｄｓ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ＡＴＰ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＶ附录英文缩写与中文名称对照１０ｌ独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 ’及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本 人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料．与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意． 签名：黜日期：关于论文使用授权的说明２翌塑：２：！仝本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致． 保密的学位论文在解密后也遵守此规定． 签名：黎鲴逸日丝塑：２：￡２期：导师签名：立壶型全坐巡：Ｚ！乞第一章绪论第一章绪论１．１概述１．１．１谷胱甘肽的性质及分布 谷胱甘肽，即丫．Ｌ．谷氨酰．Ｌ．半胱氨酰甘氨酸（丫．Ｌ．ｇｌｕｔａｍｙｌ．Ｌ．ｃｙｓｔｅｉｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ，ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ），是由Ｌ．谷氨酸、Ｌ．半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具 有丫．谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。作为生物体内的非蛋白巯基化合物， 谷胱甘肽主要有还原型（ＧＳＨ）和氧化型（ＧＳＳＧ）两种形态，在机体中大量存在并起主 要作用的是还原型谷胱甘肽。ＧＳＳＧ可以由谷胱甘肽还原酶（ＧＲ）还原成ＧＳＨ， 该酶为黄素蛋白，它能利用ＮＡＤＰＨ作为电子供体【ｌ】。由于ＧＳＨ还原酶的存在， 使得ＧＳＨ主要以还原形态存在，因此，正常情况下细胞中ＧＳＨ与ＧＳＳＧ的比例约为１００：１１２ｌ。酵母细胞中氧化型和还原型谷胱甘肽之间的相互转化过程可用图１．１来表示【３１。ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓｃｅｌｌｕｌａｒ明日秒图１－１酵母细胞中谷胱甘肽的形态转化过程Ｆｉｇ．１－１ Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｏｆ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ除ＧＳＳＧ以外，ＧＳＨ还能以其它二硫键，例如ＧＳ．Ｓ．ＣｏＡ，ＧＳ．Ｓ．Ｃｙｓ和ＧＳ．Ｓ． 蛋白等形式存在【４】。 ＧＳＨ作为细胞中最丰富的小分子硫醇类化合物，其结构特点是分子中含有一个特殊的丫．肽键：由Ｌ．谷氨酸的丫．ＣＯＯＨ与Ｌ．半胱氨酸的ａ．ＮＨ２缩合而成，它不同 于蛋白质分子中的普通肽键【５】。ＧＳＨ的分子量为３０７．３３，熔点１８９０Ｃ～１９３０Ｃ（分解），等电点为５．９３，比旋光度为【仪】Ｄ２５－－１９０（Ｃ＝４．６５ ｇ／Ｌ，Ｈ２０），晶体呈无色透明细长柱状。它易溶于水、稀醇、液氨和Ｎ，Ｎ．二甲基甲酰胺，但微溶于醇、醚和丙酮等有机溶剂。ＧＳＨ固体较为稳定，但其水溶液在空气中极易被氧化成ＧＳＳＧ。ＧＳＳＧ是由两分子ＧＳＨ经氧化脱氢而形成的以二硫键连接的二聚体，一般以水合物的形式存在，熔点１７８０Ｃ～１８２０Ｃ，比旋光度为［仅】Ｄ２０＝１０８。（Ｃ＝２．０ ｇ／Ｌ，Ｈ２０），分子量为 ６１２．６３，是一种溶于水的白色晶体【６１。ＧＳＨ在水溶液中的构象存在分子内氢键，而江南大学博士学位论文ＧＳＳＧ无此现象发生１７Ｊ。谷胱甘肽在自然界中广泛分布于动物、植物和微生物体内，其中以酵母、小麦胚芽以及人和动物肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体中含量较为丰富，许多植物如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类等也含有一定量ＧＳＨ悼Ｊ。动物细胞中ＧＳＨ主要 起着巯基缓冲剂的作用，人体血液中ＧＳＨ的正常浓度为３７．１ ｍｅＣＬ，肝脏、肾脏是ＧＳＨ主要的合成、代谢和排泄器官【９１。另外，ＧＳＨ还可以在红细胞中合成且都以 还原形态存在【１０ｄ¨。１．１．２谷胱甘肽的功能及应用前景 ＧＳＨ在生物体内有着多种重要的生理功能，大致可概括为三个方面，如抗氧 化、免疫调节和解毒【１２】。第一，ＧＳＨ对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着 至关重要的作用【１３Ｉ。ＧＳＨ作为一种重要的抗氧化剂，可清除体内自由基，保护 ＤＮＡ、蛋白质和其它生物分子抵抗氧化破坏，防止机体衰老等。第二，临床实验 结果表明，ＧＳＨ可以迅速增强机体的免疫力，人体内ＧＳＨ增加后对消化系统、呼吸系统和新陈代谢等都有很大帮助。第三，ＧＳＨ还被用于与其它物质组合构成治疗或保健药物，如以高剂量与治疗肿瘤的药物配合使用，可以防止这些药物对肝脏和肾脏的毒性：与维生素Ｇ一起服用，可防止空气污染和紫外照射诱发肿瘤等［１４－１５】。近年来还发现ＧＳＨ具有抑制艾滋病病毒的功效【１６】。随着人们对ＧＳＨ研究的不断深入，ＧＳＨ在医药及临床领域内还会有更多的用途。 ＧＳＨ具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子。日本等国家在２０ 世纪五十年代就开始将ＧＳＨ作为生物活性添加剂并积极开发应用在保健食品的生产中【１７１，而我国对ＧＳＨ的研究起步相对较晚，在食品方面的应用还处于起始阶段。 作为一种抗氧化剂，ＧＳＨ具有昂贵的市场价格，目前还没有能在食品加工领域中得到广泛应用。但是，由于ＧＳＨ在强化食品风味的同时对人体有保健作用，它的应用前景显然要优于其它类型的防腐剂或抗氧化剂【ｌ引。因此，在价格下降的前提下，采用ＧＳＨ作为食品抗氧化剂是食品加工业的发展趋势之一。根据相关文献报道，ＧＳＨ作为一种多功能生物活性添加剂在食品加工业中的应用将会愈来愈广， ＧＳＨ的需求量正日益增大。显然，ＧＳＨ在２１世纪将有一个极其巨大的需求市场。１．２生物法合成谷胱甘肽研究动态１．２．１谷胱甘肽生产的历史概况早在１８８８年，法国科学家ｄｅ Ｒｅｙ．Ｐａｈｌａｄｅ就在面包酵母的乙醇萃取物中首先 发现了谷胱甘肽，将其命名为ｐｈｉｌｏｔｈｉｏｎ；１９２１年，英国生化学家Ｈｏｐｋｉｎｓ从酵母 抽提物中分离得到了谷胱甘肽并正式命名为ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｌｌ９】；其后，经过化学分析、２第一章绪论酸碱滴定、降解与合成等方面研究工作，谷胱甘肽的化学分子结构才最终被确定。 自Ｈａｒｉｎｇｔｏｎ和Ｍｅａｄ［２０１首先化学合成得到ＧＳＨ以来，国内外学者围绕ＧＳＨ的生产开展了大量的研究，概括来说，目前ＧＳＨ的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、酶转化法和发酵法。萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从含有ＧＳＨ 的动植物组织中进行ＧＳＨ的分离提取，由于原料不易获得且ＧＳＨ在组织中的含量极低，制取的ＧＳＨ纯度和收率不高，因此该法的实际应用价值不大。化学合成法生产ＧＳＨ，是将Ｌ．Ｇｌｕ、Ｌ．Ｃｙｓ和Ｇｌｙ经过一系列化学反应缩合成ＧＳＨ，化学 合成得到的ＧＳＨ消旋体（左旋体和右旋体的混合物）需要进行光学拆分，分离十分 困难且易造成环境污染【２¨，因此，获得的ＧＳＨ产品纯度不高，生物效价很难保持 一致。Ｂｌｏｃｈ［２２】最早研究了肝脏中ＧＳＨ的生物合成途径，并证实了细胞内ＧＳＨ是由Ｌ．Ｇｌｕ、Ｌ．Ｃｙｓ和Ｇｌｙ在ＡＴＰ的存在下，经过Ｙ．谷氨酰半胱氨酸合成酶（ＧＳＨ Ｉ）和谷胱甘肽合成酶（ＧＳＨＩＩ）催化而合成的，每合成１ ｍｏｌ的ＧＳＨ需要消耗２ ｍｏｌ的ＡＴＰ。ＧＳＨ在细胞内的生物合成途径具体如下：Ｌ４３１ｕ＋Ｌ４２ｙａ＋ＡＴＰ型！－丫．Ｌ－ＧＩ¨ｃｙＳ＋ＡＤＰ＋Ｐｉ１，．Ｌ－Ｇｌｕ．Ｌ．ｃｙｓ＋Ｇｌｙ＋Ａ＇Ｉ＇Ｐ里竺坚－ＧＳＨ＋ＡＤＰ＋Ｐｉ生物法合成ＧＳＨ主要有两种途径：酶转化法和发酵法。二者的共同特点是首先要有性能良好的微生物，然后再利用细胞中的高活性酶系在较为温和的条件下实现ＧＳＨ的合成；二者最主要的区别在于酶法需要提供三种底物氨基酸和ＡＴＰ，而发酵法只要供给微生物生长代谢所需的营养物质（碳源、氮源和无机盐等）即可实现ＧＳＨ在胞内的积累。自２０世纪６０年代起，采用生物法进行ＧＳＨ的合成就日益 引起广泛的关注。日本学者早在７０年代就开始对生物法合成ＧＳＨ进行了大量研究， 申请并公布了一系列相关专利［２３】。一些大公司（如协和发酵）利用酵母发酵生产的 ＧＳＨ更是早在１９８５年就取得了中国卫生部的原料药进口许可文号，基本垄断了中 国市场。我国对ＧＳＨ的研究尚处于起步阶段，虽然从８０年代末期至今，曾开展过 从酵母中提取ＧＳＨ的研究，但由于生产菌株中ＧＳＨ含量较低，成本过高，且对下游分享纯化相关技术未取提实质性安突破，故一直未能实现工业化生产。表１．１简 要综述近年来酶法和发酵法在ＧＳＨ生物合成方面的研究进展情况。江南大学博士学位论文表卜１生物法合成ＧＳＨ的发展历史Ｔａｂ．１－１ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＳＨＧＳＨ生产研究 用于发酵法或酶法生产ＧＳＨ的酵母培养 生物系统中ＧＳＨ的纯化 用于酶法合成ＧＳＨ的细菌选择 ＡＴＰ再生系统的构建 构建重组大肠杆菌生物合成ＧＳＨ 构建重组酵母生物合成ＧＳＨ ＧＳＨ合成过程的优化与控制 乳酸乳球菌生物合成ＧＳＨ时期 １９７６＂－－１９８５，１９９８～至今１９７６－－１９８７，１９９３～１９９８ １９７８～１９９１ １９７８―１９８２ １９８２～１９９０１９８６－－１９９０，１９９乒１９９８１９９１～１９９４，１９９７－至今 ２００１一至今１．２．２酶法合成谷胱甘肽ＧＳＨ的酶法合成就是利用微生物细胞中的ＧＳＨ合成酶系（ＧＳＨ Ｉ和ＧＳＨＩＩ）催 化三种氨基酸形成ＧＳＨ的方法。由此可知，酶法合成ＧＳＨ的关键因素主要包括：ＧＳＨ Ｉ和ＧＳＨＩＩ、前体氨基酸（Ｌ．谷氨酸、Ｌ．半胱氨酸和甘氨酸）、ＡＴＰ、必须的辅因子（Ｍ９２＋）以维持ＧＳＨ Ｉ和ＧＳＨＩＩ的酶活性。由此可见，要实现酶法ＧＳＨ的高效合成，ＧＳＨ合成酶系的高活性和ＡＴＰ的有效供给是两个必须满足的条件。前者可通过克隆基因ｇｓｈ，和ｇｓｈ／／并使其在宿 主菌中高效表达而实现。然而，由于ＡＴＰ的价格相当昂贵，在酶法合成ＧＳＨ过程 中直接将ＡＴＰ作为原料加入反应体系中势必将大大增加运行成本，因此构建一个有效的ＡＴＰ再生系统以满足ＡＴＰ的有效供给尤为重要。ＡＴＰ再生系统可定义为一 个需要ＡＴＰ的生物酶反应系统与一个ＡＴＰ生物合成系统所构成的耦合系统。一般 地，ＡＴＰ在降解为ＡＤＰ（或ＡＭＰ）的同时，释放贮存在ＡＴＰ分子中的能量用于生物 合成反应。若能建立一个适宜的反应系统，在这个系统中，由ＡＴＰ降解而来的 ＡＤＰ（或ＡＭＰ）可通过其它途径再合成ＡＴＰ，使ＡＴＰ能够循环使用，这样就有可能 采用能够再生ＡＴＰ的廉价底物来替代ＡＴＰ，从而提高有用物质生产过程的经济性。１．２．２．１构建ＡＴＰ再生系统用于ＧＳＨ的生物合成 Ｍｕｒａｔａ等人自１９７８年起就开始对ＧＳＨ合成过程中ＡＴＰ的供给问题进行了深入的研究，并发表了大量研究论文。Ｍｕｒａｔａ掣２４】成功地将编码ＧＳＨ Ｉ和ＧＳＨＩＩ的基因ｇｓｈ Ｉ和ｇｓｈＩＩ自克隆入Ｅ．ｃｏｌｉ细胞中，构建了一株具有高ＧＳＨ合成活性的生产菌株。利用菌株自身拥有的用于ＧＳＨ合成的自耦合ＡＴＰ再生系统，反应液中ＧＳＨ的产量比原始菌株高１０倍。Ｓｈｉｍｏｓａｋｅ将携带编码酵解关键酶＿磷酸果糖激酶（ＰＦＫ）和磷酸丙糖异构酶（ＴＰＩ）的基Ｉ园ｐｊ＂ｋＡ和矽ｆ的杂合质粒转化至－ＵＥ．ｃｏｌｉ 中，细胞合成ＡＴＰ的活性明显提高，但如果再转化携带ｇｓｈ Ｉ和ｇｓｈ ＩＩ的重组质４第一章绪论粒，菌株就很不稳定【２５１。但到目前为止，关于自耦合ＡＴＰ再生系统用于ＧＳＨ合 成一直鲜有报道，主要是因为在同一种微生物中同时提高ＧＳＨ合成酶系和ＡＴＰ 合成酶系的活性是非常困难的。 Ｅ．ｃｏｌｉ细胞中的乙酸激酶反应【２６Ｊ或＆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ细胞中的糖酵解途径都可以作 为ＡＴＰ的再生系统【２ ７Ｊ而用于ＧＳＨ的合成。只是前者所需底物乙酰磷酸不稳定且成本过高，而后者虽然ＡＴＰ再生能力很强，但ＧＳＨ合成酶的活性不高。Ｍｕｒａｔａ等【２８】采用在固定化＆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ和Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ细胞间构建一个种间耦合ＡＴＰ再生系统来合 成ＧＳＨ。这一系统可以有两种形式，即共固定化系统假ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ和Ｅ ｃｏｌｉ细胞一起固定化在同一聚丙烯酰胺凝胶中）和混合固定化系统假ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ和Ｅ ｃｏｌｉ分 别用聚丙烯酰胺凝胶固定化后再混合使用）。由于菌株未经遗传改造，实际研究结果不是很理想，但Ｍｕｒａｔａ还是认为固定在聚丙烯酰胺凝胶中的＆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ细胞的糖酵解途径对ＧＳＨ生物合成来说是最简单且最有希望的ＡＴＰ再生系统。国内在构建ＡＴＰ再生系统并将其用于生物合成ＧＳＨ方面也有相关报道。沈立新等【２９】利用重组大肠杆菌ＢＬ２ｌ（ｐＴｒｃ帮办）与酵母耦联合成谷胱甘肽，在适宜反应条件下，ＧＳＨ浓度最高可达２．１３ ｅ，／Ｌ。李寅等１３０Ｊ利用重组Ｅ．ｃｏｌｉ ＩＩ．１细胞中的ＧＳＨ合成 酶系和Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＳＨ．．Ｊ７０２中的ＡＴＰ生物合成酶系，构建了一个以葡萄糖为能源 的种间耦合ＡＴＰ再生系统。在对出发菌株细胞进行通透性处理后，不采用固定化操 作而是将两种菌体直接混合，耦合系统需要补加镁离子，反应进行６ ｈＩ对ＧＳＨ浓度 即可达到４．４ ｇ／Ｌ。可见，合理的耦合系统的建立，完全可以实现ＧＳＨ的高产量合成。１．２．２．２基因工程以及代谢工程在ＧＳＨ生产中的应用在ＧＳＨ的生物合成中，ＧＳＨ合成酶系的活性普遍较低，ＧＳＨ Ｉ和ＧＳＨｌｌ分别 受到ＧＳＨ和ＧＳＳＧ的反馈抑制ｐ１１，并且ＧＳＨ Ｉ是一个限速酶。Ｍｕｒａｔａ等最早克 隆得到了编码Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ中ＧＳＨ Ｉ的ｇｓｈ Ｉ基因【３２１，并且确定了它的核苷酸序列【３３１。 在随后的研究中，编码Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ中ＧＳＨＩＩ的ｇｓｈ ＩＩ基因也被克隆【３４】和定序【３５１。特 别是，Ｍｕｒａｔａ和Ｋｉｍｕｒａ还从Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ中筛选得到一株ＧＳＨ Ｉ脱敏突变株，克隆了 其ｇｓｈ Ｉ木基因并在Ｅ．ｃｏｌｉＢＲＣ９１２中得以表达，获得的菌株合成ＧＳＨ的能力大大提高ｐ６１。ＧＳＨ Ｉ的活性提高以后，ＧＳＨＩＩ就成了ＧＳＨ生物合成的限速酶。Ｇｕｓｈｉｍａ等ｐ ７‘３８】构建了含ｇｓｈ Ｉ?或ｇｓｈ ＩＩ的重组质粒并转化入Ｅｊ ｃｏｌｉ细胞，结果表明只有同 时带有ｇｓｈ Ｉ?和ｇｓｈＩＩ基因的重组质粒ｐＧＳ５００转化的重组细胞才表现出最高的ＧＳＨ合成活性。沈立新等【３０】也成功构建了同时表达ＧＳＨ合成酶系中两个酶的质粒 ｐＴｒｃ－ｇｓｈ，并在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１中得到表达，具有较高的ＧＳＨ合成活性。由于酵母在实际生产中的培养条件比较容易控制，因此可以将ｇｓｈ Ｉ和（或）ｇｓｈ ＩＩ基因转化进入酵母细胞内以获得高产ＧＳＨ的重组菌株。Ｏｈｔａｋｅ等口９】曾尝 试在酵母中表达Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ的ｇｓｈ Ｉ基因，将ｇｓｈ Ｉ基因的全部编码片段与＆江南大学博士学位论文ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ９８的一个启动子融合，结果转化体的ＧＳＨ Ｉ活性和ＧＳＨ的胞内含量分别提高了１００多倍和３倍多。Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ和Ｕｌｆ（４０】将含有Ｅ．ｃｏｌｉ中ｇｓｈ Ｉ和ｇｓｈＩＩ基 因的质粒ｐｌＮＥＩＩＩ转化到Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中，明显提高了酵母合成ＧＳＨ的能力，ＧＳＨ 在胞内的积累量达到１．８％。然而，这些菌株还无法达到工业化生产的要求，目前只能停留在实验室研究阶段。础Ｉ和ｇｓｈ ＩＩ的过量表达并没有导致大肠杆菌或面包酵母中的ＧＳＨ含量大幅上升。原因可能是：（１）ＧＳＨ对ＧＳＨ Ｉ的反馈抑制，或（２）丫．谷氨酰转肽酶（丫．ＧＴＰ） 的存在对胞内合成的ＧＳＨ的降解作用。近来，在一个乳酸链球菌肽诱导控制的表 达系统中克隆了Ｅ ｃｏｌｉ的ｇｓｈ Ｉ和ｇｓｈ ＩＩ基因，并将此重组质粒转化乳酸乳球菌 ＮＺ９０００中，结果显示在添加５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ．ｃｙｓ的条件下，乳酸乳球菌ＮＺ９０００中胞内ＧＳＨ浓度达到３５８ ｎｍｍｏｌ／ｍｇ蛋白，这是至今在细菌中获得的最高胞内ＧＳＨ含 量【４¨。乳酸乳球菌不能合成ＧＳＨ，也不存在７－ＧＴＰ活性。另外，ＧＳＨ对ＧＳＨ Ｉ的反馈抑制好像也没有在乳酸乳球菌中发生ｆ显然３５８ ｎｍｍｏｌ／ｍｇ蛋白胞内ＧＳＨ浓度超过通常反馈抑制所需浓度），真正的原因还是个谜。为了减轻ＧＳＨ对ＧＳＨＩ的反馈抑制，廖鲜艳等【４２Ｊ在Ｅ ｃｏｉｌ中表达了同时包含两拷贝ｇｓｈ Ｉ基因和单拷贝ｇｓｈ ＩＩ基因的温度诱导型重组质粒ｐＢＶ０３，使重组大肠杆菌生物合成ＧＳＨ高达１４．５０ ｍｍｏｌ／Ｌ。至今，ＧＳＨ的酶法生产由于较高的生产费用而一直未被商业化，对于发酵法 生产ＧＳＨ来说，由于其低廉的成本，研究也日益受到重视。 １．２．３发酵法生产谷胱甘肽 发酵法就是以廉价的糖类等原料为营养物质，利用微生物体内物质和能量代谢途径来进行ＧＳＨ生物合成的方法。一般情况下微生物细胞中ＧＳＨ的含量不高（仅为干重的Ｏ．５‰１．Ｏ％），过高含量的ＧＳＨ容易破坏体内业已平衡的氧化还原环境【４３】。由于ＧＳＨ是一种胞内产物，生产过程中需要对ＧＳＨ进行提取纯化，较 低的胞内含量无疑会增加生产成本。因此，发酵法生产ＧＳＨ的关键问题在于如何 提高细胞密度以及细胞内的ＧＳＨ含量，二者的有机结合将有利于ＧＳＨ产量最大 化。细胞密度的提高可通过对发酵过程的优化控制（如高密度培养）获得，然而 随着细胞密度的提高，胞内ＧＳＨ含量无疑会进一步降低，因而如何提高胞内ＧＳＨ 含量是细胞高密度培养生产ＧＳＨ的关键所在。对于胞内ＧＳＨ含量提高，一方面 可通过传统育种来选育高胞内ＧＳＨ含量的菌种，另一方面是利用遗传工程技术构建具有高ＧＳＨ合成酶活性的基因工程菌。 然而在利用基因工程菌生产ＧＳＨ过程中，菌株所带质粒的稳定性问题，以及质粒的稳定性受到宿主细胞遗传特性、质粒拷贝数以及质粒上基因的表达等多种６第～章绪论因素的影响，因而这些菌株还无法达到工业化生产的要求，目前只能停留在实验 室研究阶段。 而通过传统育种来选育高胞内ＧＳＨ含量的菌种则克服了基因工程菌上述的弊 端，加之发酵法所使用的细菌或酵母容易培养，以及生产方法及工艺的不断改进和完善，因此采用通过常规育种选育富含ＧＳＨ微生物进行发酵生产ＧＳＨ已成为 目前ＧＳＨ工业化生产的最普遍方法。微生物细胞中ＧＳＨ的合成和分解代谢途径可用图１．２来概况。图Ｉ－２酿酒酵母细胞中ＧＳＨ的代谢途径Ｆｉｇ．１―２ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ１．２．３．１高产菌株的选育虽然有些菌株如Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｙｓｔｉｎＤｖｏｌｅｎｓ［４３１、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓｔ４４．４５】等本身 有较高的ＧＳＨ含量且可以长时间保持合成ＧＳＨ的能力，但是它们并非工业化常用菌种，研究成果也只局限于摇瓶条件下的结果。普通的野生型酵母细胞中ＧＳＨ 的含量并不高，只有采用物理的或化学的方法使出发菌株发生变异，再在特定的 培养基中进行筛选培养，使ＧＳＨ在这种变异菌株的细胞内大量积累，以此实现 ＧＳＨ的高产。到目前为止，针对ＧＳＨ生产的酵母菌株而进行的物理或化学的处理 方法大致有紫外线、Ｘ射线、丫射线以及亚硝基胍等，而培养基中的特定筛选物质 （筛子）主要包括蛋氨酸、Ｌ．乙硫氨酸、ＤＬ．乙硫氨酸、１，２，４．三唑、氰化钠、亚硫 酸盐、酰胺和靛酚等。通过一系列对菌株的改良及选育工作，获得了很多ＧＳＨ高７江南大学博士学位论文产菌株。下面的例子可以证明菌种选育研究工作的重要性：（１）经亚硝基胍诱变，筛选获得乙硫氨酸敏感型突变株Ｃｕｔｉｌｉｓｎ７４．８，经培养后其细胞内ＧＳＨ含量达到３．０％，比出发菌株０．６６５％提高了３．５倍【蛔：（２）经紫外线、Ｘ射线和亚硝基胍诱变，筛选获得耐亚硫酸盐和乙硫氨酸突变株ＣｕｔｉｌｉｓＥＲ３０４，细胞内的ＧＳＨ含量从ｏ．５２％增加到４．ｏ％，增加了６．７倒４７】；（３）经亚硝基胍诱变，筛选获得耐１，２，４．三唑和氰化钠的突变株－Ｓ：ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＺ．６，胞内ＧＳＨ含量达到２．５％，比出发菌株 提高了４倍［４引。大多数情况下，高产菌株的获得主要是去除或降低了ＧＳＨ对ＧＳＨ Ｉ 的反馈抑制。１．２．３．２发酵过程优化与控制在实际的发酵生产中，性能优良的菌种仅仅是一个开始，还需要对发酵过程进行优化控制，最大限度地发挥微生物生产目标产物的潜力【４引。由于ＧＳＨ是胞内产物，所以在提高生产菌株胞内合成ＧＳＨ能力的同时，还需要在发酵过程中设法提高细胞浓度，以提高ＧＳＨ的总产量。而ＧＳＨ总产量的提高必须考虑底物转化率和生产强度，因此对ＧＳＨ发酵过程进行优化控制就显得尤为重要。关于这方面的研究大都是从２０世纪九十年代以后开始的，主要包括营养与环境条件优化、发酵过程控制、前体物质的添加、能量（ＡＴＰ）供应以及ＧＳＨ合成关键酶活性控制 等。 （１）营养与环境条件优化 生产ＧＳＨ所用的酵母大都是工业常用菌株，能在相对较广的的培养条件下生长并积累ＧＳＨ，但产量往往很低。因此，要想进一步提高ＧＳＨ的合成能力，必须对培养基中的各种营养成分以及培养条件进行优化，在最佳的工艺条件下进行发 酵，为最终的ＧＳＨ工业化生产奠定基础。运用一些实验设计（如正交试验设计、 因次分析设计、中心复合试验设计等）及数据处理方法（响应面分析、神经网络 模型等）可以减少工作量并且使实验结果具有更高的可信度和实际应用价值。对 于ＧＳＨ的发酵生产来说，营养物质的选择优化对细胞生长和单位细胞ＧＳＨ合成 能力都有重要影响。在考察了培养基中的主要成分（葡萄糖、蛋白胨、ＫＨ２Ｐ０４、生 物素和半胱氨酸）浓度的变化对酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ．８Ｈ细胞生长和胞内ＧＳＨ合成影 ’响的基础上，采用中心复合试验设计（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｏｍｐｏ＇ｓｉｔｉｏｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｓｉｇｎ）方法 对发酵培养基进行优化，ＧＳＨ产量为１６０．１ ｍｇ／Ｌ，胞内ＧＳＨ含量达到１．７％，与优化前的情况相比提高近一倍【５０１。采用Ｂｏｘ．Ｂｅｈｎｋｅｎ设计方案和响应面模型研究葡萄糖、蛋白胨和ＭｇＳ０４浓度对＆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＣＲＣ２１７２７生产ＧＳＨ的影响，也取得了令人满意的结果【５ｌ】。根据正交试验获得的实验数据，通过神经网络模型（ＮｅｕｒａｌＮｅｔｗｏｒｋＭｏｄｅｌ）进行分析预测，对Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ ＷＳＨ ０２．０８发酵生产ＧＳＨ的培养基进行了优化，摇瓶条件下ＧＳＨ胞内含量达２．５％，ＧＳＨ产量和细胞干重也有８第一章绪论较大幅度的提古【５２１。此外，Ｚｈａｎｇ等【５３】根据均匀设计对ＧＳＨ合成九种发酵培养基营养元素进行优化，结果ＧＳＨ产量得到明显提高。此外，发酵培养的环境条件也是不可忽视的重要因素，影响细胞生长以及ＧＳＨ合成的环境因素主要有温度、ｐＨ、溶解氧和接种量等。温度直接影响着代谢中各 种酶的活性和生化反应速率，对于发酵法生产ＧＳＨ来说，由于细胞生长和ＧＳＨ合成最佳温度不相同，因而通过两阶段温度控制，最终ＧＳＨ产量明显得到显著提高【５４】。ｐＨ决定营养物的解离状态，制约着细胞对营养物质的吸收利用、反应过程 中酶最佳活性以及细胞膜通透性等，在保证细胞正常代谢的前提下，通过低ｐＨ胁 迫将部分胞内ＧＳＨ分泌到胞外以达到二次积累ＧＳＨ的目的【５５】。此外，溶氧供应 充分与否将会影响细胞生长以及接种量的大４，Ｎ会影响迟滞期的长短等。因此，在营养条件确定的基础上，对环境因素的优化也是必不可少的。（２）发酵过程控制ＧＳＨ作为一种胞内产物，在提高生产菌株胞内合成ＧＳＨ能力的同时，还需要提高细胞浓度，从而提高ＧＳＨ的总产量。高细胞密度培养是实现这一目标最有效的方法之一。在细胞高密度培养过程中，必须加大底物碳源（如葡萄糖）的供应，但是过高的碳源浓度会产生Ｃｒａｂｔｒｅｅ效应，抑制细胞的生长并且会造成目标产物 得率下降。补料分批发酵操作能使发酵系统中保持低的底物浓度，一方面消除了 碳源快速利用引起的阻遏效应，维持发酵罐中良好的好氧发酵条件，另一方面又 避免了培养基中某些成分的毒害作用，而且还可以起到稀释发酵液以降低粘度的 作用。通过流加底物可以延长细胞对数生长期和平衡期的持续时间，增加生物量 和平衡期细胞代谢产物的积累，因此发酵工业中大多采用这种培养方式进行ＧＳＨ 生产【５６１。 补料分批发酵的类型很多，按补料的方式分为连续补料、不连续补料和多周期补料等：而连续补料方式又可分为快速补料、恒速补料、指数速度补料和变速补料等【５７１。目前应用比较普遍的底物流加方式有恒速流加、指数流加和反馈控制 流加等。恒速流加是将葡萄糖以恒定的速率加入发酵罐，该种流加策略简单易行，便于操作控制；指数流加是指根据细胞在特定时期以对数形式增长，通过控制底物 流加速率使流加量在理论上刚好满足细胞所需量，因而将副产物形成限定在最低范围内，该模式操作简单，不需要什么特别设备；反馈控制流加将流加速率与物 理参数（ｐＨ、溶解氧、Ｃ０２产生速率、乙醇浓度和呼吸商等）相耦合而组成间接 反馈控制系统。上述三种流加模式各有优势，可根据不同需要进行选择使用，经 过比较恒速流加、指数流加和反馈控制流加三种补糖策略对重组大肠杆菌高密度培养合成ＧＳＨ的影响，取得了令人满意的结剁５剐。由此可见，流加发酵是获得酵母高细胞密度培养的最有效的方法之一。然而，９江南大学博士学位论文在流加发酵过程中控制合适的细胞比生长速率对于迸一步提高ＧＳＨ产量是非常重 要的。在研究了＆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ培养中比生长速率以）和比ＧＳＨ生成速率（ｐＧ）之间关系 的基础上，提出了一种简单的数学模型用来确定＆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ补料培养中∥的优化模式，结果发现，最终ＧＳＨ总量比对照提高了４１％，胞内ＧＳＨ含量也有很大提 高【５９】。通过在线监测发酵液中溶解氧和乙醇的浓度，运用前馈／反馈控制系统确定葡萄糖的流加速率，使葡萄糖和乙醇同时被利用。发酵结束时ＧＳＨ产量为２３６０ｍｇ／Ｌ，比指数流加方式提高了４０％，胞内ＧＳＨ含量达到３．７％【６０】。通过对发酵过程中乙醇产生的速度进行模糊逻辑控制，进而优化了＆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ生产ＧＳＨ的流 加发酵过程，ＧＳＨ的比生产速率达到６．２ ｍｇ／ｇ／ｈ，最终发酵水平提高了５６０％［６１］。 此外，在酵母发酵法生产ＧＳＨ中，通过控制乙醇浓度和呼吸商大小，经过５２ ｈ细 胞高密度培养，细胞干重和ＧＳＨ产量分别高达１４０ ｇ／Ｌ和１６２０ｍｇ／Ｌｔ６２ｊ。上述结果表明，在通过流加底物提高细胞高密度培养生产ＧＳＨ中，通过选择合适的流加策略，细胞浓度将显著提高，然而随着细胞密度的上升，胞内ＧＳＨ含 量将会大大下降，因而如何在提高细胞密度的同时也促进胞内ＧＳＨ的合成，这样ＧＳＨ总产量将会得到提高。 （３）ＧＳＨ合成前体物质的添加 Ｌ．谷氨酸、Ｌ．半胱氨酸和甘氨酸作为ＧＳＨ合成的三种前体氨基酸，他们充足与否将直接影响ＧＳＨ的合成。通常情况下在ＧＳＨ发酵生产过程中，所需的三种前体氨基酸可以通过微生物细胞在糖类代谢的基础上，经过一系列生化反应后自身合成，但这些合成途径很容易受到细胞自身性能和状况以及外界营养和环境条件的影响而不能满足ＧＳＨ合成所需。因此在培养基中加入这三种前体氨基酸将可 能有助于提高胞内ＧＳＨ含量，进而提高ＧＳＨ产量。Ａｌｆａｆａｒａ等【６３】首先在摇瓶条件 下考察了三种组成氨基酸对＆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫＹ５７１ｌ发酵生产ＧＳＨ的影响，结果发现Ｌ．半胱氨酸是提高ＧＳＨ比合成速率及ＧＳＨ产量的关键氨基酸。但超过一定的浓 度会对细胞生长产生部分抑制作用，原因可能是由于糖代谢过程中一些酶的活性 中心离子与过量的Ｌ．半胱氨酸发生螯合作用而使这些关键酶降低或失去了活性。此外，添加时间对细胞生长影响也很明显。因此，在发酵过程中应采用Ｌ．半胱氨酸的补加策略以尽可能减少其对细胞生长的抑制。为此，Ａｌｆａｆａｒａ等哗】进一步研究了流加培养中不同类型的Ｌ．半胱氨酸添加方法对ＧＳＨ产量提高幅度的影响，提出了一种快速的Ｌ．半胱氨酸添加策略，并利用此策略来最大幅度地提高ＧＳＨ的总产量。根据这种快速添加半胱氨酸的方法，提出了一个由质量守恒方程和肌ＰＧ相互 关系组成的简单模型。通过这个模型，在流加培养中确定了一个最佳的操作策略：（ａ）通过对口进行ｂａｎｇ．ｂａｎｇ控制将整个培养过程分为细胞生长和ＧＳＨ合成两个阶段；（ｂ）在ＧＳＨ合成起始阶段一次性添加半胱氨酸。结果发现，在Ｌ．半胱氨酸的添加量为Ｏ．７ ｍｍｏｌ／ｇ细胞时，ＧＳＨ的比合成速率和ＧＳＨ产量均为未加Ｌ．半胱１０第一章绪论氨酸时的两倍，且未表现出对细胞生长的抑制效应。 Ｗｅｎ等【６５】分别研究了九种氨基酸对ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴ６５细胞生长和ＧＳＨ合成的影响，结果发现半胱氨酸是ＧＳＨ合成的关键性氨基酸，但同时它对细 胞生长具有一定的抑制作用，而谷氨酸、精氨酸以及甘氨酸除了对细胞生长具有促进作用外，还可促进细胞合成ＧＳＨ。与其他六种氨基酸相比，谷氨酸、半胱氨 酸和甘氨酸对于ＧＳＨ合成作用最大。为此，ｗ．ｅｎ等【６６ｊ进一步通过均匀设计（ＵＤ） 实验来优化三种氨基酸添加浓度并提出了两阶段氨基酸添加策略，即在摇瓶实验条件下，细胞培养２ ｈ后，添加２ ｍｍｏｌ／Ｌ半胱氨酸，７ ｈ后，添加三种混合氨基酸（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酸、１８ ｍｍｏｌ／Ｌ甘氨酸、３．３５ ｍｍｏｌ／Ｌ半胱氨酸），发酵结束时，胞内ＧＳＨ 含量达１．６７％，比对照提高了７２．２％。 （４）ＡＴＰ添加与再生促进ＧＳＨ合成 对于发酵法生产ＧＳＨ来说，每合成１分子ＧＳＨ，需２分子的ＡＴＰ，因而ＡＴＰ 充足与否是提高底物转化效率和实现ＧＳＨ高效合成的关键条件之一。当以葡萄糖 为碳源通过酵母合成ＡＴＰ时，首先葡萄糖经过糖酵解途径（ＥＭＰ）生成丙酮酸，之 后在有氧条件下进入三羧酸循环（ＴＣＡ），最终葡萄糖被完全氧化为二氧化碳和水， 该过程中形成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤＨ）经氧化磷酸化产生大量的 能量，一部分以ＡＴＰ形式用于ＧＳＨ和其他物质合成，其余大部分能量则以其他形 式贮存于体内。就发酵法生产ＧＳＨ而言，尤其是细胞高密度培养，当葡萄糖流加停止以及随着前体氨基酸的加入，合成ＧＳＨ所需的ＡＴＰ主要来源于胞内所贮存的能力，然而 当胞内能量被耗尽时，ＧＳＨ合成就会被终止。因而通过添加ＡＴＰ或补加葡萄糖产 生ＡＴＰ可促进ＧＳＨ进一步合成。李寅等【６‘７】在摇瓶培养中考察了前体氨基酸和ＡＴＰ 的添加对重组Ｅ ｃｏｌｉ生产ＧＳＨ的影响，发现二者均能明显促进ＧＳＨ在细胞内的 积累。本论文中也在此方面开展了研究，高密度培养Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ ＷＳＨ ０２．０８结束后，在添加三种前体氨基酸的基础上，进一步通过补加适量ＡＴＰ，结果ＧＳＨ产量得到 较大幅度的提高【６引。然而由于ＡＴＰ价格昂贵，只适用于实验室研究。因而从工业 规模ＡＴＰ再生反应的角度来看，通过碳水化合物（葡萄糖）为基质再生ＡＴＰ用于 ＧＳＨ合成是经济和有效的。然而关于此方面的研究报道却相对较少。（５）ＧＳＨ合成关键酶控制 在ＧＳＨ的生物合成中，谷氨酰半胱氨酸合成酶（ＧＳＨ Ｉ）作为一种限速酶， 和ＧＳＨ合成酶（ＧＳＨＩＩ）会受到ＧＳＨ和ＧＳＳＧ的反馈抑制【３ｌ】。尽管通过克隆构建同时表达ＧＳＨ合成酶系中两个酶的基因水平来提ＧＳＨ合成能力，然而，这些方法还无法达到工业化生产的要求，目前只能停留在实验室研究阶段。对于发酵法生产ＧＳＨ而言，随着胞内ＧＳＨ含量的上升，ＧＳＨ Ｉ会受到胞内ＧＳＨ抑制而使 ＧＳＨ合成受阻。我们前期研究发现，利用低ｐＨ条件对细胞进行生理胁迫作用，江南大学博士学位论文促使胞内部分ＧＳＨ分泌到胞外，有效的解除胞内ＧＳＨ对ＧＳＨ Ｉ的反馈抑制效应，并在发酵后期补加葡萄糖后，使细胞二次积累ＧＳＨ，同时达到了较高的胞外ＧＳＨ浓度，从而实现了ＧＳＨ总量的较大幅度的提高【５５１。本论文也在此方面开展了研究，为了减轻ＧＳＨ对ＧＳＨ Ｉ的反馈抑制，将半胱氨酸添加与低ｐＨ胁迫相结合，通过低ｐＨ生理胁迫作用使胞内部分ＧＳＨ分泌到胞外，由于胞内ＧＳＨ含量下降，ＧＳＨ活性所受抑制得到部分解除，从而促进胞内ＧＳＨ再次合成ｌｏ引。Ｉ１．３环境胁迫对谷胱甘肽合成的影响ＧＳＨ作为一种同时具有卜谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物，分为还原 型和氧化型两种，在生物体内大量存在并起作用的是还原型ＧＳＨ［引，ＧＳＨ在生物 体内具有多种重要生理功能，特别是对于维持细胞正常的氧化还原状态具有十分 重要的意义【４１。它还可缓解由于放射线、放射性药物或抗肿瘤药物所引起的白细胞 减少等症状【７０ｌ，以及作为一种抗氧化剂，具有清除体内自由基，抑制脂质过氧化 和保护细胞膜等功能用。此外，ＧＳＨ作为一种多功能的生物活性添加剂在食品加工业中应用愈来愈广【５】，产朊假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）属于Ｃｒａｂｔｒｅｅ阴性和Ｋｌｕｙｕｅｒ阳性酵母【７１１，具有利用更为广泛底物糖类的能力，且代谢阻遏效应不明显【７２１，因 而成为合成ＧＳＨ理想的细胞工厂。 微生物细胞是一个经济的体系，不会在胞内过量积累某一代谢产物。因此，只有使细胞处于一种不正常的生理状态下，出于保护自身的本能和抵御外界的伤 害，才会对其代谢产物做出调整。如能利用微生物细胞的这种生理应答特性，以 目标产物作为外界条件胁迫作用下的响应物或抵御胁迫作用的作用物，人为的提 供适当的环境刺激，极有可能促进细胞合成目标代谢产物的能力。当微生物在受到外界胁迫（氧化胁迫和渗透压胁迫等）时，细胞会产生某些应 激机制免受伤害【７３】。近年来尤其是微生物对氧化胁迫的应激机制已引起了广泛注 意［７４．７６】。已有研究表明ＧＳＨ在微生物细胞受氧化胁迫时起着非常重要的作用【７７～９１， 胞内ＧＳＨ耗尽会增加细胞对氧化胁迫的敏感度【８Ⅲ，而提高胞内ＧＳＨ水平可促进 细胞对氧化胁迫的抵抗能力瞵¨。 研究表明，利用Ｈ２０２刺激植物细胞，可促进其体内ＧＳＨ的合成【８２】。在动物 细胞中，Ｐｉｎｋｕｓ等【８３】发现活性氧能提高ＧＳＨ Ｉ活性，从而促进ＧＳＨ的合成。Ｉｚａｗａ［驯 研究指出ＧＳＨ在酿酒酵母＆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遭受Ｈ２０２氧化胁迫作用时能继续存活方面 起到了非常重要的作用。另外，ＲｕｉｚｔｓＳ］等研究表明盐胁迫（渗透压胁迫）可促进甘蓝 型油菜大量合成ＧＳＨ。上述研究结果说明了ＧＳＨ在细胞面临外界环境条件的刺激和胁迫时，起着至关重要的抵御和响应机制，是细胞抗损伤及代谢调节的关键物质之一。 ＧＳＨ作为微生物中最主要的非蛋白巯基化合物，其抗氧化作用是目前最为人１２第一章绪论们熟知的生理功能之一。已经发现基于ＧＳＨ的还原系统在酿酒酵母和大肠杆菌抵 抗氧能力中具有重要的作用，而近几年来通过对ＧＳＨ的生理作用研究进一步深入 反映出其在保护微生物、动植物抵抗酸胁迫【８６１、活性氧胁迫【８?８９１、冷冻胁迫【９‘叫等 方面发挥了一定作用，这些研究无疑给利用环境胁迫来促进ＧＳＨ的合成提供了新 的思路，拓宽其在科学研究和工业生产领域中的运用。 然而对于产朊假丝酵母细胞，利用环境胁迫促进其胞内ＧＳＨ的合成，却鲜见 报道，而且仅仅局限于现象的发现及对现象的简单剖析。利用环境胁迫（氧化胁迫 和渗透压胁迫等）是否能促进产朊假丝酵母合成ＧＳＨ？如果回答是肯定的，那么，产朊假丝酵母是如何调节细胞系统积累ＧＳＨ以抵御环境胁迫？不同胁迫因子促进ＧＳＨ合成的机制是否相同？上述这些问题一直是学术界和生产领域悬而未决的问 题。 遗憾的是，环境压力（胁迫）同时对细胞代谢活性造成了一定的伤害，对底 物转化率和生产强度产生了较大影响，即胁迫对菌体生长产生抑制作用进而对底 物转化率和生产强度产生负面影响，从而影响ＧＳＨ的合成，最终导致ＧＳＨ总产 量的下降。因此，如何解决环境压力处理（胁迫）下所引起的负面效应，提高目 标菌株的耐环境压力，是产朊假丝酵母发酵生产ＧＳＨ的关键问题。以下问题有待进一步探究：（１）不同种类胁迫因子对细胞生长和ＧＳＨ合成的影响如何？（２）不同种类胁迫因子促进ＧＳＨ合成的作用机制是什么？其作用机制之间是否有关联？（３）如何在尽量不影响细胞生长的同时，对微生物细胞施以适当胁迫来最大限度促进ＧＳＨ合成？１．４本论文的主要研究内容１．４．１发酵法合成谷胱甘肽研究中仍存在的问题 作为一种重要的药物试剂，ＧＳＨ在临床上用途极广，同时ＧＳＨ的抗氧化性能 又使得它在食品加工业中日益受到青睐。日本的Ｋｙｏｗａ和Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ等公司早在 ２０世纪８０年代就完成了ＧＳＨ的工业化生产，现已成为全世界ＧＳＨ的主要生产和 供应商【ｌｏ】，由于产量有限加之ＧＳＨ的应用范围及用量越来越大，ＧＳＨ的市场价格一直居高不下。这给ＧＳＨ的广泛应用带来了许多困难。 有关ＧＳＨ的研究报道非常多，但绝大部分涉及的都是ＧＳＨ在生物体内生理功能的体现及其在疾病治疗过程中的应用等当前研究的热点内容。对于ＧＳＨ的生 物法生产，相关的文献资料则相对较少，而这些研究成果正是保证ＧＳＨ工业化生 产持续、稳定、高效运行的理论依据和技术保证。因此，加大ＧＳＨ生物法生产研 制开发的力度并投入生产已经势在必行。由于酶法生产ＧＳＨ成本相对较高而一直未被商业化。而发酵法生产ＧＳＨ则江南大学博士学位论文采用廉价的糖类原料，利用微生物体内物质的代谢途径来进行ＧＳＨ合成，所以在２０世纪８０年代初日本已经实现商业化了酵母发酵法生产ＧＳＨ的产业化。虽然目前日本已经实现了酵母发酵法生产ＧＳＨ的产业化，并且也将研究结果 以专利的形式公布于众，但总体来说，对整个ＧＳＨ发酵过程的把握和分析还相对 肤浅，对ＧＳＨ产量、得率和生产强度等主要技术指标的影响因素的探讨还不够透 彻，因而，仍有以下几个方面的关键问题值得我们去进行更为深入的研究。 （１）ＧＳＨ属于胞内产物，因此为了增加ＧＳＨ产量，有必要提高细胞密度，无疑流加发酵方式是较为理想的选择。但在流加培养过程中，要采用怎样的控制策略才可以获得较高的细胞密度呢？同时又要保持细胞具有较高的合成ＧＳＨ能力，二者之间的矛盾一直是困扰研究者们的难题之一，如何解决这一矛盾对最终实现 ＧＳＨ的高积累则至关重要。（２）发酵法生产ＧＳＨ中，虽然出发菌株可以直接利用自身代谢产生的前体氨基酸合成ＧＳＨ，但研究表明，前体氨基酸的添加对＆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ细胞合成ＧＳＨ具有一定的积极作用。三种前体氨基酸对于Ｃ ｕｔｉｌｉｓ发酵生产ＧＳＨ是否具有同样的 效应？另外，对于细胞高密度培养过程中，三种前体氨基酸的变化对细胞生长和ＧＳＨ又有何影响？以及三种前体氨基酸在添加策略上需要进行怎样的考虑，才能在细胞高密度发酵的同时，又能维持较高的ＧＳＨ胞内含量？ （３）ＡＴＰ作为发酵法生产ＧＳＨ的又一关键影响因子，因而在整个细胞培养过程 中细胞自身所产生的ＡＴＰ是否能满足细胞生长和ＧＳＨ合成所需呢？此外，当葡萄糖停止流加后，ＡＴＰ又从何而来以及如何通过ＡＴＰ再生继续合成ＧＳＨ？如通过流 加葡萄糖产生ＡＴＰ，那么ＡＴＰ再生系统中葡萄糖消耗、ＡＴＰ产生与利用及ＧＳＨ合成之间的关系又如何？ （４）对于发酵法生产ＧＳＨ而言，尤其是细胞高密度培养，随着前体氨基酸添 加和ＡＴＰ再生，胞内ＧＳＨ含量将会进一步提高，然而胞内积累的ＧＳＨ势必对其进一步合成产生强烈的抑制作用，因此，如何将胞内合成的ＧＳＨ分泌至胞外以减轻 ＧＳＨ对其合成关键酶ＧＳＨ Ｉ的抑制也是值得深入研究的热点课题之一。 （５）微生物细胞本身是一个经济的体系，不会在胞内过量积累某一代谢产物，ＧＳＨ合成特性是怎样的呢？当细胞处于一种受伤害的生理状态下，出于保护自身 的本能和抵御外界的伤害，细胞会对其自身代谢做出调整，因而研究环境胁迫下细胞是如何合成ＧＳＨ，将为ＧＳＨ合成提供一种理论依据。并且根据此理论基础以 及微生物细胞的生理学特性，人为的设计并提供适当的环境胁迫，促进细胞大量合成ＧＳＨ无疑会为ＧＳＨ合成提供一个全新的理念。 １．４．２本论文的主要研究内容 作为国家８６３基金资助项目（编号：２００６ＡＡｌ０２３１３）“谷胱甘肽发酵过程的智能１４第一章绪论优化与控制技术，，和科技部中小企业创新基金资助项目（编号：０６Ｃ２６２１３２０１０７４） ｔ?微生物发酵法生产谷胱甘肽”的子课题，本论文的目标是：在实验室规模上以一株能在胞内高积累ＧＳＨ的产朊假丝酵母（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ ＷＳＨ ０２．０８）为生产菌株，以细胞和ＧＳＨ的高产量、高得率和高生产强度为目标，研究了细胞高密度培养、前体氨基酸添加、ＡＴＰ添加及再生以及过氧化氢和硫酸钠胁迫等一系列可行性方案对ＧＳＨ合成的影响，以及对ＧＳＨ整个发酵过程进行了较为系统和深入的研究。具体研究内容可分为以下几个部分：（１）７ Ｌ罐上考察分批发酵条件及流加发酵条件对Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ发酵法生产ＧＳＨ的影响，并确定适宜的Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ高密度发酵生产条件来实现细胞高密度培养。 （２）在细胞高密度培养前提下，提出低ｐＨ胁迫与半胱氨酸添加相结合策略， 使ＧＳＨ向胞外分泌，解除胞内ＧＳＨ对ＧＳＨ Ｉ活性抑制的影响进而提高ＧＳＨ合成 能力。此外，研究溶氧对半胱氨酸氧化及ＧＳＨ合成的影响，提出两阶段溶氧控制 与半胱氨酸添加相结合来促进ＧＳＨ合成和降低半胱氨酸氧化。最后将低ｐＨ胁迫 和两阶段溶氧控制同时与半胱氨酸添加相结合应用于高密度培养Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ ＷＳＨ０２．０８来促进ＧＳＨ合成。（３）研究菌体生长阶段Ｌ．谷氨酸、甘氨酸和Ｌ．半胱氨酸对细胞生长及ＧＳＨ合成的影响。在此基础上，提出两阶段氨基酸添加策略，即细胞生长阶段添加甘氨酸促进菌体生长和ＧＳＨ合成，细胞停止生长时添加三种混合氨基酸来提高胞内 ＧＳＨ含量。（４）在添加氨基酸的基础上，通过添加ＡＴＰ来进一步提高ＧＳＨ产量，并对细胞膜进行通透性处理来提高ＡＴＰ的利用率和ＧＳＨ的产量，此外，通过补加葡萄糖 产生ＡＴＰ用于ＧＳＨ合成。（５）根据微生物细胞的生理特性，人为的提供适当的环境刺激，以提高细胞合成ＧＳＨ的能力，鉴于此目的，具体考察过氧化氢和硫酸钠胁迫对ＧＳＨ合成的影响并对合成ＧＳＨ的机理进行初步探讨。参考文献【１】Ｃａｒｍｅｌ－Ｈａｒｅｌ０，Ｓｔｏｒｚ Ｇ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ａｎｄ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｄｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，５４：４３９－４６１．ｓｔｒｅｓｓ【Ｊ】．Ａｎｎｕ【２】Ｍｅｉｓｔｅｒ Ａ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｍ Ｅ．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ【Ｊ】．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ 【３】Ｍｅｉｓｔｅｒ Ａ．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ａｓｃｏｒｂａｔｅ，ａｎｄ１９６９－１９７５． ｃｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍ，１９８３，５２：７１ １－７６０．ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ【Ｊ】．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９４，５４（７）：ｎｏｎ?ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ【４】Ｐｅｎｎｉｎｃｋｘ Ｍ Ｊ．Ａｎ ［５】Ｓｉｅｓｏｖｅｒｖｉｅｗｏｎｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｖｅｒｓｕｓｙｅａｓｔｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ，２００２，２（３）：２９５．３０５．Ｈ．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＦｒｅｅＲａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，１９９９，２７（９－１ ０）：９１６．９２１．江南大学博士学位论文【６】欧阳平凯．化工产品手册．生物化工产品手册【Ｍ】．北京：化学工业出版社，１９９９．１５２．１５３．【７】韩秀文，屈铭，缪希茄等．谷胱甘肽在水溶液中的构象研究【Ｊ】．化学通报，１９９４，３：３６?４０． 【８】刘振玉．谷胱甘肽的研究与应用【Ｊ】．生命的化学，１９９５，１５（１）：１９－２１．【９】Ｃｏｏｐｅｒ 【１０】ＳｍｉｔｈＡ Ｊ Ｌ，Ｋｒｉｓｔａｌ Ｂ Ｓ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９７，３７８（８）：７９３－８０２． ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＪＬａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，１ ９７４，８３：４４４－４５０．Ｊ Ｅ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｒｙｔｈｒｏｅｙｔｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｆｌｕｘ ｔｏ ｔｈｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔ【１ｌ】沈亚领，李爽，迟莉丽等．谷胱甘肽的应用与生产【Ｊ】．工业微生物，２０００，３０（２）：４１－４５． 【１ ２】Ｐａｓｔｏｒｅ ［１３】Ｉｚａｗａ７３－７６． Ａ，ＦｅｄｅｒｉｃｉＱＢｅｒｔｉｎｉＥ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｄｏｘ ａｎｄｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＣＩｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，２００３，３３３（１）：１９?３９．Ｓ，ＩｎｏｕｅＹＫｉｍｕｒａ Ａ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎ ｙｅａｓｔ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｏｎａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｊ］．ＦＥＢＳＬｅｔｔ，１９９５，３６８：【１４】}