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最近在做microRNA的荧光定量PCR,用U6做内参,U6的Ct值在什么范围内,目的基因表达呈线性关系
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我最近也要做mi RNA的荧光定量PCR,用U6做内参,但是苦于没有找到U6的基因序列（NCBI里面有好多种,不晓得哪一个是）,宝生物那边以前有现成的U6引物,但现在不生产了,说只能自己提供基因序列,他们设计和合成,哎!想问一下楼主你的U6引物在哪个公司设计和合成的呀?需要提供基因序列么?是人的还是小鼠或其他物种的U6?如果方便的话,可否提供一下小鼠的U6基因序列呢?多谢!
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扫描下载二维码& 【讨论帖】microRNA内参，u6,u6a,u6b，到底如何选择
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【讨论帖】microRNA内参，u6,u6a,u6b，到底如何选择
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我的做法是先逆转录再荧光定量pcr！
逆转录使用特异性引物（u6的反向引物）。
u6，also as know RNU6A,RNU6B，分别对应 RNU6-1，RNU6-2，
U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA
U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT
这个引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用，且经丁香园内朋友使用，反应很好！
在生工合成的，今天pcr结果非常好！U6的ct 13.1左右。
另外，多谢园友提醒，这些u6都是用于人的。不清楚，也没有验证是否可以用于老鼠！
希望能够给大家一点帮助。
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u6引物有没有物种特异性？
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不知道有人比较过骨髓中U6与U6B那个更适合做内参吗？U6感觉用的多些，但不知在骨髓中如何
有人知道U6在骨髓中一般CT值多少呢
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原帖由 youyou99 于
16:26 发表
不知道有人比较过骨髓中U6与U6B那个更适合做内参吗？U6感觉用的多些，但不知在骨髓中如何
有人知道U6在骨髓中一般CT值多少呢 强烈建议个人查下文献，相信您不是第一个做骨髓中的mirna的。
当然，也可以开新贴询问，因为u6的ct值一般文献里面没有。
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对啊，查了20多篇，没有一篇把原始CT值放上来的
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用oligo(dT）常规反转录U6 RNA,做U6cDNA real time的时候选U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT作为引物呢
还是只用forward primer，反向引物用uni-miR qPCR primer（Takara盒子里的）？
=================================================
请问关于这个问题，您现在有答案了吗？可不可以分享一下。
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请问楼主，TAKARA家的microRNA试剂盒（加尾法）做qRT-PCR时，可以使用您推荐的U6引物吗？
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战友好，最近刚刚在接触miRNA，菜鸟级别的。有几个问题想向您请教一下。我准备做miRNA的染料法荧光定量分析，想采取PolyA加尾法进行反转录。我查了文献，文献中说加尾之后进行反转录，需要加入反转录引物，后续PCR定量时只需要设计上游引物，下游引物是通用的。但是内参基因U6是有一对引物且反转录引物就是U6的下游引物。那么现在我想知道，我每个样本要做目的基因和内参U6，那我是不是需要每个样本进行2管加尾反转录，目的基因管加尾后反转录加入RT Primer，而我的内参U6管，加尾后要加入U6下游引物？还是说不用分开做反转录，直接把每个样本加尾处理后反转录加入RT Primer即可？后续做荧光定量直接用反转录后的模板加入上游引物和下游通用引物就行~~盼回复~~
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楼主，我想问一下，我想RT-pcr一种microRNA,想选择U6做内参，我设计了microRNA的颈环引物作为逆转的时候使用，但是我想知道，你分享的引物是U6逆转的时候用的特异性的引物吗？还有如果是的话，这是针对SNU6-1的还是2的？，真的很想知道，谢谢楼主
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原帖由 october7 于
16:29 发表
楼主，我想问一下，我想RT-pcr一种microRNA,想选择U6做内参，我设计了microRNA的颈环引物作为逆转的时候使用，但是我想知道，你分享的引物是U6逆转的时候用的特异性的引物吗？还有如果是的话，这是针对SNU6-1的还是2的？，真的很想知 ... 不好意思，我primer blast后没有找到具体的这个引物是SNU6-1 还是SNU6-2.
另外，我好久没有做microRNA，这个东西忘的差不多了。
针对SNU6-1的还是2，有什么差别吗？棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析--《中国农业科学》2015年19期
棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析
【摘要】：【目的】以棉花品种新海16基因组DNA为模板,克隆海岛棉(Gossypium barbadense L.)Gb U6启动子,筛选出能在棉花生殖细胞中(花粉)高效转录的Gb U6启动子,为利用基因组编辑技术进行棉花分子育种奠定重要基础。【方法】采用两轮PCR方法克隆完整的Gb U6启动子。根据网上公布的棉花基因组数据库序列,利用Primer5.0软件设计5对引物,进行第一轮能覆盖完整Gb U6启动子的PCR扩增,产物克隆测序正确后,再利用transfer PCR法将Gb U6启动子精确亚克隆到CRISPR/Cas9基因组编辑载体中;第二轮扩增产物测序正确后,运用DNAMAN软件对克隆成功的5个Gb U6启动子序列中具有转录功能的必要元件进行分析;然后以p BI101质粒DNA为模板,PCR扩增并克隆GUS报告基因,经酶切鉴定、测序正确后,用BbsⅠ酶切GUS,连入经同样酶切后的5个Gb U6启动子对应的CRISPR/Cas9基因组编辑载体中,转化、酶切鉴定,获得对应的5种Gb U6::GUS的表达载体。将含有Ca MV35S启动子驱动的GUS表达载体作为棉花花粉瞬时转化的阳性对照,以上述6种表达载体DNA为模板,采用高保真酶的PCR扩增法获得高浓度DNA片段,利用基因枪轰击法将5种Gb U6::GUS和阳性对照的DNA片段分别转化棉花花粉,并进行GUS染色,最后用体式显微镜观察染色情况。每个启动子的基因枪转化重复3次,最后根据染色深浅筛选出在棉花生殖细胞中高效转录的Gb U6启动子。【结果】经两轮PCR扩增后获得5种Gb U6启动子,启动子长度分别为1 166、1 119、1 134、1 214和1 176 bp,并构建获得了相应的5种CRISPR/Cas9基因组编辑载体;对拟南芥和克隆的5个Gb U6启动子序列进行序列比对,结果表明,Gb U6启动子区与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的-60 bp位置的USE元件和-30 bp位置的TATA框,而且这两个元件之间的距离也非常固定;用Gb U6::GUS的DNA片段瞬时转化棉花花粉,发现基因枪瞬时转化的3次重复结果显示克隆得到的5个Gb U6启动子有4个能驱动GUS在棉花花粉中表达,棉花花粉被染成蓝色。其中Gb U6-5P::GUS的染色相对较深,接近于Ca MV35S启动子。【结论】成功克隆了棉花生殖细胞中高效转录的Gb U6启动子,为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了有效的启动子。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：S562【正文快照】：
0引言【研究意义】基因组编辑技术是研究基因功能和进行作物分子育种的重要工具,它利用位点专一的核酸酶(sequence-specific nucleases,SSNs)靶向修饰生物体基因组DNA序列,从而定向获得基因突变材料,可以用于研究基因功能和创制出新的农作物育种材料[1-2]。CRISPR/Cas9是2013
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【参考文献】
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徐开杰;史丽丽;奚亚军;朱建楚;;[J];草地学报;2014年03期
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宋时奎;王影;于洋;耿立召;张春翔;李相敢;韩天富;;[J];分子植物育种;2014年06期
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【求助】关于RNA的提取和RT-PCR
页码直达：
这个帖子发布于11年零0天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
从来没有接触过RT-PCR的新手，需从新鲜组织块提取RNA。恳请各位专家不吝赐教！
1、标本如何收集：收集新鲜标本时应注意哪些？收集时是不是也怕RNA酶的降解，用EP管可行？收集后是不是立即放入-80度冰箱里
2、标本保存。标本放入-80度冰箱里能保存多久
希望能有专家早日解除我的疑惑！
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收集样本：使用EP管装盛，然后在液氮或干冰上速冻，然后-80C保存。如果有条件的话，可以使用一些专用的RNA保护溶液浸泡，具体试剂可以自己查找一些代理公司的产品。保纯样本：-80C一般可以保存1-2个月，最好尽快提取，这样可以避免降解。
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首先，收集活体标本时速度尽量要快，标本可以放在用DEPC处理过的EP管中，先用液氮速冻，然后放在-80度冰箱里，保存半年没有问题。
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谢谢 各位指导
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丁香园中级站友
1.样本在我看来最好的保存方法就是马上就做，我曾经做过对比实验，我取得是人的肺，标本取来我是等着他出生，胎下来后马上用手套包裹，放在冰桶中，然后马上回到实验市分装到使用ＤＥＰＣ水处理过的冻存管中（切成大约１ＭＭ３的小块），然后马上提取ＲＮＡ，然后其他的保存在－８０度冰箱中，第二天取的和当时就作的，有很大的区别，大约第二天提取的５Ｓ就很亮，上面两条带就大约都讲解了．２，如果要保存就只能保存２－３天，外围使用棉花包裹．
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我遇到和你同样的问题，还有就是取标本时标本上的血含有RNA酶，请教诸位高手可不可以用生理盐水先冲洗标本呢，谢谢
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请各位再给予指点:就是上述的取标本时标本上的血含有RNA酶，请教诸位高手可不可以用生理盐水先冲洗标本呢，谢谢
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关于丁香园人U6启动子-学术百科-知网空间
人U6启动子
人U6启动子
human u_6 promoter
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目的构建调控人核心蛋白聚糖(DCN)基因特异性基因表达载体,为进一步应用该基因进行肺癌靶向治疗的研究奠定实验基础。方法利用特异性引物,应用PCR技术从人外周血基因组中扩增肺癌细胞
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目的　克隆人端粒酶催化亚单位 (hTERT)的启动子 ,并检测它在多种人肺癌细胞株和人胚肺成纤维细胞株中的转录活性 ,为肺癌靶向性基因治疗的研究奠定基础。方法　以人胚肾 2 93
人类端粒酶启动子(hTERT启动子)在肿瘤基因治疗中的有效性已经得到了证实.然而,hTERT启动子有限的肿瘤靶向转录活性困扰着它的临床应用.早期研究已经揭示,核心hTERT启动子
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