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蛋白复性和纯化在线资料
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1. 包涵体表达的蛋白的复性 2. 重组蛋白纯化方法
组织细胞的破碎
目标蛋白的粗提
蛋白质沉淀方法
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good, good.
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5个&找不到服务器&
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rockrr 5个&找不到服务器&再试了一下,没有问题.都能顺利连接!应该是你那边网络的问题 :)
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包涵体的纯化和复性总结
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包涵体的纯化和复性总结14240
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包涵体的纯化和复性总结14240
官方公共微信《包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴》
包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴
包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴！zbbnet wrote:最近实验遇到了大麻烦，说出来大伙帮忙想想法。实验所用菌株为BL21，载体pMAL-p2X，与MBP融合表达，目的蛋白有三对二硫键。最初的设计思想是想通过MBP的信号肽实现可分泌表达，但实验发现主要是包涵体表达。 菌体超声破碎后12000rpm离心，所获得的沉淀不能很好的贴在离心管底，而是处于部分溶解状态，对沉淀再作如下处理：1、2M尿素洗涤，pH8.5，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀能够牢固的贴在管底。2、4M尿素洗涤，pH9.0，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀为半溶状态的冻状物。3、8M尿素溶解上述2中的沉淀，几乎不见不溶的颗粒，但溶液还是略显混浊。上述三溶液取样电泳，均见较多的目的蛋白。对3中的溶液取样调pH至12溶液依然混浊。0.22um过滤，无法去除混浊物。考虑到混浊物是多聚体，样品中加入1％SDS和0.2％β-Me，都无法改善。做上述处理，主要考虑到混浊物是目的蛋白，因为目的蛋白设计了6HIS但不能成功的结合Ni柱。主要想请教这样几个问题：1、有没有那位战友也碰上我上述的问题，这种问题是如何解决的？2、我所描述的包涵体的状态说明了什么问题？3、对与蛋白溶液混浊有什么好的处理方法？暂不讨论分泌表达的问题。回答：1. 你的情况很正常，根据三次沉淀处理情况，应该可以肯定你的蛋白在8MUrea中是完全可以裂解的。并且该蛋白如若作复性应该可溶性较佳。但根据我个人的经验。如果MBP融合蛋白还是以包含体表达的话是很没有意思的，建议作单独表达，除非单独表达不行。否则即使完全复性，目的蛋白活性也大打折扣。另可优化表达条件，有可能可容表达的，不要放弃，你的破菌上清也可以跑胶看看有没有目的蛋白。2. 说明蛋白蔬水性不强。3。有些蛋白裂解后有浑浊非常正常，尤其是MBP融合的，即使做到可容也会有白乎乎浑浊的现象，只要不影响使用就行，没必要在意。各位高手：我原来在25-27度表达出可溶性蛋白，现在23、25、27度均是包涵体。现在，急着纯化，用包涵体（GST融合蛋白）复性纯化可以吗？怎样做？怎样保持目的蛋白的活性？恳请赐教，先谢谢了！！！jingluo wrote:透析液总体积的50％？是不是在透析结束后往蛋白溶液里加甘油？不，是直接加在透析液里面。 wrote:不，是直接加在透析液里面。加这么多的甘油，我担心对PH的调配会不会有影响？lmj2005 wrote:各位高手：我原来在25-27度表达出可溶性蛋白，现在23、25、27度均是包涵体。现在，急着纯化，用包涵体（GST融合蛋白）复性纯化可以吗？怎样做？怎样保持目的蛋白的活性？恳请赐教，先谢谢了！！！你这个问题好难回答，牵涉的问题太多。建议你还是找找原因解决蛋白不可容表达的问题。因为如果你真的要做复性，那首先必须将GST融合蛋白复性好了，该蛋白才能挂柱纯化，但即使如此也不能保证你的目的蛋白能复性好。何况一般情况下复性效率都很低，不超过30%根据我的经验，如果蛋白GST融合后还包含体表达就一点意义都没有。所以还是回去解决可容性的问题，这样比把大量时间花在复性上有意义的多。jingluo wrote:加这么多的甘油，我担心对PH的调配会不会有影响？不要紧，加完甘油后再调PH值，没问题的，我们一直这么做，呵呵。 wrote:不要紧，加完甘油后再调PH值，没问题的，我们一直这么做，呵呵。好的，我明天试试。erwinchen wrote:你这个问题好难回答，牵涉的问题太多。建议你还是找找原因解决蛋白不可容表达的问题。因为如果你真的要做复性，那首先必须将GST融合蛋白复性好了，该蛋白才能挂柱纯化，但即使如此也不能保证你的目的蛋白能复性好。何况一般情况下复性效率都很低，不超过30%根据我的经验，如果蛋白GST融合后还包含体表达就一点意义都没有。所以还是回去解决可容性的问题，这样比把大量时间花在复性上有意义的多。谢谢了，那我就继续找可容性表达的办法了！请教大家我用PQE载体构建的重组体转化了BL-21，已诱导出目的蛋白。打算用该蛋白建立ELISA法检测人群中的抗体。下面打算纯化目的蛋白，已经购买了申能博彩的BBST NTA Resin按照说明书的变性条件下从包涵体中纯化His Tag蛋白质方法纯化蛋白。我的问题是根据我的试验目的，用该树脂纯化之后是否需要进行蛋白复性？复性的方法是否就是用不同浓度梯度的尿素进行透析？具体该如何操作？谢谢大家我看了下以前大家的回帖，怎么PMSF是用水溶的？我是用无水乙醇溶的，100X的工作浓度，应该不会对透析复性有影响吧。还有这个液体配了以后，4度长期保存会有质量影响吗？shanhaohao wrote:请教大家我用PQE载体构建的重组体转化了BL-21，已诱导出目的蛋白。打算用该蛋白建立ELISA法检测人群中的抗体。下面打算纯化目的蛋白，已经购买了申能博彩的BBST NTA Resin按照说明书的变性条件下从包涵体中纯化His Tag蛋白质方法纯化蛋白。我的问题是根据我的试验目的，用该树脂纯化之后是否需要进行蛋白复性？复性的方法是否就是用不同浓度梯度的尿素进行透析？具体该如何操作？谢谢大家首先说明一下，我没有用过你用的申能博彩的BBST NTA Resin，所以不太清楚，下面说说我的看法。我想无论用什么taq纯化，在纯化之前包含体总是要溶解的，溶解包含体就必须使用变性剂，所以纯化出来的可溶性蛋白也一定是变性的，所以原则上就必须要复性。但是实际上复性究竟效果怎么样没有人知道，我想绝对不会达到变性之前的结构。不建议使用尿素剃度，这个方法太麻烦了，几乎被淘汰了。可以使用不含尿素的TGE透析，方法较尿素剃度简化了很多，而且效果也很好。具体操作如下：TGE配法如下：50mM Tris0.5mM EDTA50mM Nacl5%或10％甘油如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。 调ph值7.9或8.0或其他，根据你的蛋白的等电点来确定，别离等电点太近，否则会出现大量沉淀，甚至目的蛋白全部沉掉，我最大ph用过9.0。直接将待透析样品装入处理过的透析袋中放入500mlTGE中放入4度冰箱即可。每7、8小时换一次透析液，总透析时间从24－48小时不等。以上仅供参考。jingluo wrote:我看了下以前大家的回帖，怎么PMSF是用水溶的？我是用无水乙醇溶的，100X的工作浓度，应该不会对透析复性有影响吧。还有这个液体配了以后，4度长期保存会有质量影响吗？PMSF：1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；2）10mg/ml溶于异丙醇中；3）在室温下可保存一年；4）工作浓度：17-174ug/ml（0.1-1.0mmol/L）5）在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。转自汪家政－蛋白质技术手册非常感谢！但是我还是有点不太明白。根据该产品的说明书样品制备好之后进行层析，步骤如下2．层析1）将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗。2）将样品（步骤2）加到NTA层析柱中，流速控制在15 ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。3）层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/h左右。4）分别用5倍NTA体积的NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000 Buffer洗脱，流速控制在15ml/h左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。5）确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用BBST的Bradford蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS-PAGE分析蛋白质的分布。6）目标蛋白质是否需要进一步纯化应根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。附溶液配方：GuNTA-0 Buffer:20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,8M 尿素NTA-20 Buffer:20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 20Mm ImidazoleNTA-40 Buffer:20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 40Mm ImidazoleNTA-60 Buffer:20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 60Mm ImidazoleNTA-100 Buffer:20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 100Mm ImidazoleNTA-500 Buffer:20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 500Mm Imidazole因为洗脱液中有尿素，Tris-HCL, NaCl等盐类，用您所说的TGE透析，可以将它们除去吗？谢谢。shanhaohao wrote:非常感谢！但是我还是有点不太明白。根据该产品的说明书样品制备好之后进行层析，步骤如下2．层析1）将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗。2）将样品（步骤2）加到NTA层析柱中，流速控制在15 ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。3）层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/h左右。4）分别用5倍NTA体积的NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000 Buffer洗脱，流速控制在15ml/h左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。5）确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用BBST的Bradford蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS-PAGE分析蛋白质的分布。6）目标蛋白质是否需要进一步纯化应根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。附溶液配方：GuNTA-0 Buffer:20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,8M 尿素NTA-20 Buffer:20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 20Mm ImidazoleNTA-40 Buffer:20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 40Mm ImidazoleNTA-60 Buffer:20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 60Mm ImidazoleNTA-100 Buffer:20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 100Mm ImidazoleNTA-500 Buffer:20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 500Mm Imidazole因为洗脱液中有尿素，Tris-HCL, NaCl等盐类，用您所说的TGE透析，可以将它们除去吗？谢谢。可以。很多纯化柱都是根据咪唑梯度来洗的，我的也是，里面也有尿素，透析后不能完全除去，只是能上百倍的稀释。因为尿素和咪唑都属于小分子物质，可以自由进出透析带，根据这个将其稀释掉。非常感谢！打算用您的方法试试，这样就可以大大的减轻工作量了。还有想问一下，介绍这些蛋白质纯化方法包括透析有哪些书或资料可以参考？因为我们实验室以前没人做过这些，我想再仔细研究研究。谢谢非常感谢！打算用您的方法试试，这样就可以大大的减轻工作量了。还有想问一下，介绍这些蛋白质纯化方法包括透析有哪些书或资料可以参考？因为我们实验室以前没人做过这些，我想再仔细研究研究。谢谢昨天做了添加50％甘油的透析工作，遇到两个问题。1、电泳有明显的拖带2、透析后发觉样品液体量减少很明显，估计这也应该是影响带型的原因吧。希望帮忙解答下。shanhaohao wrote:非常感谢！打算用您的方法试试，这样就可以大大的减轻工作量了。还有想问一下，介绍这些蛋白质纯化方法包括透析有哪些书或资料可以参考？因为我们实验室以前没人做过这些，我想再仔细研究研究。谢谢这个不好说了，我是在一本叫做从纯化到星辰的书上面看到的。你在里面搜吧，很多东西，很多方法。jingluo wrote:昨天做了添加50％甘油的透析工作，遇到两个问题。1、电泳有明显的拖带2、透析后发觉样品液体量减少很明显，估计这也应该是影响带型的原因吧。希望帮忙解答下。能否发张图来看看拖带到底多明显？你的意思好像是甘油导致了拖带是吗？那不可能，甘油绝对不会导致拖带的，肯定是其他原因，但是我不知道，建议你去SDS讨论帖问一下。样品有点减少是正常的，我每次做都是减少40%左右，你的又是大概减少了多少呢？透析带绑紧没有？？多谢我预备用包涵体免疫小鼠,一共有三个方案:1:包涵体(未溶解)直接免疫2.用尿素溶解后跑胶然后切胶免疫3.将溶解后的包涵体复性再免疫.问1:这样的方案是否可行.问2:方案1中:洗涤并离心后的包涵体沉淀.我打算,用PBS先把沉淀充分悬浮,然后也佐剂混合,来免疫小鼠.不知道这样做可不可以?想知道各位老师是怎样做的.盼复木木溪 wrote:我预备用包涵体免疫小鼠,一共有三个方案:1:包涵体(未溶解)直接免疫2.用尿素溶解后跑胶然后切胶免疫3.将溶解后的包涵体复性再免疫.问1:这样的方案是否可行.问2:方案1中:洗涤并离心后的包涵体沉淀.我打算,用PBS先把沉淀充分悬浮,然后也佐剂混合,来免疫小鼠.不知道这样做可不可以?想知道各位老师是怎样做的.盼复回1：可行。我是做过你的方案1和3，没有做过切胶免疫，老板不让。而是做的包涵体直接/neWs/FF61D6E.html溶解后没有复性的蛋白去免疫小鼠。回2：可以。但是要注意量的问题，因为包涵体里面的蛋白浓度是很大的。如果免疫剂量太大的话，可能对动物产生影响，如发热等。但是对于效价有无影响我不知道。感谢老师,还有问题请教各位老师:我溶解包涵体的溶液:我的包涵体是在含8mol/L尿素的缓冲液A（50mmol/LTris-HCI；50mmo/L NaCl; 0.5mmol/LEDTA;甘油5%）溶解的。我的溶解蛋白是在加有1％的甘氨酸的2000ml缓冲液A（50mmol/LTris-HCI；50mmo/L NaCl; 0.5mmol/LEDTA;甘油5%,ph值7.0）中进行透析复性的。问题1：我现在还不知道这样做复性是否成功。所以请问；这样的溶解液和 这样的复性液是否是正确的搭配？有更好的搭配吗？问题2：若按照我上一帖提出的方案二“将溶解后的包涵体跑SDS-PAGE胶做切胶免疫”,在跑胶前是否有必要把溶解的包涵体也透析一下(降低尿素的浓度)?问题3：若按照我上一帖提出的方案三“复性的包涵体免疫”，在我用的这样的缓冲液内透析复性，是不是只要调好PH值保证我的蛋白样品不沉淀，就可以把透析复性袋中的蛋白溶液直接混合佐剂免疫老鼠了？谢谢，请指教。木木溪 wrote:感谢老师,还有问题请教各位老师:我溶解包涵体的溶液:我的包涵体是在含8mol/L尿素的缓冲液A（50mmol/LTris-HCI；50mmo/L NaCl; 0.5mmol/LEDTA;甘油5%）溶解的。我的溶解蛋白是在加有1％的甘氨酸的2000ml缓冲液A（50mmol/LTris-HCI；50mmo/L NaCl; 0.5mmol/LEDTA;甘油5%,ph值7.0）中进行透析复性的。问题1：我现在还不知道这样做复性是否成功。所以请问；这样的溶解液和 这样的复性液是否是正确的搭配？有更好的搭配吗？问题2：若按照我上一帖提出的方案二“将溶解后的包涵体跑SDS-PAGE胶做切胶免疫”,在跑胶前是否有必要把溶解的包涵体也透析一下(降低尿素的浓度)?问题3：若按照我上一帖提出的方案三“复性的包涵体免疫”，在我用的这样的缓冲液内透析复性，是不是只要调好PH值保证我的蛋白样品不沉淀，就可以把透析复性袋中的蛋白溶液直接混合佐剂免疫老鼠了？谢谢，请指教。我的8M的尿素配方是这样的：urea：8MNacl：0.5MNa2po4：20mMnah2po4 ：20mM调PH值至7.4我的透析体系是这样的:50mM Tris0.5mM EDTA50mM Nacl5%或10％甘油如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽。不知道你的包涵体溶解后还要不要纯化了，如果是的话，我觉得里面那个edta可能不太好，因为它可以影响蛋白与镍柱的结合。复性跑胶后蛋白依然是变性的，所以切胶只能是切胶后复性或是不复性了。透析前是要确定你的目的蛋白的等电点然后决定透析液的ph，以尽量避免目的蛋白发生沉淀。我之前就是用切胶纯化的包涵体蛋白以及尿素溶着的包涵体免疫的小鼠，3免完了7天采血作ELISA（用切胶回收的蛋白包被的板子，血清只做到了1：80的稀释 ），测值后发现，只打了纯佐剂的小鼠 和免疫（蛋白加佐剂）小鼠 ，OD值竟然差不多，平均都在2.7以上，什么都没免疫的小鼠血清OD值也在1.2左右。请问各位，是不是我的ELISA作的有问题，还是血清稀释度不够，佐剂免疫小鼠的血清 怎么会和我切胶回收的包涵体蛋白结合呢？我现在觉得做了 1个多月的免疫好像又失败了，真的好痛苦啊，请大家帮忙分析一下吧~~ps:虽然此帖不属于纯化复性，但是因为楼主说做过包涵体免疫，所以就把帖子发在这里了。先谢谢了~little83 wrote:我之前就是用切胶纯化的包涵体蛋白以及尿素溶着的包涵体免疫的小鼠，3免完了7天采血作ELISA（用切胶回收的蛋白包被的板子，血清只做到了1：80的稀释 ），测值后发现，只打了纯佐剂的小鼠 和免疫（蛋白加佐剂）小鼠 ，OD值竟然差不多，平均都在2.7以上，什么都没免疫的小鼠血清OD值也在1.2左右。请问各位，是不是我的ELISA作的有问题，还是血清稀释度不够，佐剂免疫小鼠的血清 怎么会和我切胶回收的包涵体蛋白结合呢？我现在觉得做了 1个多月的免疫好像又失败了，真的好痛苦啊，请大家帮忙分析一下吧~~ps:虽然此帖不属于纯化复性，但是因为楼主说做过包涵体免疫，所以就把帖子发在这里了。先谢谢了~你这个问题我思考了很久，但是没有得出答案。我想问一下你的蛋白是什么？因为我能想出的唯一的可能性就是因为完全佐剂加有灭活的分枝杆菌(如卡介苗)或棒状杆菌，会不会跟你的蛋白结合呢？其余的原因我真的想不出，理论上是不可能的，再有就是交叉污染了。不好意思。1. 什么都没免疫的小鼠血清OD值也在1.2左右， 光从这点就可以看出你的ELISA是有问题的，本底太高。先解决你这个检测手段的问题。2。只打了纯佐剂的小鼠 和免疫（蛋白加佐剂）小鼠 ，OD值竟然差不多。从这点又可以看出，你的免疫是完全失败的。你应该从根本入手，解决你的蛋白的活性问题。基于你已作过切胶纯化的包涵体蛋白以及尿素溶着的包涵体免疫的实验（我一直对这种方法保留意见）。那么不妨尝试一下复性后免疫。祝顺利。请教一下：我现在用的是大肠杆菌表达体系，理论上应该得到RNaseA的包涵体，我现在应该用什么方式得到包涵体的粗提物呢？超声波还是溶菌酶？另外，经过洗涤得到的沉淀能否进行电泳分析？如果可以的话，用什么溶液进行溶解呢？谢谢请教：如果用您介绍的透析体系（50mM Tris，0.5mM EDTA，50mM Nacl，5%或10％甘油）透析，但我还想将蛋白浓缩，有什么简单的办法？我试用了millipore的超滤柱，但离心时间要很长（可能是甘油的原因）。另外，我提纯蛋白的PI一个是5.48， 一个是6.68，透析液的ph最好调整到多少？我提纯的蛋白也是用来作抗原供检测用。meinkaffee wrote:请教一下：我现在用的是大肠杆菌表达体系，理论上应该得到RNaseA的包涵体，我现在应该用什么方式得到包涵体的粗提物呢？超声波还是溶菌酶？另外，经过洗涤得到的沉淀能否进行电泳分析？如果可以的话，用什么溶液进行溶解呢？谢谢用什么方式得到包涵体的粗提物：反复冻融加超声破菌经过洗涤得到的沉淀能否进行电泳分析：是的用什么溶液进行溶解呢：8M尿素见PM。pigvet wrote:请教：如果用您介绍的透析体系（50mM Tris，0.5mM EDTA，50mM Nacl，5%或10％甘油）透析，但我还想将蛋白浓缩，有什么简单的办法？我试用了millipore的超滤柱，但离心时间要很长（可能是甘油的原因）。另外，我提纯蛋白的PI一个是5.48， 一个是6.68，透析液的ph最好调整到多少？我提纯的蛋白也是用来作抗原供检测用。ph值可以调成8.0和8.5两种，然后都透析看效果。我一直使用的浓缩方法就是PEG包埋，简单实用。 wrote:麻烦问一下，有没有详细一点的方法谢谢用什么方式得到包涵体的粗提物：反复冻融加超声破菌经过洗涤得到的沉淀能否进行电泳分析：是的用什么溶液进行溶解呢：8M尿素见PM。用什么方式得到包涵体的粗提物：收集湿菌体后，按每克湿菌体加入8mlPBS重悬湿菌体，然后反复冻融（-80度/40min，37度/10min）。反复冻融三四次后，进行超声裂菌，不同的表达体系超声强度不同，我的是PQE30/BL21， 超声强度，每100ml 离心后得到的菌体进行300w/150次。超声结束后分别用洗涤液1和2进行洗涤（洗涤液配方在本帖前面可以找得到）。之后用8M的尿素4度溶解过夜（8M尿素配方见本贴前面）。然后离心后取上清。各段得到的样品都要跑胶以确定蛋白的存在形式。 wrote:ph值可以调成8.0和8.5两种，然后都透析看效果。我一直使用的浓缩方法就是PEG包埋，简单实用。谢谢!请教各位战友,我想在NI柱上进行蛋白复性,想用尿素浓度渐低的方法.最后是尿素浓度为0,再用咪唑把蛋白洗下来.但是听前面 战友说Elution buffer中没有加入尿素,蛋白质洗不下来(不知道理解错误没) ,那么这种在的Elution buffer还是必须加尿素,这样是不是蛋白又变性了? 那么这种方法可以用于蛋白复性吗?是不是或者最后在Elution buffer加入比较低的尿素也行.谢谢各位!本文由()首发，转载请保留网址和出处！
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