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硫化氢通过AMPK激活调控脑缺血后小胶质细胞的极化状态
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硫化氢通过AMPK激活调控脑缺血后小胶质细胞的极化状态
官方公共微信梓葛冻干粉针对体外氧糖剥夺/再灌注损伤大鼠大脑皮层星形胶质细胞的保护作用--《中国药学杂志》2016年13期
梓葛冻干粉针对体外氧糖剥夺/再灌注损伤大鼠大脑皮层星形胶质细胞的保护作用
【摘要】：目的探讨梓葛冻干粉针(C-P)对体外氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤大鼠大脑皮层星形胶质细胞的保护作用及可能的机制。方法原代分离培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞,神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光鉴定星形胶质细胞的纯度。实验分正常组、模型组、辅料组、C-P:12.25、24.50、49.00μg·m L-1组。对星形胶质细胞进行OGD 6h/R 12h损伤并同时给予C-P。噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率、比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡率。利用试剂盒的方法分别检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活性,谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的含量以及一氧化氮(NO)的释放量,ELISA法测定细胞培养液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和前列腺素(PG)E2的含量,Western blot检测细胞内caspase-3,诱导型一氧化氮合酶(i NOS),环氧酶(COX)-2,核因子(NF)-κB p65,p-NF-κB p65,IκB-α,p-IκB-α蛋白表达量。结果原代培养的星形胶质细胞纯度在97%以上。与正常组相比,模型组细胞存活率显著降低,LDH漏出率及细胞凋亡率明显增高;细胞内SOD活性和GSH含量明显降低,MDA和ROS含量显著升高;细胞培养液中NO、TNF-α、IL-1β和PGE2的释放量也显著增加。而以上相关生化指标均可被不同剂量的C-P所抑制。辅料组与模型组无显著差异。进一步研究发现,C-P能显著抑制OGD/R损伤引起的细胞中caspase-3、i NOS、COX-2蛋白表达量及NF-κB p65和IκB-α的磷酸化水平的增高。结论 C-P对体外OGD/R损伤的星形胶质细胞具有保护作用,其保护机制与其抗炎、抗氧化以及抑制细胞凋亡和NF-κB信号通路的激活有关。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R285.5【正文快照】：
脑卒中是一种严重威胁中老年生命健康的常见F12培养基和胎牛血(Gibco公司);iN OS,COX-2,NF-病,其中缺血性脑卒中占脑卒中发病率的87%[1]。κB p65多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司);目前,溶栓是美国食品药品监督管理局(FDA)唯一caspase-3,IκB-α多克隆抗体(沈阳万类生物
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京公网安备75号金属硫蛋白对氧糖剥夺再灌注诱导星形胶质细胞损伤的保护作用--《中国人民解放军军事医学科学院》2014年硕士论文
金属硫蛋白对氧糖剥夺再灌注诱导星形胶质细胞损伤的保护作用
【摘要】：金属硫蛋白（Metallothionein, MT）是一类富含半胱氨酸，分子量较低的金属结合蛋白，具有解毒重金属、调节必需金属自稳和抗氧化应激的功能。目前研究发现哺乳动物体内MT共有四种亚型，其中MT-1、 MT-II（MT-I/II）和MT-III是中枢神经系统中的主要异构形式。MT-I/II主要表达于星形胶质细胞，MT-III主要表达于神经元。近年来越来越多的研究表明MT-I/II在脑缺血等疾病中有重要的神经保护功能，但其具体作用靶位和机制均还不清楚。
目的：本课题应用MT-I/II基因敲除（MT-/-）小鼠和野生型（MT+/+）小鼠，分别建立原代培养的新生小鼠脑皮层星形胶质细胞模型，并通过细胞胞氧糖剥夺培养（Oxygen glucose deprivation, OGD）和再复糖复氧，即再灌注（Reperfusion,Rep）建立体外模拟缺血再灌注模型，旨在阐明MT-I/II对OGD/Rep诱导的星形胶质细胞损伤的作用并探讨其可能的作用机制；同时观察了MT-I/II在外源性化合物（白藜芦醇）介导的星形胶质细胞保护效应中的作用。
方法与结果：分别应用C57BL/OLA129MT+/+和MT-/-新生小鼠，建立脑皮层星形胶质细胞体外原代培养模型，并针对星形胶质细胞特异性蛋白（GFAP）应用免疫细胞化学法进行细胞纯度鉴定。结果表明，培养细胞纯度可达到90%以上，通过细胞形态学观察、细胞计数表明，MT+/+和MT-/-小鼠星形胶质细胞的生长、形态学等特征均基本相似，提示生理条件下MT-I/II基因敲除对星形胶质细胞结构和功能没有显著影响。对MT+/+和MT-/-小鼠星形胶质细胞分别进行氧糖剥夺再灌注实验，通过观察细胞形态变化，检测细胞存活率、细胞乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）漏出率及细胞凋亡率来评价MT对OGD/Rep所致星形胶质细胞毒性的影响。结果显示，OGD对星形胶质细胞有明显的细胞毒性，且Rep过程会加剧细胞损伤。形态学观察发现细胞发生皱缩、体积变小、核周空泡化及细胞死亡，细胞存活率下降，LDH漏出率和细胞凋亡率明显增加。且MT-/-小鼠星形胶质细胞的损伤程度明显高于MT+/+型细胞，该结果表明MT的缺失使星形胶质细胞对OGD/Rep引起的细胞损伤更为敏感，可见MT-I/II对OGD/Rep引起的星形胶质细胞损伤有一定的保护作用。
白藜芦醇是一种多酚类化合物，近年来研究表明白藜芦醇对脑缺血损伤具有明显的保护作用，并提示其作用机制与MT-I/II密切相关，但具体作用机制尚不清楚。为了进一步证实MT在白藜芦醇介导的抗脑缺血损伤中的作用，我们分别将白藜芦醇加入MT+/+和MT-/-小鼠星形胶质细胞模型，旨在阐明白藜芦醇是否通过调节MT来发挥其神经保护作用。MT+/+星形胶质细胞给予不同浓度的白藜芦醇（10nM、100nM、1μM、10μM）处理，经过OGD/Rep后观察其形态学改变，选取合适浓度（10μM）进行下一步研究。对MT+/+和MT-/-星形胶质细胞给予10μM白藜芦醇处理并进行OGD/Rep，在形态学观察上得出白藜芦醇有效改善了MT+/+细胞空泡化和死亡的发生。通过对LDH漏出率的测定及与未加入白藜芦醇组进行比较，在加入了保护性药物Res后，LDH漏出有一定的降低，且对MT+/+的作用更明显，尤其在Rep阶段（P0.05），明显降低了LDH漏出率，体现了Res的保护作用。
为检测细胞的氧化损伤程度，通过荧光探针标记法检测细胞OGD/Rep及给药处理后线粒体膜电位和细胞内ROS水平，结果显示，细胞在给予OGD/Rep处理后线粒体膜电位降低，ROS水平升高，即发生氧化损伤，且MT-/-细胞损伤程度较MT+/+细胞更严重；加入保护性药物白藜芦醇后，细胞的损伤有所改善，且对MT+/+细胞保护更明显。
氧化损伤产生的ROS最先由SOD转化清除，两种细胞再灌注不同时间（2h,6h,12h,24h）后，测定MT-I/II和重要抗氧化物Mn-SOD的mRNA表达水平。结果显示，对MT+/+细胞给予OGD/Rep处理后MT-I/II在Rep24h时MT-I/II表达都显著上升，表明星形胶质细胞中MT-I/II在Rep12-24h间表达上调并发挥作用。将MT+/+与MT-/-两种细胞再灌注过程SOD表达进行比较可得出，MT+/+细胞OGD/Rep处理后Mn-SOD mRNA也在Rep24h时表达突然上升，这与MT-I/II的表达变化时间一致。MT-/-细胞在发生OGD后SOD表达减少，在Rep6h时表达上调并随着Rep时间加长表达逐渐下降，这两种细胞SOD的表达有明显的差异性，MT-/-细胞可能由于缺失了MT这一重要抗氧化蛋白，在受到氧化应激时细胞通过调节SOD等抗氧化物表达来达到自身保护作用。加入保护性药物白藜芦醇，MT-I/II mRNA在Rep6h时两者都表达上调，跟未加白藜芦醇组相比（在Rep24h显著上升），MT上调的时间提前了18h。MT+/+星形胶质细胞在Rep6h时表达上升，与未加药组相比（上升时间点为Rep24h），SOD上调的时间提前了18h，且其趋势与MT表达变化相似； MT-/-细胞在OGD后SOD水平立即下降至极低，在Rep2h时恢复至正常水平，与未加药组相比（Rep6h表达升高），SOD上调的时间提前了4h。从这些结果可得出白藜芦醇能调节MT-I/II和SOD的表达来发挥保护作用，白藜芦醇对MT+/+细胞SOD的调节水平较MT-/-更明显，也提示了白藜芦醇调节MT-I/II可能是抗氧化应激作用的作用机制。
结论：综上所述，本课题应用MT-I/II基因敲除小鼠和野生型小鼠分别建立原代培养的新生小鼠脑皮层星形胶质细胞模型，并通过细胞胞氧糖剥夺培养和再复糖复氧建立了体外模拟缺血再灌注模型。应用这些模型证实了MT-I/II对OGD/Rep诱导的星形胶质细胞损伤具有明显的保护作用，提示其作用机制与保护细胞抗氧化酶MnSOD密切相关；同时证实白藜芦醇有可能通过调节MT-I/II的表达以发挥其抗脑缺血损伤作用。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：R114【目录】：
缩略词表4-6中文摘要6-9英文摘要9-12前言12-15材料与方法15-24实验结果24-40讨论40-43结论43-44参考文献44-47文献综述47-56 参考文献53-56个人简历56-57致谢57
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