解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭小鼠肝细胞FLIP蛋白表达影响的研究--《陕西中医》2010年01期
解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭小鼠肝细胞FLIP蛋白表达影响的研究
【摘要】：目的:探讨解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭小鼠肝细胞凋亡及凋亡抑制蛋白FLIP的影响,进而揭示其治疗肝衰竭的分子机制。方法:将昆明小鼠随机分为空白组、模型组、解毒化瘀颗粒组、安宫牛黄丸组、乳果糖组,用D-GalN+LPS腹腔注射构建急性肝衰竭的小鼠模型,观察各组小鼠存活率;HE染色法和TUNEL法观察肝组织的病理变化及检测肝细胞凋亡情况;免疫组化法检测FLIP蛋白在肝组织中表达。结果:成模后48h存活率解毒化瘀颗粒组高于其他药物组;肝组织HE染色镜下所见的坏死细胞以点状坏死为主,程度比模型组及其它药物干预组轻微;TUNEL法检测结果显示:解毒化瘀颗粒组肝细胞凋亡指数明显减少,与其余药物干预组及模型组比较有显著性差异(P0.01或P0.05);免疫组织化学染色结果显示:凋亡抑制蛋白FLIP在解毒化瘀颗粒组肝组织中表达量明显升高,而在其他药物干预组及模型组中则呈低表达(P0.01或P0.05)。结论:解毒化瘀颗粒能上调内毒素肝衰竭模型肝细胞浆中FLIP的表达,并发挥抑制凋亡效应。提示阻断FADD凋亡信号传递,有可能是解毒化瘀颗粒防治急性肝衰竭的机制之一。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R285.5【正文快照】：
急性肝衰竭病情重、预后差,其发病机制目前尚不十分清楚。临床上虽有肝移植和人工肝等各种治疗措施,但病死率仍高达70%[1]。近年来研究发现,肝细胞凋亡是肝衰竭的重要发病机制之一,细胞发生凋亡的中心环节是激发了以蛋白酶组成的级联反应,其中胞浆信号分子FADD是最重要的凋亡
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京公网安备75号肝脏自然杀伤细胞在病毒诱导的肝衰竭中的作用--《华中科技大学》2009年博士论文
肝脏自然杀伤细胞在病毒诱导的肝衰竭中的作用
【摘要】：
【研究背景及目的】
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染在发展中国家和亚太地区的流行情况非常严重，我国亦是HBV感染高发地区，人群携带率约10％，由HBV引起的暴发性肝衰竭(fulminant hepatic failure，FHF)和慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liverfailure，ACLF)，其病情凶险，死亡率高达80％～90％，临床上缺乏特异而有效的治疗靶点和干预手段，除非实施肝移植，绝大部分患者预后不良。病毒诱导的肝衰竭的发病机制十分复杂，近年来我们对Ⅲ型鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus strain 3，MHV-3)诱导的小鼠暴发型肝衰竭和HBV诱导的慢加急性肝衰竭(HBV-inducedacute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)进行研究中证实，纤维蛋白原样蛋白2／纤维介素(fibrinogen like protein 2／fibroleukin，fgl2)与肝衰竭的发生发展密切相关。宿主免疫应答产生的大量炎症介质fgl2凝血酶原酶是引起肝脏微循环障碍和导致肝细胞缺氧性损伤和大量坏死的重要原因。然而病毒诱导的小鼠和人类肝衰竭发生发展中另一个显著的病理特征—炎症细胞在肝脏的聚集也需引起重视。炎症细胞的大量聚集一方面可分泌大量的炎症介质，引起肝内微环境的恶化，另一方面可直接导致肝细胞凋亡和坏死。因此明确各种免疫细胞在肝细胞损伤中的作用及其相互网络调节机制将有助于更加全面的认识病毒诱导的肝衰竭的发病机制，亦将为后续疾病的治疗及相关药物的研发提供重要的靶点。
一直以来，病毒性肝炎免疫学发病机制的研究重点大多集中在获得性免疫阶段，大量资料也显示HBV病毒本身不造成肝细胞的细胞病变，宿主对病毒的免疫反应在乙型肝炎的发病机理中扮演着关键角色，尤其是HBV编码蛋白特异性杀伤特异性T淋巴细胞(CTL)对于乙型肝炎病毒的清除和疾病的转归具有决定性作用，然而固有免疫系统在病毒性肝炎中的作用仍然不十分明确。自然杀伤细胞(NK)，自然杀伤细胞T细胞(NK T)作为肝脏固有免疫的核心细胞其在病毒性肝炎中的作用已受到国内外学者的广泛关注。众多的研究数据表明NK细胞在抵御病毒入侵，抑制病毒复制以及免疫介导的肝细胞损伤方面发挥着重要作用。已经证实，人体肝脏含有大量的天然免疫细胞如NK细胞、NK T细胞、γδT细胞等，此类细胞约占整个肝脏淋巴细胞的2／3。其中NK细胞约占30％，NKT细胞也近30％，而传统T细胞亚群(CD3~+CD56~-)仅占30％左右。固有免疫细胞在肝脏形成的这种“优势状态”可能也预示着其在肝脏免疫系统中的重要作用。
众多的证据表明肝脏NK细胞可以介导肝细胞损伤。在多聚胞嘧啶核苷酸(Polyinosinic：polycytidylic acid，poly I：C)诱导的小鼠肝损伤中，肝脏NK细胞可以通过TRAIL／TRAILR途径杀伤肝细胞。肝脏NK细胞在Poly I：C诱导HBV转基因小鼠肝脏敏感损伤中发挥着决定性作用，而且在低剂量刀豆蛋白(Concanavalin A，Con A)诱导的HBV转基因小鼠肝细胞损伤实验中也发现，肝脏NK细胞利用其表面活化受体NKG2D识别肝细胞表面相应配体而导致肝细胞损伤。上述发现有助于我们理解暴发性肝衰竭的免疫学发病机制，但这些肝损伤模型大多由化学物质所介导，或者缺乏自然感染和复制的过程。因此为了进一步深入研究肝脏NK细胞在病毒诱导的暴发性肝衰竭中的作用机制，我们建立了MHV-3诱导的小鼠暴发性肝衰竭模型，在疾病进程中对肝脏NK细胞迁移及损伤肝细胞的机制进行了深入研究，并在HBV诱导的慢加急性肝衰竭中对NK细胞在其中的作用进行了初步探讨。
具体研究目标如下：
1．建立小鼠暴发性肝炎模型
①在疾病进程中动态观察肝脏NK细胞比例、数量、活性以及分泌主要细胞因子水平的变化。
②研究肝脏NK细胞对病毒感染肝细胞的杀伤作用。
③研究肝脏NK细胞损伤肝细胞的分子作用机制。
④研究NK细胞在小鼠暴发性肝炎中迁移的分子机制。
2．在人类研究中，以HBV诱导的慢加急性肝衰竭病人和慢性乙肝病人为研究对象，通过比较两组病人肝组织中NK细胞的频率，以及外周血NK细胞天然细胞毒受体的表达频率，探讨了NK细胞在HBV诱导的慢加急惟肝衰竭中的作用。
【研究方法】
1．采用MHV-3腹腔途径感染Balb／cJ小鼠建立暴发性肝衰竭模型，在疾病进程中对小鼠肝组织行HE染色观察肝脏病理改变，并检测血清ALT和AST水平。
2．流式细胞术检测MHV-3感染0、24、48、72 h后的Balb／cJ小鼠肝脏、脾脏、外周血和骨髓中NK细胞的百分率、细胞数及肝脏NK细胞表面活化分子CD69的表达的百分率。细胞内细胞因子染色法检测肝脏NK细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及穿孔素(perforin)的水平。非放射性细胞毒实验检测肝脏NK细胞对小鼠淋巴瘤细胞(YAC-1)的杀伤活性。
3．以感染MHV-3 48h的Balb／cJ小鼠肝脏NK细胞为效应细胞，肝细胞为靶细胞，体外肝细胞毒试验验证肝脏NK细胞对病毒感染的肝细胞的杀伤作用。
4．流式细胞术检测感染MHV-3 48h后的Balb／cJ小鼠肝脏NK细胞表面活化受体(NKG2D，NKP46)、FasL及TRAIL的表达，探讨肝脏NK细胞损伤肝细胞可能涉及的分子作用途径。进一步体外肝细胞毒抗体阻断试验验证肝脏NK细胞损伤肝细胞的主要分子作用途径。
5．流式细胞技术检测感染MHV-3 48h的Balb／cJ小鼠肝脏、脾脏和外周血NK细胞表面趋化因子受体CXCR3的表达。实时定量PCR检测MHV-3感染0、24、48、72h后的Babl／cJ小鼠肝组织中CXCR3相关趋化因子(CXCL9／Mig，CXCL10／IP-10)mRNA的表达水平。Transwell细胞迁移实验验证感染MHV-3后的肝细胞对NK细胞的趋化作用以及趋化因子CXCL10／IP-10在脾脏NK细胞迁移至肝脏中的作用。
6．免疫组化分析肝脏NK细胞在HBV诱导的慢加急性肝衰竭病人和慢性乙肝病人肝组织的频率。
7．多色流式细胞术分析HBV诱导的慢加急性肝衰竭病人和慢性乙肝病人外周血NK细胞表面天然细胞毒受体(NKP30，NKP46)的表达。
【实验结果】
1．Balb／cJ小鼠感染MHV-3后，随着疾病的发展，逐渐出现肝细胞气球样变和嗜酸性变，形成点、灶状坏死，汇管区也出现炎性细胞浸润，坏死区肝细胞消失，残留的网织纤维塌陷等病理变化，提示MHV-3感染敏感Balb／cJ小鼠可诱导严重的急性肝组织损伤。MHV-3感染后Balb／cJ小鼠血清酶ALT、AST水平逐步升高，在感染72h后达到峰值(4.4 IU／L，4.4 IU／L)。
2．Balb／cJ小鼠感染MHV-3后，肝脏NK细胞的比例和数量显著增加，在感染48h达到峰值(43.2％vs 10.02％，7.11×10~4 vs 1.34×10~3)，相反在脾脏(4.32％vs 5.72％，1.68×10~5 vs 6.01×10~5)和骨髓(0.74％vs 2.27％，7.4×10~4 vs 5.68×10~5)，NK细胞比例和数量在感染后均显著减少。尽管外周血NK细胞的比例在感染后显著增加，但其数量却显著减少。以上结果提示MHV-3感染后，NK细胞可能从脾脏，骨髓和外周血迁移至肝脏。
3．MHV-3感染后，Balb／cJ小鼠肝脏NK细胞表面活化分子CD69表达显著增加，在感染后48 h和72 h，其表达频率分别达到80.3％±0.3％和95.5％±3.1％，表明MHV-3感染后，募集至肝脏的NK细胞快速而激烈的活化。同时在感染48-72h阶段，血清ASL、ALT水平的显著增加，肝细胞的坏死加剧，表明肝脏NK细胞的活化水平与肝细胞损伤的程度密切相关。
4．MHV-3感染Balb／cJ小鼠48h后，肝脏NK细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平均明显增加(4.44％vs 0.11％，20.91％vs 3.72％)，以TNF-α水平的增加更为显著，而perforin始终处于较低水平且无差异。表明肝脏NK细胞引发的以TNF-α为主的细胞因子风暴在肝细胞的损伤中可能发挥重要作用，相反穿孔素介导的肝细胞溶解在肝细胞的损伤中的作用可能比较有限。
5．MHV-3感染Balb／cJ小鼠48h后，肝脏NK细胞对其敏感靶细胞YAC-1以及病毒感染的肝细胞的杀伤活性显著增强。
6．流式细胞分析感染MHV-3 48h后的肝脏NK细胞表面主要活化受体(NKG2D．NKP46)、FasL及TRAIL的表达，发现感染后肝脏NK细胞表面FasL表达显著增强(27.17％vs 7.78％)，NK细胞活化受体NKG2D和NKP46的表达虽无明显改变，但在感染前后均处于较高水平。
7．体外抗体阻断试验证实，肝脏NK细胞对病毒感染肝细胞的杀伤作用能分别被抗FasL和抗-NKG2D单克隆抗体显著阻断，同时给予抗FasL和抗-NKG2D两种单克隆抗体则阻断效果更为明显，以上结果表明提示在MHV-3诱导的暴发性肝衰竭中，肝脏NK细胞可以通过Fas-FasL和NKG2D-NKG2DL途径杀伤病毒感染的肝细胞。
8．Babl／cJ小鼠感染MHV-3后，肝脏NK细胞的数量显著上升，而且其表面趋化因子受体CXCR3的表达也显著上调(7.49％vs 1.82％)。实时定量PCR检测证实感染MHV-3 48h后肝组织中趋化因子Mig和IP-10 mRNA的表达水平比感染前分别上升15.6和98.8倍。体外Transwell实验证实感染的肝细胞对NK细胞具有明显的趋化作用，并且这种趋化作用能被抗-CXCL10单克隆抗体显著阻断．
9．免疫组化分析发现，与慢性HBV感染病人比较，HBV诱导的慢加急肝衰竭病人肝组织中NK细胞的频率显著增加，而且外周血NK细胞表面天然细胞毒受体(NKP30，NKP46)的表达也显著增强，提示NK细胞在HBV诱导的慢加急肝衰竭的发生发展中发挥重要作用。
1．本研究首次利用MHV-3诱导的暴发性肝衰竭小鼠模型探讨了肝脏NK细胞在病毒诱导的肝衰竭中作用。研究发现，Balb／cJ小鼠感染MHV-3后，NK细胞在肝脏迅速大量募集和活化，且杀伤活性显著增强，分泌IFN-γ和TNF-α的水平也显著上调，而且可通过Fas-FasL和NKG2D-NKG2DL途径损伤肝细胞，表明肝脏NK细胞在MHV-3诱导的小鼠暴发性肝衰竭中可能发挥重要作用。这一研究发现有助于深入理解病毒诱的暴发性肝衰竭的发病机制，亦为后续疾病的干预治疗提供了新的契机。
2．本研究进一步利用MHV-3诱导的暴发性肝衰竭小鼠模型探讨了肝脏NK细胞迁移的分子机制，探讨了CXCR3相关趋化因子(IP-10，Mig)在其中的作用，为后续疾病的分子干预治疗提供了重要的靶点。
3．本研究首次在HBV诱导的慢加急性肝衰竭病人的肝组织中发现了NK细胞在肝脏的募集现象，为深入探讨肝脏NK细胞在HBV诱导的慢加急性肝衰竭发生发展中的作用奠定了坚实的基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：华中科技大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2009【分类号】：R575.3;R512.6【目录】：
中文摘要5-11
ABSTRACT11-17
第一部分 肝脏NK细胞在MHV-3诱导的小鼠暴发型肝衰竭中数量、活性及功能的动态研究17-36
材料与方法17-26
参考文献33-36
第二部分 肝脏NK细胞在小鼠暴发型肝衰竭中肝细胞损伤中的作用机制研究36-49
材料与方法36-43
参考文献46-49
第三部分 肝脏NK细胞在小鼠暴发性肝衰竭中迁移的分子机制的初步研究49-62
材料与方法49-56
参考文献60-62
第四部分 肝脏NK细胞在人类HBV诱导的慢加急性肝衰竭中作用的初步研究62-73
材料与方法62-66
参考文献70-73
全文小结73-74
综述一 NK细胞受体与配体的特异识别74-84
综述二 NK细胞和NKT细胞在病毒性肝炎中的作用84-88
英文缩略语对照表88-89
攻读博士学位期间已发表和拟发表论文89-90
参加学术会议90-91
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京公网安备75号干细胞移植治疗慢性肝衰竭18例的疗效评价--《广西医学》2013年07期
干细胞移植治疗慢性肝衰竭18例的疗效评价
【摘要】：目的观察自体骨髓干细胞移植治疗慢性肝衰竭的临床疗效。方法 18例慢性肝衰竭患者在常规综合治疗基础上行自体骨髓干细胞移植,观察患者术后临床症状、肝功能改善情况及不良反应。结果移植后第8周,患者乏力、纳差、下肢水肿、腹胀、腹水等症状明显改善(P0.05),丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间均明显下降(P0.05),而血清白蛋白、纤维蛋白原、胆碱酯酶、甲胎蛋白均明显上升(P0.05),无明显不良反应发生。结论自体骨髓干细胞移植治疗慢性肝衰竭安全、有效。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R575.3【正文快照】：
慢性肝衰竭是众多肝病的终末期阶段,也是终末期肝病患者最主要的死亡原因。原位肝移植(ortho-topic liver transplantation,OLT)是目前理论上最为理想的治疗方法,可改善终末期肝病患者肝功能与生活质量,延长生存时间,但供体匮乏、术后排斥反应、手术费用昂贵及道德伦理等因素
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