下列对生物细胞代谢活动的描述,不正确的是A．大肠杆菌在拟核区转录信使RNAB．乳酸杆菌在细胞质基质中产乳酸C．衣藻进行光合作用的场所是叶绿体D．酵母菌的高尔基体负责合成蛋白质D河北正定中学2014届高三上学期第三次月考生物试题答案关注今日：0 | 主题：155769
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【资源】大肠杆菌发酵经验总结
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大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。一、代谢副产物-乙酸
乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
预防乙酸产生的措施： 1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生：
比生长速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等方法来降低比生长速率。
2、透析培养：
在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。3、 控制葡萄糖的浓度：
葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上，以减少乙酸的产生。
常用的控制方法主要有：
恒pH法：大肠杆菌会代谢葡萄等产生乙酸，使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标，该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果，容易造成补料体系出错。
恒溶氧法：菌体代谢时会消耗氧，使溶氧下降，当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根据溶氧曲线补加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。 二、温度
大肠杆菌发酵最适温度是37 C，当温度最适菌体生长时，比增长速率将会增大。随温度上升细菌代谢加快，其产生代谢副产物也会增加。这些副产物会对菌体的生长产生一定的抑制作用。菌体生长过快也会影响质粒的稳定性。降低培养温度，菌体对营养物质的摄取和生长速率都会下降。同时也减少了有毒代谢副产物的产生和代谢热的产生。有时降低温度更有利于目的蛋白的正确折叠及表达。在重组大肠杆菌的发酵中不同发酵阶段其最适温度也不 同，为了能获得大量的目的蛋白，首先要保证菌体的量，因此在前期可优先考虑菌体的生长，到诱导阶段应将目的产物的表达放在首位。三、培养方式
微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批3种。大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养，这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。
生物技术研究者追求的两个主要目标，一是新型生物产品的开发，另一就是为传统的或新生生物产品，寻求更经济的生产方式。近十年来，利用遗传工程技术来生产一些重要的生物药物，是生物技术领域中迅速发展的一个重要方向。在这一研究领域里，如何创造更经济、更有效的方法，来提高生产过程的经济性和产品的市场竞争力，已经成为生物技术领域的科学家们所关注的焦点问题。
利用重组DNA技术生产重要的生物药物，在人类文明史上具有划时代的意义。由于生产成本和生产率的高低直接影响公司的生存，重组生物药物生产过程的优化已经成为一个重要问题。它包括以下六个方面∶(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；(6)后处理过程的优化。只有这六个方面都以实现高生产率为目标，整个生产过程的最优化才能实现。(一)细胞生长环境的优化策略
要提高细胞密度和生产率，首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化，包括生长培养基的组成，培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件。优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下，避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。1．培养基组成的优化培养基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微营养物如维生素和微量元素，这些营养物的浓度与比例，对实现生产重组微生物的高密度发酵是很重要的。例如，过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉生产L-苹果酸；链霉菌在60～80 mmol/L -淀粉酶的产量可提高2倍。?的产率显著提高。此外还发现，限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的生长，但比起精氨酸充足时细胞生长优良的情况，其重组?CO32-存在下，其丝氨酸蛋白酶生产能力可提高10倍之多；在重组微生物达到高细胞密度后，限制磷酸盐浓度可使抗生素和异源白介素培养基中复合氮源的种类对重组大肠杆菌的高密度发酵也非常重要。一般地，当流加培养基中含有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中含有蛋白胨时，大肠杆菌不能再利用其所产生的乙酸。将酵母膏和蛋白胨都加入流加培养基中，不但所生产的重组蛋白非常稳定，细胞还能再利用代谢合成的乙酸，这是一种非常有趣的代谢机制。
恒化技术可用于优化精氨酸营养缺陷型大肠杆菌X90的生长培养基。使该菌株以0.4 h-1的比生长速率在含精氨酸的基本培养基上生长，待培养达到稳定状态后，在恒化器内分别加入氨基酸、维生素和微量元素来考察这些物质对菌体生长和精氨酸合成的影响。结果表明，由于氨基酸生物合成途径的末端产物抑制作用，加入某些氨基酸后，细胞生长反而受到抑制。加入NH4Cl后细胞量则出现了戏剧性的增长。而添加维生素对菌体生长基本上没有任何影响。通过计算生物量对每种基质的产率，最终可以确定高密度发酵培养基的组成，在此优化培养基上，大肠杆菌X90细胞密度可达到92 g/L，同时形成56 mg/L的胞外重组蛋白酶。2．特殊营养物的添加
-内酰胺酶的培养基中添加60?在某些情况下，向培养基中添加一些营养物质能提高生产率。这些营养物的作用有可能是作为产物的前体，也有可能是阻止产物的降解，例如，在培养重组大肠杆菌生产氯霉素乙酰转移酶(一种由许多芳香族氨基酸组成的蛋白)时添加苯丙氨酸，可将酶的比活力提高大约2倍；在培养重组枯草芽孢杆菌生产 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸钾能使重组蛋白的稳定性显著提高。其原因可能是由于宿主细胞产生的多种胞外蛋白酶的活性被抑制，从而防止了重组蛋白的降解。
在生长培养基中添加特殊物质有时还能以一种未知的机制提高生产率。例如，在摇瓶培养Micromonospora cbersina时添加碘化钠可使dynemicin A的产量提高35倍，但在小型反应器中却无法重复这一结果。3．限制代谢副产物的积累
培养条件的控制对代谢副产物的形成影响甚大。在分批或流加培养中，某些营养物的浓度过高均会导致Crabtree效应的产生。在这种效应下，酿酒酵母会产生乙醇，大肠杆菌则会产生过量乙酸，一旦生成乙酸，细胞生长及重组蛋白的生产均会受到抑制。大肠杆菌形成乙酸的速度依赖于细胞的生长速度和培养基的组成。业已确证，如果在培养基中添加复合营养物(如大豆水解物)，则会增加乙酸的积累量。针对如何减轻由于乙酸积累而产生的负面影响，众多研究者进行了大量工作，如利用循环发酵技术来限制乙酸在重组大肠杆菌高密度培养中的积累。近来也有研究表明，添加某些氨基酸能减轻乙酸的抑制作用。如在培养基中添加10 -内酰胺酶，并能刺激酶从周质向培养基中释放，但此时仍有乙酸伴随生成。?-淀粉酶和?mg/L的甘氨酸能显著促进大肠杆菌合成重组 (二)培养模式
由于许多营养物在高浓度下对细胞有抑制作用，而为了达到高细胞密度，又必须供给大量的营养物质，因此，浓缩营养物必须以与其消耗速率成比例的速度加入反应器中。为此产生了多种形式的补料策略，它可以简单到线性补料，也可以复杂到利用数学模型计算得出的策略来控制补料速率。具体来说，培养模式的选择主要依赖于以下三个因素∶(1)所培养细胞的具体代谢行为；(2)利用抑制性底物合成目的产物的潜力；(3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力。1．大肠杆菌流加发酵策略
大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株，广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生，因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研究发现，即使葡萄糖浓度只有0.25～0.5 g/L，大肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于饥饿状态。近年来已经报道了多种控制大肠杆菌流加培养中流加速率的方法，其中大多数是将流加速率与一种物理参数间接耦合(如溶氧、pH或CO2释放速率)。有学者将溶氧控制在一个预定值上以保证较低的生长速率，结果乙酸产生很少，最终细胞干重达到110 g/L，并发现较低的比生长速率还有利于重组蛋白的高表达。在另一个控制低比生长速率的高细胞密度培养中，研究者采用先指数流加葡萄糖、铵盐和无机盐，后采用广义线性流加的培养策略，有效地防止了乙酸的积累，重组大肠杆菌的细胞密度达到66 g/L，通过温度诱导可在胞内形成19.2 g/L的活性重组蛋白。如果将葡萄糖浓度控制在一个不致于产生毒性的足够低的水平上，也可以使细胞在不存在限制性基质的情况下迅速生长到高细胞密度。这种控制策略对仪器的要求较高。Kleman等采用在线葡萄糖分析仪，以微生物对葡萄糖的需求来决定葡萄糖和其它营养物的流加速率，这一算法能够在产物诱导阶段中根据细胞生长的变化自动调整流加速率。培养携带质粒的大肠杆菌 MV1190，其质粒中带有编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最终细胞干重达到39 g/L，产生1.7 g/L可溶的活性蛋白。 2．重组酵母的流加发酵
酵母中广泛用于遗传工程研究的菌株是酿酒酵母。但采用酿酒酵母作为重组宿主也有以下缺点∶(1)重组蛋白生产的水平较低；(2)质粒不稳定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出现的，因为这会抑制重组蛋白的形成。近来研究表明，其它酵母，如巴斯德毕赤氏酵母也具有作为重组宿主的潜力。Clare等比较了重组巴斯德毕赤氏酵母和酿酒酵母在高细胞密度状态下表达和分泌鼠表皮生长因子的能力。培养每基因组含有19个拷贝数的巴斯德毕赤氏酵母，最终可获得447 mg/L胞内重组蛋白；而培养酿酒酵母所获得的最高水平仅6～7 mg/L。
通过先指数流加，后采用基于CO2释放和RQ值的线性流加控制方式可使重组巴斯德毕赤氏酵母的细胞干重达到80～90 g/L，并分泌高水平的重组人血清蛋白。而培养酿酒酵母，细胞干重和重组蛋白的产量仅分别为25 g/L和20 mg/L。即使将酿酒酵母的生长速率维持在0.12～0.18 h-1，也将形成10～13 g/L的乙醇，因而导致产率降低。但酿酒酵母产乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一个复杂的流加系统，将酵母的生长速率控制在0.3 h-1，可使谷胱甘肽(GSH)的生产最大而乙醇的生成最小。 3．流加培养的控制一个好的流加控制系统必须避免两种倾向∶一是流加过量，补料组分在反应器中积累从而对细胞生长和产物形成产生抑制；二是流加不足，这可能会导致细胞必需营养物的缺乏。计算机技术的迅猛发展，为流加培养的控制提供了更有效的手段。近年来，应用计算机技术来监测和控制发酵过程的研究屡见报道。由于现代计算机技术的帮助，人们能够采用多种生长参数和数学模型来控制流加培养中营养物的添加，从而使复杂的控制系统得以实现。在各种人工智能技术中，模糊推理(fuzzy reasoning)是应用最广的一种。模糊逻辑控制(fuzzy logic control)部分依赖于数学生长模型，也采用“语言定义的规则系统”(linguistically defined rules system)来帮助系统响应发酵过程的非线性和动态行为。Alfafara等在流加培养酿酒酵母生产谷胱甘肽的研究中，采用一个模糊逻辑控制系统来控制葡萄糖的流加速度，对系统进行优化后谷胱甘肽的比产生速率达到6.2 h-1。目前，在流加培养中应用模糊逻辑控制技术的最大问题在于如何减少底物和产物浓度振荡所需的调整次数。自适应模糊逻辑控制算法的发展可望对此有所帮助。 (三)诱导策略对于许多带有诱导型启动子的重组微生物，只有将生长期和产物形成期分开才能获得最大生产率。在流加培养中，这两段时期的分离可以通过延迟诱导直至细胞生长已达到高密度来实现。此外，如果质粒稳定并且产物对培养物无毒，那么可以用重复补料分批培养系统来提高生产率。有学者采用重复补料分批培养技术培养酿酒酵母，每24 h更换50%的培养基，持续30 d，其产物(hirudin)的产量可比连续培养系统提高3倍。-内酰胺酶的重组大肠杆菌，将第一罐的发酵液导入第二罐中，构成一个两级培养系统。第二罐中添加营养物以及IPTG作为诱导物。结果获得300?如果诱导物和产物对细胞都有毒性，那么应当人为地将诱导期和生长期分开。对于这种情况，两级连续培养是最适宜的培养方式。控制第一罐的条件，使细胞生长处于最适状态之下，而诱导与产物形成则发生在第二罐中。例如，在恒化器中培养一株能产 -内酰胺酶(相当于总蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。这一系统至少可以稳定运行50?mg活性 d。另一相似的系统被用于培养大肠杆菌生产重组蛋白A-EcoRI蛋白融合体。培养在恒浊器中进行，对第二罐进行热诱导，结果获得了比分批发酵高6倍的比生产率。研究者还尝试将生产重组蛋白的两级连续培养系统与亲和色谱柱相组合，试图实现重组蛋白生产和纯化的连续化。但由于技术上的一些原因，这种组合还未得到成功。比生长速率对细胞生长和产物形成均有重要作用。经常会遇到的情况是，最适于细胞生长的比生长速率却并不适于产物的形成或其它特性的实现。我们在培养面包酵母时发现，比生长速率为0.2 h-1时细胞产率最高，而比生长速率为0.178 h-1时酵母发酵活力最佳。针对这一现象我们提出了一个两阶段控制比生长速率的流加培养策略，结果在一个反应器中实现了高发酵活力与高细胞产率的统一。 (四)细胞循环发酵 从反应器角度来考虑获得高细胞密度，通常采用的是细胞循环生物反应器。这种反应器利用一种切向流或中空纤维过滤器从醪液中分离细胞，细胞返回容器，无细胞醪液则以给定速率连续转移，同时代之以新鲜培养基。利用细胞循环技术，可使细胞保留在反应器中并达到高细胞密度，而毒性废产物和胞外产物则不断转移，这可以延迟或防止由细胞生长或产物形成引起的反馈抑制。细胞循环生物反应器能够适用于多种机体和生产系统，但它的应用也存在许多限制，主要包括∶(1)作用于进入过滤单元的细胞的剪应力太大；(2)系统的放大存在许多实际困难。操作细胞循环生物反应器时必须考虑两个因素，一是稀释率(流速／体积)；二是循环速率(指通过过滤系统的培养基速率)。稀释率的大小影响细胞的生长速率，不同的实验目的对稀释率的要求也不同；高的循环速率可使组分混合均匀，特别适用于细胞容易凝聚或成团的情况。但循环速率过高会使作用在细胞上的剪切力过高，也会导致过滤单元膜的迅速损坏。因此，很难同时确定合适的稀释率与循环速率，这也是限制细胞循环技术应用的一个重要因素。细胞循环技术可望获得高的体积生产率，这对产物的提取非常有利。近年来循环发酵技术已广泛用于生产细胞代谢物，如燃料酒精和有机酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用细胞循环发酵技术，重组大肠杆菌细胞干重达到145 g/L，其重组青霉素酰化酶生产率比分批培养提高了近10倍。对于活细胞即为所希望的产物的培养，细胞循环发酵也能发挥作用。如在食品工业中，为生产牛奶，奶酪和酸乳酪需培养不同的乳杆菌，采用细胞循环生物反应器可以很容易地提高这些生物体的的密度。在多种控制手段的帮助下，目前人们已经能很容易地获得超过100 g/L的细胞密度。但已有的研究结果表明，与最适生物量形成所对应的生长条件通常会导致较低的比生产率。例如，用细胞循环反应器生产2,3-丁二醇，生物量提高了大约6倍，但体积生产率只提高了2～3倍。同样，流加培养可以使链霉菌的细胞干重达到43 g/L，但蛋白酶活为零，而当细胞干重为18 g/L时蛋白酶活却高达3500 U/mL。我们在研究中也经常遇到类似问题。要解决这一问题，一方面应当研究如何促进重组蛋白的高效表达和提高重组菌株的稳定性，另一方面要研究与高细胞密度相关联的高水平产物的形成条件。引言：高密度培养技术 (High—cell—density cultivation，HCDC)，也就是高密度发酵技术，提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率 (单位体积单位时间内产物的产量 )不仅可以减少培养体积、强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高产品在市场上的竞争力。这一目的的实现，除了重组菌本身的表达性质外，还必须赋予重组菌生长和产物表达的最适环境条件，包括适宜的培养基组成、合适的培养温度、pH、稳定的比生长速率、适宜的溶解氧以及营养物的合理流加等。重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键技术是补料策略，也就是根据重组菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养物流加方式。碳源和氮源是两种常用的限制性基质，葡萄糖因细菌利用快且价廉易得，已广泛用作重组菌高密度发酵的限制性基质。大肠杆菌在过量葡萄糖或缺氧的条件下会发生“葡萄糖效应”，积累大量有机酸而影响重组菌的生长和外源蛋白的有效表达。因此大肠杆菌高密度发酵中，合理流加碳源使葡萄糖效应降低，是成功的关键。首先对重组Escherichia coli的高密度培养一文进行重点推荐/read.php?tid-2728-toread-1.html 该文从高密度培养过程中培养基成份及作用、高密度培养的过程控制参数、底物补料方式的种类及特点对重组Escherichia coli高密度培养进行了概述；并阐述了乙酸的生成机制和控制乙酸生成的策略；最后对重组Escherichia coli高密度培养及外源蛋白高表达进行了研究。知识点全，阐述细致全面，不愧为大肠杆菌培养者和学习者的不错选择，版主在此进行重点推荐 其次有很多会员对培养的相关问题进行了讨论，具体讨论话题及内容总结如下：问：请问大肠杆菌发酵中C:N怎么来控制啊？答：如果是在分批补料发酵中C含量控制在0.35-0.5%，N含量控制在0.07-0.15% ，经验之谈
问：请教大肠杆菌摇瓶发酵用的化学合成培养基都有哪些？
答：LB，SOB，SOC等，具体可以查阅分子克隆！
讨论1：大肠杆菌是否能利用乙酸作为碳源的问题讨论
问题：发酵过程中大肠杆菌在葡萄糖等碳源消耗完的情况下，能否利用其代谢产生的代谢副产物乙酸作为碳源？
回答1：不能啊，乙酸又不能进入TCA循环
回答2：大肠杆菌就怕产生乙酸影响代谢。
回答3：能利用其代谢产生的代谢副产物乙酸作为碳源，没有问题的。不知道楼上两位怎么会说不能利用。但是过高的乙酸对菌体生长不利
回答4：乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
看到过以乙酸作碳源进行大肠杆菌发酵的，但不是高密度发酵，且直接以乙酸作碳源（不加入任何其它碳源），而不是以代谢产生的乙酸为碳源。乙酸是不能直接进入TCA循环的，必须是被氧化后才能被利用。3楼的说能够利用其代谢副产物乙酸作为碳源，我也愿听其详，望不吝赐教！
除TCA循环外，还牵涉到乙醛酸途径和磷酸戊糖途径。但一般的大肠杆菌都是进行TCA循环，除了一些特殊菌种如lpdA基因敲除突变E．coli当TCA循环被抑制就会进行乙醛酸途径和磷酸戊糖途径。
回答5：我做的是大肠杆菌的基因工程菌，就是不能利用乙酸，要防止乙酸的产生，对于整个代谢有很大影响。
回答6：这个问题呢 大肠杆菌绝对是可以利用乙酸的。因为我做的就是关于大肠杆菌产乙酸的课题。当以葡萄糖为碳源时，大肠杆菌回产生乙酸。而当葡萄糖被消耗光以后， 大肠杆菌就可以利用乙酸来提供能量。这一点是肯定的
我在实验过程中还同时补加乙酸和葡萄糖，实验数据表面是可以利用乙酸的。
但是由于乙酸的可以影响大肠杆菌的生长和外源基因的表达，所以在以葡萄糖为碳源时，都采用限制流加方式来补料。
但实际上大肠杆菌是可以利用乙酸的。
回答7：具体的利用途径是乙酸首选被转化成乙酰辅酶A，然后可以进入TCA循环，同时也可以利用糖异生途径来和成其他氨基酸的前体。具体的途径可以查一下NCBI上面的文献。
回答8：可以吧，没有碳源的情况下，适量的乙酸应该还可以有利于生长的，所以发酵中，诱导前可以空耗一段时间。 讨论2：做大肠杆菌的高密度发酵时，以甘油作为碳源进行补料流加存在什么问题？
问题：通常以甘油作为碳源进行大肠杆菌的高密度发酵产生乙酸量少，比较容易获得高密度。除了生长速率较慢、菌体收率低，及甘油成本较之葡萄糖高之外，还有什么缺点吗？希望做过这方面研究或有这方面知识的朋友进来一起讨论。 回答1：做基因工程菌发酵，我们采用的是葡萄糖做为唯一的碳源，进行流加补料，如果采用甘油相对比较好，可以减少高密度发酵时，产生的乙酸。 甘油脱水酶不仅对氧敏感而容易失活,而且在有甘油存在时,它也会发生自杀失活，过高的甘油浓度会增加3.磷酸甘油(Ｇ3Ｐ)的积聚从而明显抑制菌体的生长，由于甘油浓度过低也不利于基因的转移形成。在采用甘油作为碳源，同时补加适量的葡萄糖作为菌体生长的优先碳源,以提高甘油的转化率。我们现在采用葡萄糖作为碳源，下步计划做加入适量甘油来减少乙酸产生的实验。回答2：高密度发酵当中，补料还得注意搅拌转速的问题。不同浓度底物流加对搅拌转速是不一样，我遇过这样的问题。讨论3：影响重组大肠杆菌发酵的主要因素有哪些？问题：大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。
回答1：一、代谢副产物-乙酸
乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
预防乙酸产生的措施：
1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生：
比生长速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等方法来降低比生长速率。
2、透析培养：
在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。
3、 控制葡萄糖的浓度： 葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上，以减少乙酸的产生。
常用的控制方法主要有：
恒pH法：大肠杆菌会代谢葡萄等产生乙酸，使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标，该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果，容易造成补料体系出错。
恒溶氧法：菌体代谢时会消耗氧，使溶氧下降，当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根据溶氧曲线补加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。 二、温度 大肠杆菌发酵最适温度是37 C，当温度最适菌体生长时，比增长速率将会增大。随温度上升细菌代谢加快，其产生代谢副产物也会增加。这些副产物会对菌体的生长产生一定的抑制作用。菌体生长过快也会影响质粒的稳定性。降低培养温度，菌体对营养物质的摄取和生长速率都会下降。同时也减少了有毒代谢副产物的产生和代谢热的产生。有时降低温度更有利于目的蛋白的正确折叠及表达。在重组大肠杆菌的发酵中不同发酵阶段其最适温度也不 同，为了能获得大量的目的蛋白，首先要保证菌体的量，因此在前期可优先考虑菌体的生长，到诱导阶段应将目的产物的表达放在首位。
三、培养方式
微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批3种。大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养，这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。
回答2：基因工程菌最重要的是
1、前期要里积累到一定的数量；
2、数量达到之后，要快速进行诱导；
3、升温之后，要保持一定的补料速率，控制乙酸的积累量，使DNA表达达到最大。
回答3：抑制本底表达至关重要！！！
因为是重组大肠，外源基因的表达对大肠杆菌的生长是有很大影响的，换句话说是有毒性的，只是毒性大小的问题，超过了承受范围结果可想而知，因此如何在添加诱导物前抑制本地表达非常重要！
解决方法：优化培养基，碳源的利用：葡萄糖&乳糖,故可以调整两者的比例实现本地表达的最小化.等到大肠长到具备抵抗力的成熟期就ok了,注意葡萄糖不要多否则后面的IPTG无法起到诱导的作用了!
讨论4：高密度发酵是不是都能实现？
问题：现在心中存在一个疑问：是不是大部分基因工程菌（大肠杆菌或者酵母），都能实现高密度发酵吗？？？？
或者上发酵罐的产量都能比摇瓶水平高吗？？？？？高多少才算正常呢？我听说一个说法：说一般发酵罐条件优化了，都会比摇瓶高50%以上，是真的吗？？？？
回答1：现阶段手上有一个菌种，真是尝试了各种各样的碳源，不同种类的氮源，它的酶活水平就是很稳定，在发酵罐上也调整了溶氧，控制pH，酶活最多只有20%的提高。真是很是郁闷，没有太好的思路
回答2：一般的讲，只要该微生物能高密度生长，则该基因工程菌就可以高密度发酵（除非构建的产物对细胞生长都毒害作用，这个情况很少，因为不会选择这种宿主菌） 至于大罐优化发酵的结果，一般都能提高产量或效价的，因为一般大罐的生长环境比摇瓶要好控制的多。但是结果区别很大，有的大罐发酵可以比摇瓶提高10倍，几十倍的。
回答3：细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于饥饿状态。 重组Escherichia coli的高密度培养及其过程控制参数由于Escherichia coli高密度培养能够提高单位体积的产量，利于下游的分离纯化。因此，Escherichia coli高密度培养是发酵生产追求的目标。目前，采用透析反应器培养E.coli K-12以及培养重组Escherichia coli生产PHB菌体浓度达到204.3g/L DCW。已发表的Escherichia coli最高菌浓为175.4g (DCW)/L。限制Escherichia coli高密度发酵主要是营养供给限制（包括溶氧供给不足），代谢副产物积累和发酵液流变学特性等因素的限制。高密度培养过程需要控制参数：溶氧在微生物培养时，必须不断地向培养液提供足够的氧，以满足微生物生长代谢的需要。在实验室中，可以通过摇床的往复运动或偏心旋转运动对摇瓶中的微生物供氧，而较大生产规模的培养装置则需采用无菌空气并同时进行搅拌的方式对微生物供氧，通风和搅拌的目的就是提供微生物生长和代谢所需的氧。由于微生物的新陈代谢与氧气呼吸有关，调节通气和搅拌可影响发酵周期时间的长短和代谢产物生成的高低，因而发酵液中的溶氧浓度是发酵过程中的一个需要调节控制的重要参数，在培养过程中有效而经济的供氧是极为重要的。工艺上主要的控制溶氧手段有以下几种:(1)改变通气速率(增大通风量)；(2)改变搅拌速度；(3)改变气体组成中的氧分压；(4)改变罐压；(5)改变发酵液的理化性质；(6)加入氧载体。温度由于微生物的生长和产物的合成代谢都是在各种酶的催化下进行的，而温度却是保证酶活性的重要条件，因此在发酵过程中必须保证稳定而合适的温度环境。温度对发酵的影响是多方面的，对微生物细胞的生长和产物的生成、代谢的影响是由各种因素综合表现的结果。pH值发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是发酵过程中重要参数，对微生物的生长和产物的积累有很大的影响。对于同一种微生物，由于pH值的不同，形成的发酵产物也会不同。发酵过程中pH值的变化情况:(1)在微生物细胞的生长阶段，由于所用的微生物菌种不同，相对于接种后的起始pH值来说，发酵液的pH值有上升或下降的趋势；(2)在生产阶段，一般发酵液的pH值趋于稳定，维持在最适合产物形成的pH范围；(3)在微生物细胞的自溶阶段，随着培养基中的营养物质的耗尽，微生物细胞内蛋白酶的积累和活跃，微生物趋于自溶，引起培养液中氨基酸等的增加，致使pH值上升。引起发酵液的pH值下降的主要原因有:(1)培养基中的碳/氮比不合适，碳源过多，特别是葡萄糖过量或者中间补糖过多或溶解氧不足，致使糖等物质的氧化不完全，培养液中有机酸会大量积累；(2)消泡油加得过多；(3)微生物生理酸性物质的存在。引起发酵液pH值上升的主要原因有:(1)培养基中的碳/氮比不当，氮源过多，氨基酸释放会使pH值上升；(2)生理碱性物质的存在；(3) 中间补料液中氨水或尿素等碱性物质加入过多。重组Escherichia coli高密度培养及外源蛋白高表达研究重组Escherichia coli的高密度培养的目的在于获得更高的目标蛋白单位体积产量。但是在重组Escherichia coli的高密度培养过程中，常常遇见的是高密度低表达现象，表达效率只有摇瓶的三分之一。实现外源蛋白在菌体高密度培养过程中高效率表达仍是工程重组菌发酵的研究热点。高密度培养下提高外源基因表达的策略(1)添加复合氮源菌体生长至高密度时，营养成分逐步耗尽。营养的缺乏也是限制高密度培养下实现高表达的因素。Shimizu等发现在表达阶段，限制蛋白胨和酵母抽提物的浓度，对外源基因表达不利，补料液中加大酵母抽提物比例可以提高外源蛋白的表达量。认为有机氮源提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，减轻了细胞代谢负担，促进了外源蛋白的表达。(2)利用代谢工程方法消除乙酸的抑制作用乙酸对菌体生长和外源蛋白表达抑制的机理通常认为是乙酸破坏了跨膜质子梯度，而跨膜质子梯度是氧化磷酸化和其它需能跨膜运输所必需。pH为中性时乙酸以HAc 和Ac－形式共存，Hac渗透过细胞膜，在细胞内（pH约为7.5）再分解为H＋和Ac－。由于不断渗透使胞外HAc和Ac－之间平衡向Hac移动，结果引起一个净电中性H＋内流，降低了胞内pH 。由于具有缓冲功能的培养基体积大，乙酸渗透不会导致胞外pH发生剧烈变化，因此胞内pH降低将产生去偶联影响。细胞自身的稳态机制需要能量以改变胞内pH降低趋势，即使质子推动力不发生变化情况下也是如此。因此为了快速生长，E.coli不仅需要一个大的质子电动势，而且需要维持最佳胞内pH。乙酸大量积累将加剧代谢去偶联的发生。也有报道认为乙酸等短链脂肪酸对DNA、RNA、蛋白质、脂质和肽聚糖等的合成均有抑制，而这些大分子物质是菌体生长和外源蛋白表达所必需的。目前，一些控制乙酸生成的方法正在被人们所研究，比如培养基优化法，有人以甘油代替葡萄糖作为碳源，实现了高密度培养；葡萄糖流加控制也是一种常用的控制乙酸的方法。为了减少或避免乙酸积累，已经发展了各种葡萄糖流加策略，流加方式主要有恒速流加、线性流加、指数流加等。利用代谢工程的方法改造菌种实现控制乙酸生成的手段也越来越被人们所重视。例如PTA和ACK代谢突变株的筛选。3)增强供氧能力溶氧（DO）是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中受很多方面因素的限制，而DO往往是最易成为控制因素。这是氧在水中的溶解度很低所致。在28℃氧在发酵液中的100%的空气饱和浓度只有7mg/L，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100%空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中的DO可在几分钟之内便耗竭，使DO成为限制因素。在工业生产中产率是否受氧的限制，单凭通气量的大小是难于确定的。因为DO的高低不仅取决于供氧，通气搅拌等，还取决于需氧状况。故了解溶氧是否够的最简便又有效的办法是就地监测发酵液中的溶氧浓度。从DO变化情况可以了解氧的供需规律及其对生长和产物合成的影响。生长过程中从培养液中的溶氧浓度的变化可以反映菌的生理生长状况。随菌种的活力和接种量以及培养基的不同，DO在培养初期开始明显下降的时间不同。一般在接种后1-5h内，这也取决于供氧状况。通常，在对数生长期DO明显下降，从其下降的速率可估计菌的大致生长情况。DO低谷到来的迟早与低谷时的DO水平随工艺和设备条件而异。二次生长时DO往往会从低谷处上升，到一定高度后又开始下降——这是利用第二种基质的表现。生长衰退或自溶时会出现DO逐渐上升的规律。值得注意的是，在培养过程中并不是维持DO越高越好。即使是专性好气菌，过高的DO对生长可能不利。氧的有害作用是通过形成O，超氧化物基O2-和过氧化物基O22-，或羟基自由基OH-，破坏许多细胞组分体现的。有些带巯基的酶对高浓度的氧敏感，好气微生物曾发展一些机制，如形成触酶，过氧化物酶和超氧化歧化酶（SOD），使其免遭氧的摧毁。次级代谢产物为目标函数时，控制生长不使过量是必要的。增加溶氧的方法有：①在通气中掺入纯氧或富氧，使氧分压提高；②提高罐压，这固然能增加溶氧，但同时也会增加溶解CO2的浓度，因为它在水中的溶解度比氧高30倍。这会影响pH和菌的生理代谢，还会增加对设备强度的要求；③改变通气速率，其作用是增加液体中夹持气体体积的平均成分；在通气量较小的情况下增加空气流量，DO提高的效果显著。但在流量较大的情况下再提高空气流速，对氧溶解度的提高不明显，反而会使泡沫大量增加，导致逃液。④提高设备的供氧能力（以氧的体积传质（简称供氧）系数KLa表示），从改善搅拌考虑，更容易收效。改变搅拌器直径或转速可增加功率输出，从而提高a值。另外改变挡板的数目和位置，使剪切发生变化也能影响a值。在考查设备各项工程参数和工艺条件对菌的生长和产物形成的影响时，同时测定改条件下的DO参数对判断氧的供需是大有好处的。(4)优化诱导条件及诱导方法在重组Escherichia coli高密度培养过程中，要达到重组产物的最大比生产率，还要考虑合适的诱导时间、诱导剂强度、诱导时的温度、诱导的培养基以及营养物的流加策略。
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好啊，虽然没有看完，投票一个先！！
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很不错，谢谢分享
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很好，留个记号
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楼主 强人啊
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谢谢楼主 不错不错
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谢谢楼主，资源不错
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谢谢分享嘻嘻嘻(ˇ_ˇ） 想～
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不错 ，，很全面
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感谢楼主分享经验。
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求教啊，大肠杆菌是兼性厌氧菌，为什么要摇床培养啊？
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赞一个。。。
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呵呵经验与人生的结合：）
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blowapc edited on
精辟。学习了。虽然对发酵工程不是很了解。。。
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不好意思请问什么是摇床实验，它的作用是什么？
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谢谢！大肠杆菌的检测都需要什么培养基啊？国内培养基的品牌有环凯，奥博星，海博，日水哪一种更适合于做大肠杆菌的检测？我用过日水的感觉挺好，不知道楼主有没有更好的推荐呢？
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信息很有用,谢谢分享
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很难得呀，谢谢！！！！！！！！
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谢谢楼主，还没来得及看，先收藏了哈
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楼主强人啊!分析的精辟
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受益匪浅，谢谢楼主！
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