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胸腺注射供者可溶性抗原在玻璃化冻存人卵巢组织异种移植兔模型中的应用探索
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科研论文：冻存的脱落乳牙牙髓组织作为再生医学的干细胞资源
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摘要人类脱落的乳牙被认为是再生治疗的前景资源，因为其包含独特的出生后干细胞，被称为是SHED，具有自我更新，多能分化，免疫调节的能力。然而，脱落乳牙的保存技术尚不完善。本研究旨在评估冻存脱落乳牙牙髓组织为细胞治疗提供SHED的可行性。提取自冻存两年以上（25个月至30个月）组织的SHED与源自新鲜脱落的乳牙的SHED具有相似的干细胞特性，如克隆形成，自我更新，干细胞标记物的表达，多向分化，体内组织再生的能力以及体外免疫调节的能力。为了检测冻存组织来源的SHED在免疫疾病方面的治疗效能，将其静脉回输入系统性红斑狼疮MRL/lpr模型鼠体内，结果表明，系统性红斑狼疮的症状得以改善，生命周期延长，自身抗体水平下降，狼疮性肾炎缓解。冻存组织来源的SHED提高了狼疮鼠全身及局部的白介素17型T细胞数量，&改善了长骨的骨质疏松。另外，冻存组织来源的SHED促进了免疫缺陷小鼠颅骨缺损的修复。冻存组织来源的SHED与新鲜组织来源的SHED在治疗免疫和骨骼疾病中表现相同。这些结果表明，冷冻的牙髓组织可以为细胞免疫治疗以及再生医学提供合适的理想的干细胞资源。介绍间充质干细胞（MSCs）可以从许多胎儿以及成年人组织中分离，因其特别的多能分化能力以及免疫调节能力成为了细胞治疗技术的来源之一。很多研究者将其作为成骨细胞的前提用于骨组织工程。临床的应用印证了这类细胞的骨再生效能。另外一方面，间充质干细胞表现出对免疫细胞B，T淋巴细胞，树突细胞，自然杀伤细胞的强大的调节能力。这种免疫调节能力对一些免疫疾病有临床优势，如急性移植物宿主免疫反应（GVHD），造血干细胞移植（HSC），系统性红斑狼疮（SLE）。最近的发现评估得到新鲜的人脱落牙齿的牙髓细胞保存有间充质群，被称为SHED。SHED表现出干细胞的特性，如克隆形成，细胞增殖，多向分化能力，可成牙，成骨，成脂，成神经样细胞。当将SHED植入到免疫缺陷鼠体内，其表现出了体内的组织再生能力，如再生牙本质/牙髓质，骨/骨髓结构。SHED可以促进临界骨缺损模型的修复，如大鼠的颅骨以及猪的下颌骨缺损。然而，全身的SHED回输有效改善了SLE样疾病的症状，如改善过高的自身抗体，肾功能障碍，以及白介17的过度活跃。因此SHED被认为是有效的组织工程、免疫治疗的细胞资源。脱落的乳牙相对于其他组织如骨髓，脂肪组织来说更容易获取，然而有效的保存是SHED临床应用的一个关键问题。另外由于牙齿脱落的时机难以预测，实施即时的SHED提取是难以实现的。目前，人类干细胞的冻存成为了一个可行的干细胞储存方法。因此，我们尝试冻存干细胞两年以上，并且试验研究冷藏细胞体内体外的生物免疫效能。进一步的，我们验证了复苏的SHED在模型鼠上治疗SLE的能力，在免疫缺陷鼠上治疗骨缺损的能力。材料和方法伦理声明按照Kyushu 大学的伦理条例（393-01 ）获得人体标本。实验中涉及的乳牙组均经过家长的知情同意。动物实验操作遵照NIH的规定流程。人类样本人类脱落牙齿取自Kyushu大学医院的儿科，由5-7岁的患儿提供。人类外周血单核细胞取自28-34岁的健康志愿者。乳牙的冷冻保存以及SHED的分离表格S1中总结了脱落乳牙的冻存方法。从脱落乳牙中提取牙髓。在4度条件下与冻存液混合，-80度过夜。冻存液由10%的二甲亚砜，90%幼体牛血清组成。冻存的组织于液氮中储存两年以上（25-30个月）。另外一半新鲜组织用于提取SHED。应用克隆形成的方法分离提取SHED（CFU-F）。冻存的组织37度快速复温。两种组织都使用由磷酸缓冲液（PBS）配制的0.3%的一型胶原酶，0.4%的分散酶37度消化60分钟。使用70um的细胞筛获得单细胞悬液。细胞置于T75培养皿中，3小时后PBS冲洗，加入含有15%FBS，100uM抗坏血酸2-磷酸三钠盐，2mM的左旋谷酰胺，100U/ml青霉素，100ug/mlalpha修饰的链霉素Eagle’的生长培养基，于37°，5%的二氧化碳条件下培养。抗体在S1表格中总结。小鼠C57BL/6J 以及 Balb/cA-nu/nu鼠（雌性，6周） 购于CLEA日本。C57BL/6J MRL/ lpr 鼠源于SLC。恒温条件饲养，12小时昼夜交替，自由摄入水及饲料。脱落乳牙冷藏牙髓组织的组织学冻存的牙髓组织由4%的多聚甲醛PBS溶液固定，OCT包埋。冰冻样本切片厚度6um，一部分用于HE染色。同时使用STRO-1抗体和CD146抗体SUPER—PICTURE试剂盒染色。设置阴性对照，BIORVO BZ900显微镜观察。CFU-F 分析分离的细胞种在了100mm的培养皿中，并且在生长培养基中培养16天。培养瓶用4%PFA和0.1甲苯胺蓝缓冲液18个小时，含有50个细胞以上的群落作为克隆。计数克隆。倍增分析使用T-75培养皿培养细胞。接近融合时传代，直到细胞失去分裂能力。数量加倍的分数根据公式计算：log2 ( 获取的细胞数/初始种植细胞数量）。总体的分数由最后每个样品的叠加获得。溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）成分分析SHED过细胞筛，种于35mm的皿中，每个孔1000个，培养2天。BrdU试剂（表达载体）被加入到培养基中，比例是1：100。然后再培养24小时。细胞在乙醇中固定15分钟，再用BrdU的试剂盒染色处理，并且再用苏木精轻染。染色的样品在BIORVO显微镜下观察。7个图像随机选定计算BrdU阳性的细胞数量。细胞的增殖能力可以通过BrdU阳性的细胞核与所有成核的细胞比例评价。端粒酶活性分析按照端粒重复复制法，使用端粒酶试剂盒检测端粒酶活性，real-time PCR参数同前。使用HEK293T细胞作为阳性对照。细胞提取的片段在85°C下加热10分钟，作为阴性对照。荧光染色评估各个样本的端粒酶活性。流式细胞分析SHEDP3代SHED细胞培养至50-60%融合。细胞（100*103/100 ul ）初始特异性抗体染色。同型抗体做阴性对照。使用FACSCalibur流式细胞仪分析。CellQuest软件计数阳性细胞，与同型对照相比，假阳性小于1%可以被接受。培养细胞的荧光染色4%的PFA固定细胞，含10%二抗的血清封闭。抗体及对照组4度过夜，并用CF 633-配合-二抗处理。4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色（DAPI），在显微镜下观察。计算阳性细胞的数量的百分比。半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）TRIzol提取总RNA，并使用I型DNase消化。使用Revatra Ace从100ng的总体RNA中合成cDNA。特异性的启动子见表S2。PCR使用特异性的启动子和RT-PCR Quick Taq HS DyeMix，在94度下，培养2分钟，反应40个循环，在94度45秒降解，在72摄氏度下60s一个循环，最后72度扩增。最终，取5ul在琼脂糖凝胶电泳上分析，在溴化乙锭下染色观察。条带使用Image-J软件测量，GAPDH作为内参。体外多能分析在体外，进行牙本质源性和骨源性诱导分析。SHED于60mm培养皿培养至融合，由含有1.8mM的磷酸二氢钾，以及10nM的地塞米松的培养基进行成牙本质和成骨诱导。每周换液两次。诱导一周后，牙本质源性以及骨源性的标记物通过半定量的RT-PCR分析以及碱性磷酸酶活性测试。四周后1%茜素红染色矿化结节。茜素红阳性的区域用NIH图像软件Image-J分析，并计算阳性区域的比例。体外软骨形成的诱导分析SHED用15ml的试管富集，并用Dullbecco修饰的Eagle基质培养，其中加入了15%的FBS，2nM左旋谷氨酰胺，100uM磷酸酯，2mM的丙酮酸钠，1%的ITS，100nM的地塞米松，10ng/mlTGFbeta1以及100U/ml青霉素和100ug链霉素。软骨形成的基质每两周更换一次。3周的诱导以后，软骨特异性基因通过半定量RT-PCR分析。体外脂诱导分析培养的SHED（P3, 5*1000/盘）培养到融合，用成脂源培养基诱导，其中加入，500uMisobutyl-methylxanthine, 60uM的吲哚美辛以及0.5uM的c醋酸氢化可的松，10UM的胰岛素。6周后，油红O染色来检测脂滴。油红O染色样本用异丙醇处理并在520nm下测量分析。RT-PCR分析成脂相关基因。体外上皮诱导的分析P3 SHED（5*1000细胞）接种于35mm的培养皿上，使用成品上皮培养基培养，EGM-2，含100U/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素。上皮生长培养基每2天一换。诱导后7天固定。上皮细胞的分化由抗CD31和CD34抗体诱导。体外成神经诱导P3 SHED（5*1000细胞每孔）接种于35mm的培养皿上，培养使用神经基质包括1*N2的补充物，10ng/ml基本成纤维细胞生长因子。10ng/ml的表皮成长因子。100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素，培养21天。每周换液两次，每次换液50%。神经细胞的分化程度由免疫荧光，抗体分别是抗胶质纤维丝的蛋白，抗神经元单纤维丝M，以及抗beta三型微管蛋白抗体。体外肝诱导分析P3 SHED（P3, 5*1000/盘）接种于35mm的培养皿上，并且使用Iscove修饰的Dullbecco培养皿，补充有10nM地塞米松，1%ITS，20ng/mlEGF，10ng/mlbFGF，20NG/ml肝细胞生长因子，20ng/ml滞瘤素M，100U/ml青霉素和100ug/ml的链霉素，四周，肝脏特异性的基因清蛋白由半定量的RT-PCR分析。体内组织再生分析按前述方法进行异体植入。SHED在培养基中的培养，混合HA/TCP。植于8-10周大的裸鼠皮下。8周后取样，4%PFA固定液固定，10%的EDTA解钙化。制备冰冻切片，HE染色或免疫荧光染色后，在BIORVO的显微镜下观察。体内自我更新的分析按照以往研究的方法进行体内植入。以HA/TCP为载体将SHED (P3) (4*106) （40mg）移植裸鼠体内。移植后八周，取样，用0.4%二型分解酶37度处理60分钟，获得单个细胞。细胞通过R-PE共聚抗体染色，磁珠分离获得CD-146阳性的细胞。通过流式细胞技术用CD146抗人抗纯化，抗鼠抗体验证。分离得到的细胞在低密度种植，并且培养以获得CFU-F。扩展后的CFU-F-形成细胞被通过HA/TCP携带植入到皮下，注射到二级免疫抑制的老鼠，8周，二级移植物通过HE染色和免疫荧光分析。移植物的组织学分析移植组织用PFA缓冲液过夜固定，5%EDTA脱钙。制备8-um厚度的冰冻切片，HE及免疫荧光染色，使用抗人线粒体抗体，抗STRO-1抗体以及抗CD146抗体。切片于镜下观察。随机筛选7个区域测量新形成的矿化组织，由NIH image-J软件处理，计算比例。单克隆源细胞分析参考之前的研究方法，将分离的冰冻细胞在24孔的多孔盘中每个孔注入1，2或4个细胞，加入生长培养基。排除非单个的细胞。单克隆体系的细胞将被用于群体翻倍，BrDU染色和成牙本质及成骨诱导等方面。Th17细胞的诱导分析TH17细胞的诱导同前。人得CD4+CD25-T细胞磁珠分选，使用CD4+CD5+的t调节细胞分离盒。他们由抗CD3和溶解性的CD28抗体三天激活，并用TGFbeta1(2ug/ml)和IL-6（50ug/ml）装载在SHED（20*1000/孔）3.5天。T细胞用抗PerCP-conjugated CD4 以及 FITC-conjugated anti-CD8抗体染色，并用R-PE-conjugated anti-IL-17以及APC- conjugated anti-interferon gamma 抗体，使用Foxp3染色试剂盒，用FACSCalibur分析。通过免疫荧光染色分析IL-17水平，按照说明书操作。MRL/lpr鼠的SHED注射实验方法同前所述。将含有SHED（0.1*106/10g身体重量）的PBS缓冲液通过静脉注射进入16周大的小鼠体内。定期观察，取样包括外周血，尿液，肾脏，主要淋巴结以及长骨。自身免疫抗体的分析，自身免疫球蛋白，外周血，尿液以及组织样本中的生物标记和生长因子使用ELISA试剂盒检测小鼠gG，IgM，抗核抗体，清蛋白，补体C3：alpha诊断，IL-17和核因子kappaB配体（sRANKL）；1型胶原N端肽的，操作参考说明书。肌酐计算以及尿蛋白通过比色学分析，参见手册。流式细胞技术分析鼠外周血TH17为了测量Th17在鼠外周血中的情况，鼠PBMNCs用抗CD4的PerCP-共聚体，抗CD8a的FITC共聚体培养，并后续痛R-PE共聚体抗IL-17和APC共聚体抗IFNgamma处理，并使用Foxp3染色缓冲试剂盒。染色的细胞在FACSCalibur上分析。组织病理学肾脏的样本用4%PFA的缓冲液过夜固定。用PBS洗过后，一些样本进行石蜡包埋，然后切成8um的厚度。石蜡的片段用HE，GOmori三色以及PAS染色。冷冻切片用抗C3补体抗体染色，并用CF633共聚体C3二级抗体处理。SHED体内追踪分析追踪SHED在MRL/lpr鼠体内的行径，SHED用CFSE荧光素标记。SHED单细胞悬液用CFSE溶液37度培养10分钟。标记后的细胞鼠尾静脉注射入MRL/lpr鼠体内。24小时或1周取淋巴结，肾脏，股骨。组织样本由4%的PFA固定过夜。骨组织用10%EDTA脱钙。所有的样本都被切成6um的冰冻切片，用DAPI染色，在显微镜下观察。骨的表型分析4%的PFA缓冲液中彻夜固定股骨样本，Skyscan 1076 扫描分析矿化密度及结构，包括骨量与骨小梁的量的比值，骨小梁的厚度，骨小梁的数量，骨小梁的分离，骨小梁的空间，这些都用CT分析软件根据说明进行计算。CT分析过后，10%EDTA脱钙处理，制备6um石蜡切片，HE染色。TRAP染色，其中包含0.01%萘酚AS—MX磷酸，20mM酒石酸，0.06%快速红色紫罗兰LB盐，在0.1M醋酸盐缓冲溶液10分钟。TRAP阳性的细胞如前计数。体外破骨和成骨分析3%的FBS冲出长骨骨髓。对于破骨研究，BMCs种植在24孔的盘子上，每个孔种1000000个，使用含10ng/ml的集落刺激因子和25ng/ml的sRANKL的alphaMEM，培养5-6天。第三天开始换液。培养用TRAP染色处理，TRAP阳性的细胞且多核（大于三）的计数。BMCs种植35mm的培养基的盘子中，并且包含10%的FBS，2mM的左旋谷氨酰胺，100uM的L-ascorbic acid 2-phosphate，2mM的beta-磷酸甘油，10nM的地塞米松，100U/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素。4周诱导以后，骨源性的培养基用1%的Alizarin红染色，矿化区域用NIH Image-J记录。头颅骨缺损的骨再生头颅骨缺损的骨再生如前所述。简单的讲，P3 SHED与HA/TCP携带混合。头颅骨，尤其是顶骨，移除以制作成极量骨缺损。SHED和HA/TCP的混合物放在了缺损处，颅骨的皮肤缝合起来。12周以后，颅骨用4%的PFA缓冲液彻夜固定，并通过1076扫描仪拍摄图像。之后，样本用10%的EDTA去钙化，并切成6um厚度的石蜡切片。切片HE和TRAP染色。一些切片用于抗体CD146的免疫荧光分析。数据分析t检验用于分析2组之间的显著性。P小于0.05被认为具有显著性。结果冻存SHED拥有MSC特性SHED显示出MSC的特性，包括克隆形成能力，自我更新，多能分化，体内再生，以及体外的免疫调节能力。目前的结果表明冻存牙髓组织提取的SHED具备以上特性。我们从脱落乳牙中提取牙髓组织，加入含10%DMSO以及90%FBS的冻存液，－80摄氏度过夜，液氮保存2年。归还脱落的乳牙。长期的冰冻保存后在37摄氏度下迅速解冻，之后使用。组织学分析得到冷冻保存的组织包含血管以及神经纤维，但是不包含成牙细胞。成牙细胞层可能因为机械的损伤或者样本冰冻的损伤而丢失。早期的MSC的标记物STRO-1和CD146阳性的细胞在血管周的区域内检查到，血管周细胞被定位在牙髓组织的血管周。这些数据表明冻存牙髓提取的细胞具有MSCs的特性。下一步，我们通过经典的CFU-F的方法从冻存牙髓分离得到MSCs，即SHED冻存型。通过单细胞培养获得克隆。克隆源性的细胞成现了不同的大小和密度。冻存来源的细胞与新鲜提取的细胞具有相似的集落形成能力。BrdU的染色分析表明SHED-冻存型保持着高的增殖能力。流式细胞分析证实，冻存来源的SHED表达STRO-1, CD146, CD73, CD105 不表达CD34，CD45以及CD14。CD90表达阳性（超过95%），与新鲜提取的类似。冻存型SHED有与新鲜提取的SHED相类似的免疫表型。RT-PCR证实，冻存型SHED表达了胚胎干细胞的基因，NOTCH1，NESTIN和低亲和性的神经生长因子，与新鲜提取的SHED一致。冻存型SHED表达神经嵴细胞的表面标记物，Nestin，的水平与SHED新鲜型一致。最近的研究证明冻存的SHED在NANOG，octamer4表达以及Nestin在乳牙干细胞表达的效果，并且也至少部分上支持冷藏细胞的SHED特性。总结来说，这些数据表明冻存牙髓组织提取的SHED保留MSC的特性。冻存SHED拥有多向分化潜能成牙与成骨诱导四周后，冷冻保存的SHED能够形成茜素红阳性的结节（图2A）冻存的SHED展现了高的ALP活性（图2B）,并且在诱导一周之后表达了成牙性和成骨性的特异性基因runtrelated 基因2， ALP，osteocalcin和dentin sialophosphoprotein(图2C)。三周成软骨诱导后，SHED表达了成软骨特异性基因，包括SOX9. affrecan 以及type X collagen（图2D）。SHED在6周成脂诱导后，出现脂肪细胞的表型，表现出油红O阳性的脂滴（图2E），且成脂基因lipoprotein lipase和peroxisome proliferator activated receptor-gamma2（图2F）。在4周肝细胞诱导后，冻存型SHED表达了层粘连蛋白基因，一种肝脏细胞特异性基因（图2G）。在一周内皮细胞诱导后，免疫荧光染色显示冻存SHED表达CD31和CD34两种上皮细胞标记分子（图2H），而三周神经细胞诱导后，表达神经细胞表面标记物神经纤维M和微丝蛋白beta三类（图2I）。冷冻SHED表现出和新鲜SHED相似的成牙性，成骨性，成脂，成软骨性，成肝细胞，成上皮细胞，成神经细胞的分化能力（图2）。这些数据表明冻存SHED保持着和间充质干细胞一样的多向分化的能力。冻存SHED展现了体内组织再生矿化的能力免疫缺陷小鼠皮下植入冻存的SHED和支架物8周以后（图s2），组织学显示牙本质／牙髓样的复合物，骨／骨髓样的结构在HA/TCP表面形成（图3A）。免疫荧光也显示人线粒体阳性细胞在矿化基质上排列（图3C）。人类特异性STRO-1和CD146抗体阳性的细胞在再生矿化的基质中也可以探测到（图3D）。另外一方面，仅仅植入了HA/TCP的对照组不表达矿化组织和人类特异性抗体阳性的细胞（图s3）。因此，这些结果表明，冻存SHED能够在移植组织中形成矿化组织。与新鲜SHED相比，冻存SHED形成的再生矿化组织的量相似（图3B）。这些数据表明冻存SHED保留了新鲜SHED体内的再生能力。尽管，间充质干细胞移植物中骨髓分化来自宿主细胞， SHED移植物中骨髓和牙髓的细胞来源还不明确，需要未来进一步研究。冻存SHED保持着自我更新的能力用以评估冻存SHED的自我更新的能力，进行了次序移植这种金标准检验方法（图s2）。CD146是人间充质干细胞重要的细胞表面标记物。从第一次移植物中分离出细胞群，并做人CD146染色。阳性细胞由磁珠分选纯化。流式细分析显示分选后的细胞表达人CD146（大于95%），而不表达小鼠CD146（0%）（图3E），具有很高的纯度。当这些分选细胞低密度培养时，他们有能力形成CFU-Fs，且免疫染色表现为人CD146阳性（图3F），表明CD146阳性细胞在长期的移植过程中仍在移植体中维持完整干细胞状态。集落细胞群形成后，移植到免疫缺陷小鼠后8周，二次移植物包含着牙本质和牙髓质复合物样的结构（图3G），类似于初次移植物中的矿化结构复合体。抗人CD146和抗人线粒体特异性阳性的细在矿化培养基中定位（图3H）。群体复制以及端粒酶活跃度与自我更新的能力相关联。群体复制分析显示冻存SHED的细胞增值时间延长且有时限性（图3I）。端粒酶活跃度检测显示冻存SHED活跃度较低（图3J）。总结来说，这些结果证明冻存SHED具备自我更新的能力。冻存SHED是异源性细胞群体为了验证冻存SHED的异源性，共有17个成软骨的单克隆群落从冻存脱落乳牙牙髓干细胞中获得。每一个群落表现出不同的群体复制分数，不同的细胞增值能力群和不痛的茜素红阳性区域（图3K）。这些发现表明冻存SHED与新鲜SHED类似，具有异源性。冻存SHED体外的免疫调节特性为了探索冻存SHED是否像新鲜型一样有对TH17细胞的免疫调节特性，将冻存SHED与抗CD3和抗CD28，IL6和TGFbeta1激活的CD4+CD25—T细胞共同培养。冻存SHED能够阻止CD4+IL17+IFNgamma－的TH17细胞的分化和IL17的分泌（图3L），表明冻存SHED体外保持着对TH17细胞的抑制能力。冻存SHED移植延长并改善MRL/lpr小鼠自身免疫疾病和肾功能障碍SLE样的自身免疫病症状出现在MRL/lpr鼠的7-8周。外周的自体免疫水平的从12周急剧升高。为了衡量冻存SHED对较严重的小鼠的治疗能力，将冻存SHED静脉移植到了人类SLE病的模型16周MRL/lpr鼠中（图s4）。Kaplan-Meyer曲线显示冻存SHED移植显著延长了MRL/lpr小鼠的生命（图4A）。Mantel-Haenszel测试评估的小鼠存活时间中位数是155.0, 219.0和212.5天，分别对应对照组，新鲜SHED组，和冻存SHED组。在治疗SLE中的关键指标，自身抗体ANA和抗dsDNA IgG以及IgM抗体，在移植冻存SHED后都有明显的下降（图4B）。疾病中升高的外周免疫球蛋白包括IgG1，IgG2a，IgG2b以及IgM都因冻存SHED的移植而减少（图s5）。组织病理学分析显示冻存SHED阻止了肾炎相关细胞增生，肾小球膜基质增生和基底膜紊乱的发生（图4C）。免疫荧光染色表明移植冻存SHED后肾小球中补体C3的沉积消失（图4C）。冻存SHED移植后，血清白蛋白水平升高，尿蛋白减少（图4D）, 且血清肌酐水平下降（图4D）。冻存SHED移植与新鲜SHED相比，在生命长度，自身抗体水平以及肾脏功能方面的治疗效果相似（图4和s5）。这些结果表明冻存SHED保留了其对MRL/lpr小鼠的治疗效能。移植冻存SHED抑制MRL/lpr小鼠外周的TH17细胞Th17细胞调节是SLE的一个关键的治疗手段。本研究表明经过冻存SHED治疗的MRL/lpr小鼠在20周龄时外周Th17水平以及IL-17水平显著降低（图5A-5C）。这种对Th17细胞的抑制效果与新鲜SHED相似（图5B和5C），表明冻存SHED保留了免疫调节功能。全身回输的冻存SHED迁移到MRL/lpr小鼠的淋巴结和肾脏调节局部的免疫微环境为了评估冻存SHED迁移到损伤组织的能力，CFSF标记的冻存SHED被静脉回输到16周龄的MRL/lpr鼠。有许多CFSE阳性的冻存SHED在移植后一天于淋巴结和肾脏，尤其是肾小球被观察到（图5D和s6）但是从第2天到第7天，两个部位的该种细胞都逐渐减少（图5 D和s6）。冻存SHED和新鲜SHED回输后的小鼠相较于对照发病小组，其在淋巴结和肾脏中的炎症因子IL-17和IL-6都明显减少（图5E）。总结来说，这些研究表明冻存SHED能够迁移至损伤组织并且可能改善局部受损组织的病理环境。全身回输的冻存SHED改善MRL/lpr小鼠骨质疏松16周MRL/lpr小鼠回输冻存SHED1天后评估其迁移到骨组织的能力。CFSE阳性的SHED在移植7天时可以在骨髓中有少量存在（图s7）。该存在量于回输新鲜SHED相似（图s7）。MRL/lpr小鼠长骨表现明显的骨质疏松（图6A-6D）。全身移植冻存SHED改善该小鼠的骨密度和骨小梁结构（图6A,6B）。与发病对照组相比，移植冻存SHED组长骨中的TRAP阳性细胞数量明显减少（图6E），且血清中的sRANKL以及CTX的水平也明显下降（图6F）。回输冻存和新鲜SHED组的发病小鼠与对照组比较，骨髓中CD4+IL17+IFNgamma-Th17明显减少（数据未给出），提示发病小鼠骨量丧失情况的改善可能来自于回输细胞的免疫调节作用。为了在体外检测破骨和成骨性，发病小鼠，回输冻存SHED组，回输新鲜SHED组三组小鼠的骨髓细胞本分离培养。用M-CSF和sRANKL刺激这些细胞，冻存SHED组与发病对照组相比，TRAP阳性的多核细胞显著减少（图6G）。成骨分析显示回输冻存组的茜素红阳性区域大于发病对照组（图6H）。冻存SHED组骨再生能力与新鲜SHED组类似（图6）。这些数据表明冻存SHED可以改善发病小鼠的骨质疏松。未来还需进一步评估SHED改善类似SLE免疫疾病中骨质疏松的机制冻存SHED修复免疫缺陷小鼠颅骨缺损根据现有的冻存SHED的体内组织再生能力，我们推测其和新鲜型一样具有骨缺损再生的能力（图7A-C）。我们在免疫缺陷小鼠上制造临界颅骨缺损模型，并通过HA/TCP支架植入冻存SHED到缺损区域（图s8）。与只植入支架组相比，含有冻存SHED组能再生大量骨样结构且含有骨髓样的结构（图7A-C）。荧光CD146抗体染色显示冻存SHED细胞是两组回输组中参与骨再生的细胞，在支架组中则不是这些细胞（图7B）。这些发现表明冻存和新鲜SHED可以分化成骨形成细胞并参与缺损修复。回输两种细胞组的移植位点有大量TRAP阳性破骨样细胞，而HA/TCP中却很少（图7D），这表明再生骨组织是一个生理性的重建过程需要破骨与成骨细胞共同作用。这些数据表明冻存SHED能作为组织工程骨再生的细胞来源。移植的MSCs受宿主淋巴细胞通过分泌炎性因子如IFNgamma和TNFalpha的影响，影响了其介导骨再生的能力。另一方面，乳牙干细胞能在没有免疫抑制的大鼠中介导颅骨缺损的修复。进一步研究有必要探索免疫缺陷状态下SHED发挥作用的机制，为未来临床组织工程做铺垫。讨论从SHED细胞于乳牙牙髓中被分离并鉴定为间充质干细胞起，乳牙牙髓组织就被视为一种有应用前景的干细胞来源。SHED或乳牙牙髓干细胞在体内体外实验中表达了向多种细胞分化的多能性，包括牙本质和骨形成细胞，内皮细胞，神经细胞，肌细胞。SHED或乳牙牙髓干细胞也被应用于大型动物的组织工程修复，包括骨缺损，肌肉萎缩，牙本质缺损模型，以及小型动物的骨缺损和脊柱损伤模型。最近的研究证明了SHED的体外免疫调节能力，并评估了该细胞在SLE鼠的免疫治疗效能。本文证实长期冻存的人乳牙牙髓组织也能用于SHED细胞相关的组织工程和免疫治疗。我们的研究显示长期冻存细胞在未来的转化医学和临床运用中有极大的潜能。出生后的干细胞在治疗各种疾病中有很大前景。大半个世纪以来，人干细胞在白血病，再生障碍性贫血和自身免疫性疾病的治疗中取得了了不起的成功。到目前为止，MSCs也在器官移植，骨骼重建，SLE等再生医学中发挥了作用。在MSC移植过程中，仍然存在安全性和质量的挑战，如细胞获取过程以及体外保存。传统的骨髓来源的干细胞会随着捐献者年龄的增加而显著降低细胞的数量和多能分化能力。骨髓移植也存在着对于捐献者的侵入性伤害。这些明显的缺点促使人们寻求更易获得且侵入性更小的方式，并在脂肪组织，脐带血，牙髓组织中找到了新的干细胞来源。虽然干细胞的分离过程比较复杂，但由于临床上具备可行的储存干细胞和干细胞入库的方法，所以以干细胞为基础的治疗方式得以具备优势，也减少了获取干细胞的工作人员数量。冻存干细胞的优势在于长期储存，治疗细胞剂量可调整和污染少，保证临床运用的安全和质量。在骨髓移植和干细胞移植中该项技术被广泛应用。因此，冻存干细胞和干细胞入库是干细胞相关治疗中可行的必不可少的方法。SHED被认为是再生医学中一种主要的有前景干细胞来源。脱落乳牙因为注定脱落且临床废用，因而是最易获得，侵入性最小的一种可行的干细胞来源。SHED在骨骼缺损和免疫疾病中治疗中疗效明显。但是SHED分离和储存仍有一些问题要解决。预测乳牙的脱落，并在获取脱落乳牙后维持目标组织的活性有待解决。另外，SHED的分离获取耗时耗力，复杂且需要专注的手术操作。最近发现从冻存的完整牙髓组织和第三磨牙牙周膜组织中复苏能得到的有功能的MSCs，这提示入库前最少步骤的处理已足够。复苏后的干细胞仍然在体外具备免疫调节能力。长期冻存后的乳牙干细胞也仍能维持干细胞特性和多向分化能力。我们目前的研究第一次证明脱落乳牙的人牙髓组织冻存两年后仍能复苏获得干细胞。复苏获得的SHED仍然保存很高的干细胞特性，包括自我更新，多项分化潜能，在体内进行牙本质和骨的再生和体外的免疫调节能力。除此之外，移植的冻存SHED在MRL/lpr小鼠中表现出免疫和骨缺损治疗效能，也在颅骨缺损的免疫缺陷小鼠表现出骨修复能力。这些数据表明长期冻存的牙髓组织是一项临床干细胞入库的无害和可行的方案，在免疫治疗，骨组织工程和再生医学中有巨大的优势。除此以外，现有的牙髓细胞库存系统能让小孩和家长将脱落的乳牙储存起来作为孩子成长过程中最宝贵的纪念品。目前的研究表明，复苏提取冻存的牙周膜干细胞和成人牙髓干细胞要比新鲜分离的干细胞差。但复苏冻存根尖乳头组织中的干细胞与新鲜提取的干细胞具有相似的生物和免疫调节活性。根尖乳头组织因为在发育阶段负责形成牙根，因此本身具有很强的生物组织活性。冻存的乳牙干细胞也能维持干细胞的特性和多向分化能力。目前的研究证明冷存乳牙牙髓细胞不影响SHED的生物和免疫性能。另外，SHED相比成人牙髓干细胞有展更高的细胞增殖能力，表明乳牙牙髓有更高的生物活性。冻存的乳牙牙髓，成人牙周膜和成人牙髓在复苏后的干细胞功能差异可能依赖于供者的年龄和冻存前供者组织的活性，进一步支持冻存乳牙牙髓组织的可行性。总结来讲，目前冻存人脱落乳牙牙髓组织不会影响SHED的生物、免疫、治疗性能。因此，因此，冻存乳牙牙髓组织不仅是临床上理想的库存方法，也能为干细胞为基础的免疫治疗和组织再生医学提供了足够数量的SHED。支持信息图S1脱落乳牙牙髓间充质干细胞的冻存和提取方法。乳牙牙髓干细胞在残冠上的部分（黄虚线框）被机械整体提取，储存在冰冻的基质中，在液氮中保存超过两年。冻存的组织于37度复苏，并且经过酶处理。冻存乳牙的SHED，以及新鲜的SHED使用CFU-F方法获得。图S2体内组织再生，SHED的自我更新的分析方法。冻存的SHED通过HA/TCP载体被皮下植入到免疫缺陷小鼠。移植后8周取出移植体。其中一部分用于组织学和免疫荧光分析。将细胞从移植体中分离做抗人CD146染色。CD146阳性细胞磁珠分选。细胞的纯度通过材料与方法中流式细胞分析确认。CD146阳性的细胞低浓度种在培养皿中获取CFU-F-形成细胞。形成的集落被扩增后再次植入给免疫缺陷小鼠。二次植入体后8周后获取，进行形态学分析。图S3 初级种植组织仅带有支架的图像（A） HE染色。（B-D）抗人类特异性线粒体抗体荧光染色，（B）抗STRO-1（C）人类CD146抗体（D）图S4 冻存SHED移植入MRL/lpr小鼠的方法冻存SHED通过尾静脉输入到16周大的MRL/lpr小鼠。小鼠饲养到死亡，用于存活度分析。20周大时，一部分小鼠处死以获取生物样本分析治疗效果。图S5全身输入冻存SHED改善了MRL/lpr小鼠血清免疫球蛋白的水平所有组别n=5. *P&0.05, **p&0.01, ***p&0.005, ns: 没有显著性差异。柱状图代表均值加减SD。MRL/lpr：无移植组。SHED新鲜：新鲜SHED移植组。SHED冻存：冻存SHED移植组。图S6:全身注射的冷藏SHED在MRL/lpr淋巴结和肾脏的定位SHED冻存组和新鲜组带有CFSE标记的图像，在淋巴结和肾脏上，检测于移植后的第一天和第七天。CFSE：CFSE图像。DAPI，DAPI图像。SHED新鲜，SHED新鲜回输组。SHED冷藏，SHED冻存回输组。&图S7全身注射的冻存SHED迁移到MRL/lpr小鼠的骨组织SHED冻存组和新鲜组带有CFSE标记的图像，在骨中，检测于移植后的第七天。CFSE：CFSE图像。DAPI，DAPI图像。SHED新鲜，SHED新鲜注射组。SHED冻存，SHED冻存组。图S8 免疫抑制鼠的头颅骨缺损植入冻存SHED的方法冻存SHED扩增和与HA/TCP的混合。去除颅骨，尤其是顶骨的部分（P）制造免疫抑制鼠的骨缺损模型。SHED和HA/TCP的混合物移植覆盖缺损区。移植的12周以后，获取样本并通过MICRO CT和免疫组化分析。表1抗体的清单表2RT-PCR的引物对图1 冻存SHED的克隆性，细胞增殖和细胞表面标记物的表达（A）冻存的脱落乳牙牙髓组织学，黑色箭头：血管，白色箭头：神经纤维。H&E染色（B）冻存乳牙牙髓中的干细胞标记物定位。黄色箭头，STRO-1阳性的细胞，黑色箭头：CD146阳性的细胞。BV：血管；Control: 亚型匹配的抗体染色（C-E）CFU-F分析（C）单个贴壁细胞形成克隆细胞群。(D) 冻存SHED贴壁后形成的克隆群。甲苯胺蓝染色（E）CFU-U数量的比较（F,G）细胞增殖量分析（F）BrdU阳性的染色 （G） 细胞增殖的比较（H，I）冻存SHED表面MSC标记物流式细胞分析。（H）代表性的流式图（I）STRO-1，CD146，CD73以及CD105的表达比较。黑色柱：冻存SHED。白色柱：新鲜SHED（J，K）胚胎干细胞和神经嵴干细胞的基因表达。（J）MW: 分子量标记物。(K) NANOG, OCT4,NESTIN,NOTCH1及LNGFR的比较（L）NESTIN在冻存SHED的流式分析。A，B：n=3；C-L：n=5；Bar: A: 30 B,C,F：5um BCF; D左：1mm ；D右和中： 25um。G，I，K：***p&0.005。ns：没有显著性差异。柱状图为均值加减SD图2 冻存SHED的多向分化性（A-C）: 成牙本质／成骨分化能力 （A）茜素红染色。（B） 碱性磷酸酶活性。(A,B)茜素红阳性区域和碱性磷酸酶活性的比较。(C) 成牙本质／成骨特意基因RUNX2,ALP,OCN和DSPP的表达比较（D）软骨分化能力。成软骨特异性基因SOX9，AGG以及X型胶原的表达比较（E，F）成脂分析。（E）油红O染色代表图及染色比较。(F)成脂特异性基因LPL 和PPARgamma2表达的比较（G）成肝脏分化能力。比较肝脏细胞特异基因ALB的表达（H）上皮细胞分化分析。比较上皮细胞标记物CD31和CD 34（I）神经细胞分化分析，比较神经细胞标记物NFM以及 betaIII。A-I：n=5。ns：没有显著性。柱状图为均值加减SD图3 冻存SHED的组织修复能力，自我更新能力，异源性及体外免疫调节能力（A-D）初次移植的冻存SHED组织。（A）HE染色。（B）比较新形成的矿化组织（C）抗人类线粒体荧光染色（D）抗stro-1/人CD146染色（E，F）初次植入体中分选的hCD146细胞纯度。（E）抗人／抗小鼠CD146流式分析。(F) 分选细胞形成的CFU-F免疫组化（G，H）体内自我更新分析。二次移植组织的图像。（G）HE染色。（H）抗人／抗小鼠CD146流式分析（I）PD分数比较 （J）比较端粒酶活性（K）冻存乳牙牙髓组织分离出的17个细胞克隆分析（L）冻存SHED在体外对人Th17细胞的直接免疫抑制作用。A-J,L: n=5. A,C,D,F,H: B:骨组织，BM:骨髓，CT,结缔组织，D：牙本质，DP：牙髓，HA：HA/TCP（I）HEK:HEK293细胞，H.I。HEK：加热失活的HEK，H.I.SHED-Cryo: 加热失活的冻存SHED。H.I.SHED-Fresh：加热失活的新鲜SHED。C，D，H，虚线区域：矿化组织。核用DAPI染色。B，H，I，L：****p&0.005, ns：没有显著性。柱状图为均值加减SD图4 全身给予冻存SHED改善MRL/lpr小鼠生命长度以及红斑狼疮样的疾病（A） Kaplan-Meier存活曲线（B）ELISA检测血清自身抗体ANA以及抗核抗体IgG以及IgM抗体（C）肾脏的病理组织。G：和虚线区域：肾小球。HE: HE染色。TC：Gomori 三色染色。PAS：过碘酸－希夫染色。C3：C3的免疫荧光染色（D）血清白蛋白，肌酐及尿补体核蛋白浓度。A：n=7，B-D：n=5。B,D: *p&0.005, **p&0.01, ***p&0.005. ns：没有显著性。柱状图为均值加减SD图5 冻存SHED移植能抑制MRL/lpr小鼠循环系统及局部Th17细胞的水平（A,B）流式细胞分析外周CD4+IL17+INFgamma-TH17细胞（C）血清IL17水平（D）全身回输的CFSE标记的冻存SHED及新鲜SHED细胞在回输后1天，2天或7天迁移到淋巴结及肾脏情况。虚线区域：肾小球（E） 淋巴结和肾脏中IL-17和IL-6 水平。A- E：n=5。B，C，E：*p&0.05, **p&0.01, ***p&0.005. ns：没有显著性. 柱状图为均值加减SD图6 移植冻存SHED减轻MRL/lpr小鼠的骨质疏松（A，B）胫骨的MicroCT分析。A：骨密度。B: 骨小梁参数，骨体积与组织体积的比值（BV/TV），骨小梁厚度（Tb,Th）,骨小梁的数量（Tb, N），伴随着增长的骨小梁分离程度（Tb, Sp）（C，D）胫骨的MicroCT与组织学骨小梁结构。C: MicroCT. D:HE染色（E，F）体内破骨细胞活性。E:TRAP染色. F:血清sRANKL及I 型胶原的c端肽CTX浓度（G）体外sRANKL诱导的破骨。TRAP＋：TRAP阳性破骨样细胞（H）体外成骨能力。4周诱导后茜素红阳性区域。 A-H：n=5。A，B，E，F：*p&0.05, ***p&0.005 (vs. MRL/lpr). G,H: *p&0.05, **p&0.01, ***p&0.005 (vs. BM-MRL/lpr), ns: 没有显著性。柱状图为均值加减SD图7 冻存SHED能修复免疫缺陷小鼠的临界骨缺损（A）小鼠颅骨的MicroCT图像. 左板：颅骨，中板：矢状面图像，右板：中板红色区域放大图（B）小鼠颅骨骨再生的组织学。左板，缺损的边缘（图7A的黄色框区域），HE染色。中间板：缺损中间部分（图7A的红色区域），HE染色。右板：荧光染色抗人CD146，DAPI染核。CB: 黄色虚线区域，颅骨。HA：HA/TCP。RB：再生骨。RBM:再生骨髓（C）骨缺损的再生骨区域（D）破骨细胞的分布。箭头：TRAP阳性细胞。TRAP染色。A－D：n=5。对照组：对照无缺损区域；CD：颅骨缺损区。CD+HA：HA/TCP移植组。CD+HA+SHED-Fresh：新鲜SHED移植组，CD+HA+SHED-cryo：冻存SHED移植组。C:***P&0.005, ns：没有显著性。柱状图为均值加减SD}