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猪防御素1基因毕赤酵母中的表达.pdf 55页
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猪防御素1基因毕赤酵母中的表达
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防御素(defensins)是生物体在抵御病原微生物的防御反应过程中产生的一类重要的抗菌 肽类物质。它具有十分广泛的抗菌谱，可以抵抗细菌、真菌、被膜病毒等多种微生物，尤其 是哺乳动物防御素除了对细菌、真菌、被膜病毒有毒杀作用外，还对支原体、衣原体、螺旋 体及一些恶性细胞有杀伤作用。由于其独特的抗菌机制，不会诱发细菌的耐药性，成为具有 巨大发展潜力的新型抗菌药物。
猪β防御素-1 (porcine β-defensin 1，PBD-1)是广泛分布于猪消化道、呼吸道、肝、肾等 多种组织细胞内的一类活性多肽，在猪防御系统中起重要作用，大量研究结果证明PBD-1 具 有独特的作用机制，病原菌不易对其产生耐药性。它可被用作食品保鲜剂和饲料添加剂，随 着对其研究的深入，可以相信猪防御素将在动物养殖、疾病预防和提高畜产品品质等方面发 挥更大作用。近年来，随着基因工程技术的发展，人们希望通过生物工程手段来大量生产防 御素。由于生物体内天然防御素的含量很低，且提取步骤繁琐，而化学合成法成本高，因此 用基因工程方法大量生产防御素无疑是最佳选择。本研究的目的就是在克隆猪舌上皮防御素 的基础上，根据毕赤酵母密码子偏好性设计并人工合成防御素成熟肽，并利用毕赤酵母表达 系统实现二者在体外的分泌表达，以期获得更高活性的防御素产品，为猪防御素的工程化生 产和畜牧养殖业奠定基础。
本实验以健康猪新鲜猪舌上皮粘膜为实验材料，以 GenBank
中报道的猪防御素PBD-1 的cDNA 序列及表达载体pPIC9
多克隆位点为基础设计引物，其中上游引物含有EcoR Ⅰ酶 切位点，下游引物含有Not Ⅰ酶切位点。采用RT-PCR 技术扩增出PBD-1 基因的cDNA 序列， 将其克隆到pGM-T 载体中进行序列测定。利用PCR 技术从含有PBD-1 基因的重组质粒中扩 增PBD-1 基因编码区，大小为151 bp，然后插入到分泌型表达载体pPIC9 的EcoR Ⅰ和Not
Ⅰ 位点，构建重组表达质粒pPIC9-PBD-1 ；又根据毕赤酵母偏好密码子设计并人工合成PBD-1M 基因，全长 159
bp。基因N 端引入α-信号肽kex2 和Ste13 裂解位点，以保证表达产物具有 天然N 端，两端引入Xho
Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点。将合成的目的基因片段克隆入表达载体pPIC9 中，构建重组表达载体pPIC9-PBD-1M 。用Bgl Ⅱ将pPIC9-PBD-1 和pPIC9-PBD-1M 线性化 后，采用电穿孔法转入毕赤酵母GS115
中进行表达。以重组酵母菌液为模板，经PCR 检测 约70%的转化子已正确整合入毕赤酵母染色体中。阳性克隆经摇瓶发酵和甲醇诱导，发酵上 清液经浓缩处理后进行Tricine-SDS分析，利用琼脂孔穴扩散法检测抑菌活性。结果表 明，防御素PBD-1 在毕赤酵母中得到表达，表达产物对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有 较好的抑菌活性。改造后基因抑菌效果更明显，从而进一步证实了密码子偏好性对其表达水 平的重要影响。 关键词 PBD-1 ；密码子优化；毕赤酵母；重组质粒；抑菌活性
Expression Of Porcine β-Defensin-1 Gene In
Pichia Pastoris
antimicrobial
the defense reaction. It possessed broad-spectrum antimicrobial, including many microorganisms like bacteria,
Especially
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酵母表达系统
真菌基因工程一、真菌表达系统的优缺点 二、酵母转化系统 三、酵母表达系统 四、丝状真菌表达系统三酵母表达系统酿酒酵母表达系统 甲醇酵母表达系统 其它酵母表达系统（一） 酿酒酵母表达系统酿酒酵母系统启动子 酿酒酵母分泌系统 酿酒酵母糖基化系统 酿酒酵母表达系统
存在的问题1、酿酒酵母启动子起始 位点 mRNA 40-120bp 20-40bp 100-1400bp 1、转录起始位点； 4、URS：上游阻遏序列 DAS 编码序列UASURSTATA2、TATA盒：富含AT；3、UAS：上游激活序列;5、DAS：下游激活序列酿酒酵母表达系统常用启动子1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH磷酸甘油激酶基因PKG乙醇脱氢酶基因ADH2）半乳糖激酶启动子（GAL1）半乳糖诱导、葡萄糖抑制GAL80GAL4UASGAL1GAL7GAL10A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控 B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差2）半乳糖激酶启动子（GAL1）半乳糖诱导、葡萄糖抑制GAL10 PromoterGAL80GAL4UASGAL1GAL7GAL10A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录3）pho4TS-PHO5启动子低温诱导、磷酸盐抑制 A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子C、pho4TS 温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭 D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达2、酿酒酵母分泌系统酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：性结合因子：MF-α酸性磷酸酯酶：PHO5蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL酿酒酵母信号肽特点*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用*信号肽结构：Met 信号肽剪切位点正电荷区 疏水区极性区目的蛋白MF-α信号肽*分泌效率高*在酵母系统具有通用性*88个残基组成Met KEX2 DAP DAP-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala目的蛋白 DAP：STE13编码的二肽酶3、酿酒酵母糖基化系统糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化酿酒酵母糖基化特点* 过糖基化（超糖基化修饰）：N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。*糖链组成O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团4、酿酒酵母表达系统的缺陷1）表达水平普遍不高A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp）B、所采用的强启动子调控不严谨C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵 2）分泌表达产物过糖基化（二） 甲醇酵母表达系统甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的优缺点 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 甲醇酵母表达系统的应用1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母（Pichia pastoris) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha) 假丝酵母（Candia boidinii)1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶 A、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%以上 B、名称和拷贝数不同 毕赤酵母/假丝酵母 汉森酵母 醇氧化酶 甲醇氧化酶 alcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOX AOX1、AOX2 MOX1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子AOX1与AOX2 *毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因 AOX1、AOX2 *AOX1与AOX2基因97%同源 *AOX1 占主导地位，负责AOX 99%以上活性1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导2、甲醇酵母表达系统的优缺点A、表达水平高（最高水平的系统） B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化 C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150 个甘露糖） D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统） E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。 F、实验室和工业操作简单 G、不能满足结构要求严格的糖基化3、甲醇酵母表达系统操作原理宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达甲醇酵母系统宿主二大宿主系统主要特点项目 最适温度 最适pH值 甘油阻遏 糖基化 高密度发酵 毕赤酵母 30℃ 4.5 是 部分过度 100g/L 汉森酵母 37℃ 4.5 否 较正常 100g/L甲醇酵母系统宿主二大宿主系统主要选择标记宿主 毕赤酵母 汉森酵母 选择标记 his4、G418、 Zeocin、Cu++ leu2、 his3 、ura3、 G418甲醇酵母系统宿主毕赤酵母系统主要宿主株宿主株 Y11430 GS115 KM71 SMD1168 特点 野生型、Mut+ his4- 、Mut+ his4-、 aox1::ARG4 (AOX1-)、Muts his4- 、胞外蛋白酶缺陷，高分泌MC1003his4-、AOX1-、AOX2-，甲醇不生长甲醇酵母系统的整合事件YRp型载体：汉森系统传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择 压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。YIp型载体：A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组B、有“插入”和“取代”二类整合模式C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合毕赤酵母系统模式表达载体1）AOX1位点插入宿主株:GS115、KM71 转化子： GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts可插入位点：5’AOX1 3’AOX1TT2）His4位点插入宿主株:GS115、KM71可插入位点： 5’His4转化子： GS115:His+Mut+KM71:His+Muts3’His43） 多基因插入事件（串联整合）宿主株:GS115、KM71可插入位点： 5’AOX13’AOX1TT转化子： GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts4） 基因取代（GS115，AOX1+）转化子：His4+Muts汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体高拷贝整合元件： A、高度重复序列：rDNA 提供多个整合位点 B、缺陷型标记基因：Leu2d提高选择压力C、抗性标记；neo 提高选择压力甲醇酵母系统胞内表达载体需要带入ATG表达载体类型单位点甲醇酵母系统胞内表达载体需要带入ATG多位点表达载体类型甲醇酵母系统分泌表达载体信号肽：PHO1甲醇酵母系统分泌表达载体信号肽：MFα甲醇酵母系统分泌表达载体信号肽：MFα 标记：Kan4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策载体稳定性 基因剂量整合位点甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性1）载体稳定性同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化： 选择―非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚2）基因剂量外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体3）整合位点外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点 的低4）甲醇利用表型在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达5）mRNA5’端mRNA5’端非翻译区（UTR）的组成与长度 应尽量与AOX1/MOX的一致应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构6）基因序列的AT含量 AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构7）分泌信号分泌表达效率与所用分泌信号高度相关可采用酿酒酵母来源的MFα、PHO或SUC等的信号 肽，或野生型信号肽，但适用性要比较分析。8）表达产物稳定性分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素降低培养基pH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制采用蛋白酶缺陷宿主株：如P.pastoris SMD1168您的位置： &
毕赤酵母中抗癌镇痛肽肺靶向融合体表达载体——穿梭质粒pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP的构建
优质期刊推荐& 酸性β-半乳糖苷酶基因密码子优化及高效表达
酸性β-半乳糖苷酶基因密码子优化及高效表达
摘 要：选用酵母偏好密码子,设计合成一种酸性β-半乳糖苷酶基因,并研究其在毕赤酵母中的高效表达。优化后,密码子适应指数（CAI）由原来的0.61提升到0.85。在基因的5＇端融合编码α信号肽序列,在3＇端融合
【题　名】酸性β-半乳糖苷酶基因密码子优化及高效表达
【作　者】冷春玲
【机　构】辽东学院农学院 辽宁丹东118003
【刊　名】《辽东学院学报：自然科学版》2012年 第3期 153-156页　共4页
【关键词】酸性β-半乳糖苷酶 密码子适应指数 毕赤酵母 分泌表达
【文　摘】选用酵母偏好密码子,设计合成一种酸性β-半乳糖苷酶基因,并研究其在毕赤酵母中的高效表达。优化后,密码子适应指数（CAI）由原来的0.61提升到0.85。在基因的5＇端融合编码α信号肽序列,在3＇端融合编码6个组氨酸标签序列,并在N端编码α信号肽和编码成熟酸性β半乳糖苷酶基因间分别引入编码kex2和Ste13裂解信号序列。基因克隆到pPICZα-A表达载体,构建成分泌型重组酵母表达载体pPICZα-β-Gal。在醇氧化酶（AOX1）启动子调控下,酸性β-半乳糖苷酶得到高效分泌表达,达到508 mg/L,比优化前提高3倍。重组酸性β-半乳糖苷酶具有天然的酸性β半乳糖苷酶相同的酶活性。
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酸性β-半乳糖苷酶,密码子适应指数,毕赤酵母,分泌表达
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