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报告纸电泳和醋酸纤维.ppt 33页
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报告纸电泳和醋酸纤维
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(一)、纸电泳的原理、操作及其应用(二)、醋酸纤维薄膜电泳：原理特点应用：血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳电泳图谱异常及其原因注意事项纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳制作小组成员：（9~16号）李敏、周瑞、肖阳、王超、陆瑶、谭茹瑜、刘倩、刘忠志纸电泳纸电泳是根据电泳现象在渗透了缓冲液的滤纸加上电场使物质移动的电泳法。（也就是把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法。）常用以分离性质相似的物质，如各种氨基酸的分离和稀土元素的分离等。纸电泳原理纸电泳是利用纸作为支持物，使带电微粒在纸上电泳，从而达到分离的一种方法。将样品点在用缓冲液浸湿的滤纸上，将滤纸放在电泳槽的支架上，滤纸的两端浸在缓冲溶液里，接通电源，纸的两端就有一定的电压，吸引带电颗粒在纸上移动。氨基酸在其等电点时以兼性离子存在，若溶液的pH低于氨基酸的等电点（pH﹤pI），则氨基酸分子带有正电荷（Aa+），电泳时向负极移动；若溶液的pH高于等电点（pH﹥pI），氨基酸分子带有负电荷（Aa-）,电泳时向正极移动。电泳过程中，由于电极反应会使连接正极和负极的电解液的pH向相反方向变化，所以应用缓冲溶液以保持pH相对稳定。另外，选用挥发性的缓冲溶液较好，因为电泳后滤纸烘干时容易除去，以减少对显色的影响。纸电泳操作要点1、选择缓冲液对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响A:分离蛋白质，pI≈5，选pH8.6的缓冲液（巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4)B:分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸—醋酸，pH5.9C:分离核苷酸巴比妥－醋酸pH2.5，柠檬酸pH2~3D:分离糖类：HAC-NaAC,pH3~52、滤纸的选择与处理层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场强度。3、点样点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品）干法、湿法4、电泳电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间5、显色及分析蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红BAa：茚三酮、靛红核酸：紫外光下观察一般洗脱定量纸电泳的操作注意事项1．点样应在滤纸的一端距纸边２－１０cm处。样品可点成圆形或长条形，长条形的分离效果较好。点样量为５－１０微克和５－１０微升。点样方法有干点法和湿点法。（湿点法是在点样前将滤纸用缓冲液浸湿，样品液要求较浓，不亦多次点样。干点法是在点样后再用缓冲液和喷雾器将滤纸喷湿，点样时可用吹风机吹干后多次点样，因而可以用较稀的样品。）2．严禁空载，空载易造成电泳仪损坏，只有高级双稳（能控制电流强度和电压）电泳仪才提供空载保护。3．电泳完毕后，应先关闭电源，再拔小插头，以免触电。在仪器接通电源工作期间，严禁接触电泳槽电极、电极插头和电泳物等，严禁输出电极与地短路，以免破坏仪器。仪器不许空载运行，防止震动，使用环境应保持干燥，应无腐蚀性气体存在。纸电泳的应用纸电泳的设备简单，应用广泛，是最早使用的一种电泳技术。最初用于蛋白质，后来也用于氨基酸、核苷酸一些低分子物质，其优点在于或采用滤纸与色素结合的直接电泳图，或剪下滤纸的任何部分来抽提其中的物质。在早期的生物化学研究中，曾发挥重要作用。由于纸电泳时间长，分辨率较差，近年来逐渐为其他快速、简便、分辨率高的电泳技术所代替。一、醋酸纤维薄膜电泳原理醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物的电泳技术。醋酸纤维薄膜具有匀一的泡沫状结构（厚约120μm），渗透性强，对分子移动无阻力，用它做区带电泳的支持物，用样量少，分离清晰，无吸附作用，应用范围广和快速简便,且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。二、醋酸纤维薄膜电泳特点1、（1）醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。?　　（2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。?　　?　（3）灵敏度高，样品用量少。?血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至0.1μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。（4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。?　　（5）醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。?　　2、醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，操作简单，但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出5—6条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数1
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醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质缓冲液PH值
　来源：&&　　 |
【提问】以醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质时，常用缓冲液的PH值是（）。
麻烦老师讲解下。谢谢！！
【回答】学员tian100801，您好！您的问题答复如下：
以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条主要区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为&1-、&2-、&-及&-球蛋白。
祝您学习愉快！
祝您顺利通过考试！
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血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳几种缓冲液的效果分析
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醋酸纤维素薄膜电泳实验中为什么点样前应将膜上多余的缓冲液吸掉?
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点样时,应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去,以免引起样品扩散.这是我们老师给的答案
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防止缓冲液将待测液冲散。
扫描下载二维码醋酸纤维素薄膜电泳操作要点及常见差错和失败原因分析中国教育装备采购网围观997次我要分享我要投稿
　　醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。
种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5
μg 的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。
　　醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有以下优点：
　　(1)分离效果好。对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量测定的精确性。
　　(2)快速省时。由于亲水性较滤纸小，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45~60分钟即可，加上染色、脱色，整个电泳完成仅需90分钟左右。
　　(3)灵敏度高，样品用量少，血清蛋白电泳仅需2 μl 血清，故常用于检测在病理情况下微量异常蛋白质的改变。
　　(4)应用面广。某些蛋白质在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等用醋酸纤维素薄膜电泳能较好地分离。
　　(5)易保存，易定量。醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。
　　醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或透明液处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存。
　　1. 材料与试剂醋酸纤维素膜一般使用市售商品，常用的电泳缓冲液为pH8.6的巴比妥缓冲液，浓度在0.05~0.09 mol/L。
　　2. 操作要点
　　(1)膜的预处理：必须于电泳前将膜片浸泡于缓冲液，浸透后，取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液，不可吸得过干。并在一角做上记号。
　　(2)加样：样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋白质的常规电泳分析，每cm加样线不超过1 μl，相当于60~80
μg的蛋白质。
　　(3)电泳：可在室温下进行。电压为25 V/cm，电流为0.4~0.6 mA/cm宽。
　　(4)染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红，糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂，脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。
　　(5)脱色与透明：对水溶性染料最普遍应用的脱色剂是5%醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收扫描测定，可浸入冰醋酸：无水乙醇=30：70(V/V)的透明液中。
来源：上海创赛科学仪器有限公司作者：
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