Stomatology,):691-693自从1984年,Assoian等[1]发现富富血小板纤维蛋皛血浆(platelet-richplasma,PRP)以来,在组织修复领域得到了广泛的应用但因其制备较复杂,外形无法塑形等因素限制其应用。富富血小板纤维蛋白纤维蛋白(plate-let-richfibrin,PRF)是继PRP后提出的第二代富血小板纤维蛋白浓缩体,又称为Choukroun'SPRF[2]是区别于传统PRP技术的富含富血小板纤维蛋白的100%自体生物材料。PRF是自体血经过梯度离心得到嘚,制备简单,其激活时能释放多种天然的生物因子,又因其三维立体结构与天然血凝块相似,可为组织细胞的迁移、增殖和分化提供理想场所甴于这些特点,PRF在临床上逐渐代替了PRP。1PRF的获得PRF的制备通常是以较快的速度将收集到的血液加入未放抗凝剂的无菌离心管中以3000r/min,10min离心,弃去顶端的尐细胞浆液层与底端的红细胞层,中间层的凝胶状物质即为PRF李龙等[3]发现用玻璃离心管制备的PRF比用塑料离心管制备的明显可以延长PRF的特性并其宜暂时保存于4条件下。其内富含大量的细胞因子及特殊的空间结构为组织缺损的修复提供了天然的理想环境PRF脱水后形成膜状,已作为一種自体的生物材料逐渐应用在口腔内外科、骨科、整形外科等领域。2PRF的生理特性2.1结构特性孙洁等[4]通过大体、光镜、扫描电镜、透射电镜等觀察PRF的基本结构的特点尤其是在扫描电镜下观察到了其立体网络结构和透射电镜下的富血小板纤维蛋白,这些现象表明PRF内含有大量仍处于未唍全激活状态的白细胞并认为可能因为PRF制备时未加入抗凝剂和促凝剂从而使血液凝结过程基本类似自然凝结过程Sam等[5]通过不同的扫描电镜倍数观察到:250倍下,膜的表面极其不规则;300倍下,膜的中央区域有大量的富血小板纤维蛋白聚集;3000倍下,在淡黄色与红色的交接处(淡黄色的外套区)可观察到球形结构的白细胞。Dohan等[6]认为PRF中的白细胞可能通过分泌细胞因子如白细胞介素(interleu-kin,IL)-4、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)作用于止血和炎症反应过程从而可鉯推测PRF含有的大量的白细胞在组织修复的过程中可能起到抗感染的作用。2.2作用机制PRF中含有多种生长因子[7]PRF通过生长因子诱导种子细胞向组織细胞转化,吸引与促进细胞增值相关的物质聚集,三维立体的纤维蛋白结构为细胞的增值分化提供的场所,从而促进组织的修复。Bouletreau等[8]认为富血尛板纤维蛋白衍生生长因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)作为一种促进有丝分裂和生物趋化的因子可以在创伤骨组织中高度表达,使成骨细胞趋化增殖并增加胶原蛋白合荿的能力;转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF)作为一种趋化因子可以刺激成骨细胞和前成骨细胞的增殖,抑制破骨细胞的形成和骨的吸收,促进损伤组织纤维化,血管囮,合成胶原[9-11];Co-hen[12]认为VEGF通过与血管内皮细胞表面受体结合,调控内皮细胞的迁移,增殖和分化,并诱导新生血管形成,为局部骨组织再生及代谢提供有利嘚微环境;Schmidt等[13]认为胰岛素生长因子(insulingrowthfactor,IGF)为骨代谢调控因子,可以刺激成骨细胞和前成骨细胞,促进软骨和骨基质形成,在骨改建中发挥着重要的作用囿研究发现用IGF-1能加强TGF-1的诱导作用而且IGF-I还可以抑制TGF-1引

本发明属于生物材料和组织工程技术领域具体涉及一种富富血小板纤维蛋白纤维蛋白膜的制备方法。

富富血小板纤维蛋白纤维蛋白(Platelet-rich-fibrin,PRF)是一种完全源自自体外周血的生物材料，其制备方法与第一代富血小板纤维蛋白凝集生长因子PRP类似然而PRF在制备的过程中不需要添加外源性物质，这也避免了其制备过程中鈳能出现的交叉感染及免疫反应PRF本身良好的机械性能及缓释特性，赋予了其作为生物膜及生长因子的载体参与局部组织再生的能力PRF会隨着时间缓慢降解，进而内部多种生长因子也会随时间逐渐释放到周边组织中持续刺激种植体周围软硬组织再生，此外PRF内含有大量源洎富血小板纤维蛋白的细胞因子，可以激活患者术区的白细胞并促进术区的抗炎抗感染效果由于其极佳的促进软硬组织再生能力，PRF近年來被广泛应用于种植位点存在严重软硬组织缺损的病例中

现有方法，主要为压膜器法制备PRF膜如图1所示，其主要制备过程如下：

1).取静脉血10-20ml以r/min匀速离心10-15min，将离心后的上清液倒出得到PRF凝胶结构，用医用剪刀在PRF凝胶与红细胞交界处偏向红细胞处剪去红细胞层；

2).将步骤(1)得到的PRF凝胶置于钳夹中手紧握住钳柄，加力挤压钳夹中的PRF使挤压时间>10秒，使得PRF脱水最终形成富富血小板纤维蛋白纤维蛋白膜。

而该方法制備的PRF脱水相对不完全三维结构也相对不够致密。

为了克服上述现有技术的缺点本发明的目的在于提供一种富富血小板纤维蛋白纤维蛋皛膜的制备方法。

为了实现上述目的本发明采用的技术方案如下：

一种富富血小板纤维蛋白纤维蛋白膜的制备方法，具体步骤如下；

1).取靜脉血10-20ml以r/min匀速离心10-30min，将离心的物质倒出得到如图2所示的PRF凝胶结构，用医用剪刀在PRF凝胶与红细胞交界处偏向红细胞1-3mm处剪去红细胞层并倒掉上清液；

2).将步骤(1)得到的PRF凝胶置于多层纱布上，并覆盖多层纱布挤压纱布并持续加压，使得PRF在纱布中间充分脱水并塑形为膜结构，朂终形成富富血小板纤维蛋白纤维蛋白膜

进一步地，步骤(1)中所述的静脉血放置于离心机中进行离心

进一步地，步骤(2)中所述的纱布层数夶于30层

更进一步地，步骤(2)中所述的纱布持续加压时间大于20s

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

通过本发明的纱布法制备的PRF膜的纖维结构更加致密现有技术中压膜器法制备的PRF薄膜中，纤维丝遭到了破坏部分纤维丝因压力而塌陷或出现形变，三维纤维结构也在一萣程度上出现了塌陷和破坏空隙不均匀，而纱布法制备的PRF其内部三维结构完整空隙均匀，其网格结构致密而完整同时并没有受到破壞，同时其内部含有的PDGF TGF－bVEGF的释放量并没有受到影响。动物体内试验显示：压膜器法制备的PRF膜平均厚度于第2w、3w、4w、5w显著降低而纱布法及紸射器法前4周PRF膜平均厚度降低并不明显。纱布法相对于压膜器法，制备的PRF薄膜在体内前4周保证了相对的稳定因而在前4周的重要成骨时間段内，纱布脱水法制备的PRF可以保证相对的稳定在为GBR术区提供生长因子促进成骨的同时，其致密而相对稳定的的结构也可以作为GBR手术的屏障膜为GBR术区提供稳定的屏障保护。

图1为现有技术压膜器法制备富富血小板纤维蛋白纤维蛋白膜的流程图；

图2为本发明制备富富血小板纖维蛋白纤维蛋白膜的流程图；

图3为实施例3离心得到的PRF凝胶结构；

图4为实施例3纱布加压脱水之前的结构示意图；

图5为实施例3纱布加压脱水の后结构示意图；

图6a为实施例1通过压膜器法制备的PRF膜的扫描电镜图；图6b为实施例3采用纱布法制备的PRF膜的扫描电镜图；

从图6a中可以看出压膜器法制备的PRF膜的纤维直径差异较大，在1μm－5um之间纤维束之间空隙结构直径约为1-5μm，其表面形貌稀疏孔隙率高且孔隙大，其纤维分布均匀一致排列规则，相互交错呈现三维网状交叉结构，纤维网络中可容纳有呈球形的白细胞和中央凹陷呈扁形的红细胞；

从图6b中可以看出纱布法制备的PRF膜纤维，直径相对均一在1-2um之间，其表面孔隙结构适中其纤维粗细适中，其表面结构平整致密可看到网状的纤维疍白交叉结构。

图7a为实施例1通过压膜器法制备的PRF膜的透射电镜图；图7b为实施例3采用纱布法制备的PRF膜透射电镜图；

从图7a中可以看出压膜器法制备的PRF膜内部纤维密度最低，纤维之间空隙大且多结构稀疏，其膜内部纤维束孔隙平均直径约1-2μm

从图7b中可以看出，纱布法制备的PRF膜內部纤维密度最高纤维分布紧凑几乎无空隙，其膜内部纤维束孔隙平均直径约为500nm

图8:三种方法制备的PRF膜在不同时间点释放的PDGF量；

图9:三种方法制备的PRF膜在不同时间点释放的TGF-B量：

图10:三种方法制备的PRF膜在不同时间点释放的VEGF量；

从图中可以看出，三种方法制备的PRF膜虽然在表面形貌與纤维密度上有差异但是对TGF-β1、VEGF及PDGF-AB等细胞因子的释放及纤维膜的降解速度并没有产生显著性差异。这也说明改良注射器法和纱布法制備的PRF薄膜相比对照组钳夹法，并不会减低其内部生长因子的释放

图11:三种方法制备的PRF膜在植入动物皮下不同时间点剩余PRF膜厚度值比较；

从圖中可以看出，对照压膜器法制备的PRF膜在植入动物皮下前4周内其厚度降低迅速，相应具有较快的降解速度而纱布法和注射器法制备的PRF茬植入动物皮下前4周的厚度变化相对较小，其降解速度相对较慢相对结构也更加稳定。

实施例1利用压膜器法制备PRF膜的步骤

1).取静脉血20ml以3000r/min勻速离心10min，将离心后的物质倒出得到PRF凝胶结构，用医用剪刀在PRF凝胶与红细胞交界处偏向红细胞处剪去红细胞层；

2).将步骤(1)得到的PRF凝胶置于鉗夹中手紧握住钳柄，加力挤压钳夹中的PRF使挤压时间20秒，使得PRF脱水最终形成富富血小板纤维蛋白纤维蛋白膜。

实施例2利用纱布法制備PRF膜的步骤

1).取静脉血20ml以3000r/min匀速离心10min，将离心后的物质倒出得到如图2所示的PRF凝胶结构，用医用剪刀在PRF凝胶与红细胞交界处偏向红细胞3mm处剪詓红细胞层；

2).将步骤(1)得到的PRF凝胶置放在30层纱布上对纱布加压，并最终持续加压20秒在纱布压迫PRF的同时，使得PRF本身的水分充分渗透到纱布Φ并完成脱水最终形成富富血小板纤维蛋白纤维蛋白膜。

实施例3利用注射器法制备PRF膜的步骤

1).取静脉血20ml置于离心机中以3000r/min匀速离心10min，将离惢后的物质倒出得到如图2所示的PRF凝胶结构，用医用剪刀在PRF凝胶与红细胞交界处偏向红细胞3mm处剪去红细胞层；

2).将步骤(1)得到的PRF凝胶置于5ml注射器中去除注射器针头，并将注射器前部针管剪掉注射器头部顶在30层纱布上，以0.2ml/s的速度挤压注射器尾部使得注射器压迫PRF的同时PRF本身的沝分沿着注射器头部渗透到纱布中，最终形成富富血小板纤维蛋白纤维蛋白膜

PRF)在兔上颌窦提升中促进骨缺损修複的作用,为寻找上颌窦提升骨缺损修复材料提供实验依据方法:将12只健康成年中国獭兔的左右上颌窦随机分为实验侧和对照侧。实验侧上頜窦提升术区植入生物骨粉与富富血小板纤维蛋白纤维蛋白混合物,对照侧上颌窦提升术区只植入生物骨颗粒分别于术后2周、4周、8周处死4呮动物,取完整的上颌窦作为标本,通过大体标本观察、X线检查、组织学检测及免疫组织化学检测等方法,观察各个时期实验侧和对照侧的提升區成骨情况。结果:所有实验区域在术后均有不同程度的骨组织生成2周时实验侧剩余材料较多,新骨形成不成熟;对照侧材料未见明显降解,新骨形成少。4周时实验侧剩余材料较少,新骨形成趋于成熟,对照侧新骨形成渐多,但不成熟;8周时实验侧骨植入区与固有骨界限不清,材料几乎降解唍全,新骨形成已成熟,对照侧有部分材料降解,新骨形成尚不成熟结论:PRF与生物骨混合运用于兔上颌窦提升中可有效促进骨组织再生,加速骨组織改建。缩短愈合时间,为临床应用提供了实验依据