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pcr反应体系中引物浓度20uM指的是什么,还有20微升体系怎么换算成50微升体系呢,
萌小殇10563
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20uM引物浓度指得是引物working solution的浓度.也就是说,当你从装有引物的管内,吸取一定量,加入到PCR master mix配成反应混合液的时候,这个引物管内的浓度是20uM.如果1ul的这个浓度引物加入到50ul反应中,引物终浓度将是0.4uM. 实际反应体系中的引物最终浓度最常见是0.5uM,也可在0.1-0.5uM之间选取.20ul体系换算成50ul体系,最简单就是每种要加的试剂或水体积分别乘2.5, 浓度不变即可.
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20uM指的的引物的摩尔浓度！一般情况下我们实验室50微升的体系加水42,DNTP1微升，buffer10微升（10*），上游Fp1微升，下游1微升，酶1微升。效果不错
哦，那想问下上下游引物的浓度是多少呢
M就是mol/L
其实一般20和50ul体系的区别只是mix和水的量不同
引物和模板加入量一样都可以
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【求助】PCR反应体系改变
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这个帖子发布于8年零69天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教各位，我摸PCR条件是用10微升体系的，现在变成50微升，即各成分均增加5倍，电泳有时候有条带，有时候没有，而且没有的时候比较多，不知道要怎么办？是不是50微升的体系分成5管，每管10微升，pcr后再把5管合成一管，这样行不行？多谢啦。。
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10微升体系条件好，50微升不见得一定好，我的体系20微升比较稳定，可是当我准备大量扩时，50微升体系则差些，后来在原来的基础上稍做改动，效果还可以，你也可以试一试，如果实在不愿意摸索，当然也可以像你说的，10微升体系多扩几管，可能会损失多些
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原来的条件就摸索了很久，再摸要崩溃了，还是多扩几管算了，谢谢啊。。。
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可能是加热块或者管子的问题哦：1. 50ul加好后放进PCR仪里，看看是不是完全看不到液体？液体如果高出金属块加热效率应该好不了2.如果用相同的PCR管，10ul相对于50ul而言蒸发会更多，所以10ul反应体系真实浓度应该更高，因此建议50ul反应体系适当调高某些组分的浓度。3. 楼主要干么？要那么多PCR产物啊？如果PCR反应特异性够好，适当增加10个循环PCR终产物的量会增加一些的，这样和增加反应管的量效果差不多。4.其实 还是多扩几管最简单。楼主遇到的可能和工程学的放大过程差不多，有太多不可控因素在里面了。
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我pcr产物测序，公司说最少35微升，加上拿出5微升跑电泳验证有没有产物，所以要求量比较多。我而且已经45个循环了，如果再加10个循环还行吗？
很奇怪的，我之前做的也是有时候有产物，有时候没产物。。真是郁闷啊。
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我以前也碰到过类似的情况，最可能的原因是Taq酶的质量不好，须更换Taq酶，用热启动酶进行实验，这样条带一定会很稳定的出来，如您需要热启动酶的话，请与我联系，我可以给你一些试用，一定会做出很亮的条带，我的联系方式：。
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你给我的酶条带出不来啊。。
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你模板加太多了，加少点，2倍左右就够了
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那你用我们给你的PCR MIX做吧，但一定要保证引物和模板没有问题？如果再不行的话，那一定是某个东西出现了问题，或是引物或是模板，实在不行的话可能要重新设计引物和重提模板了。
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加点mg可能会有惊奇的发现
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楼主的做法不是很正确。不是体系大了，相应的各个组分就要随比例增加的。根据我的感觉，模板适当减少一点，体系也不要用那么大，做两个25ul的体系就好，比较容易控制，也能满足要求。常用的扩增体系也是20ul-25ul。50ul的体系，使用的ep管肯定和你10ul体系用的不一样，所以在pcr过程中肯定会出现各种不可预知的问题，而且体系太大，扩增效果自然会变差。扩增周期的问题，都已经45了，再加也没有什么意义了。
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谢谢各位好心人的指导啊，呵呵。我现在重新提取了一批DNA，浓度比以前低，用原来的条件就做不出来了，PCR的时候DNA模板提高了2倍3倍都做不出来了，是不是退火温度也要重新摸？我以前就很奇怪，摸条件的时候退火35秒，延伸35秒可以做出来，退火30秒，延伸30秒就做不出来，是不是巧合还是要求真的这么严格啊？
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wfyh41560 加点mg可能会有惊奇的发现加镁离子？buffer里就有啊，这个怎么调整啊？？太深奥了吧？
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那还是用PCR MIX做试试吧，PCR MIX中所有的组份都是优化好的，只要你设计的引物和提取的模板没有问题，就一定会得出结果。
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我也遇到与楼主类似的问题，两种细胞的RNA，做反转录PCR，同样的体系和酶，就引物和模板不一样，其中一个基本比较稳定，每次都能扩出来；而另一个模板就总是一会扩出来，一会扩不出来的情况。所以，是不是可以排除机器和酶的问题。是跟目的基因的丰度低有关系吗？请高手不吝赐教！
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【求助】：PCR反应体系的配置
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这个帖子发布于11年零231天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
PCR反应体系应该如何配置？各成分的浓度应该是多少呢？是否反应体系体积增加，各成分的量也相应扩大？各成分的浓度对最终反应产物又会产生怎样的影响呢？我们配置的时候应该注意哪些问题呢？请前辈多多指导，感谢不尽！
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其实你仔细搜一下本版就可以找到这些问题的答案,这里帮你一次把,下次要自己找的PCR常见问题总汇PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。　　Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。　　物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。　　靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。　　引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。 克隆PCR产物1)克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生&20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生&20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞 PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：　　　　　　 10×扩增缓冲液 　 10ul　　　　　　 4种dNTP混合物 　 各200umol/L　　　　　　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　　　　　　　 模板DNA 　　　 　0.1～2ug　　 　　　　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　　　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　　　　 加双或三蒸水至 　100ul　　PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+　　引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。　　酶及其浓度　目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。　　Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。　　PCR反应条件的选择　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。　　温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子　　　　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
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