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《中华细胞与干细胞杂志(电子版)》201６年第６卷第6期
…………李伟，朱莉，阮中宝，等
【摘要】　　【摘要】&目的&探讨Notch和NF-&B信号通路在动脉粥样硬化（AS）发病过程中的作用方式、两
…………丁海霞，王富军，黄晓伟，等
【摘要】　　【摘要】&目的&观察不同途径移植脐带血干细胞对兔2型糖尿病的治疗效果。方法&30只新西兰
…………王涛，罗强，张世荣，等
【摘要】　　【摘要】&目的&探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植对大鼠癫痫海马神经炎症的抑制作用。方法&em
…………陈惠云，王少珍，廖联明
【摘要】　　【摘要】&目的&观察水飞蓟宾对人肝癌（HCC）HepG2细胞迁移的作用。方法&采用MTT法观察水飞
…………刘璠，周慧敏，杨爱格，等
【摘要】　　【摘要】&目的&比较不同来源单个核细胞治疗2型糖尿病（T2DM）下肢血管病变的有效性及安全性。方
…………谢长峰，杜杰，曾桂芳，等
【摘要】　　【摘要】&目的&研究人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）对动物是否具有促瘤性，以及不同代次是否有致
…………余璞，龙海，霍金龙，等
【摘要】　　【摘要】&目的&通过分离扩增版纳微型猪骨髓间充质干细胞（BMSCs）观察传代对慢病毒转染的绿色荧
…………刘高米洋，和法莲，陈慧芬等
【摘要】　　【摘要】&目的&研究人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）体外模型中对胶质瘤细胞株U87荷瘤能力及其上
…………王萍，马予洁，王庆华，等
【摘要】　　【摘要】 抑制免疫调节检查点，比如PD-1/PD-L1与CTLA-4，是癌症免疫治疗的前沿科学。然而这样的免疫
…………张金梅，杨远荣，张学鹏
【摘要】　　【摘要】 脂肪干细胞（ADSCs）来源于脂肪，是一种多能性成体干细胞，它具有许多其他间充质干细胞所不
…………祝玲，路君，王水良等
【摘要】　　【摘要】 肿瘤免疫疗法是目前肿瘤治疗的研究热点，因其疗效显著而备受瞩目。免疫检查点阻断疗法是
编辑部主任
间充质干细胞(MSC)技术培训-9日细胞分离培养、细胞分化、间充质干细胞亚群特征及间充质干细胞前沿研究进展等;胚胎干细胞（ES）技术培训-23日hESCs最新研究进展、滋养层细胞的制备、hESCs的复苏、冻存、多种传代方法、无滋养层培养以及hESCs的定向分化诱导等;诱导性多能干细胞（iPS）技术培训-30日质粒转染、病毒包装、病毒滴度测定、重编程细胞的鉴定（体外实验及体内实验）、iPS细胞的体外培养及小鼠胚胎成纤维细胞原代取材等。神经干细胞技术培训敬请期待……独家揭秘：胎盘干细胞采集全过程！
& & & 到目前为止，还有很多人没有认识到胎盘干细胞的重要价值。作为一名科学迷，我自觉实在应该有必要为大家普及一下胎盘干细胞的相关知识！& & & 胎盘干细胞来源于新生儿胎盘组织，其功能类似于胚胎干细胞，但无成瘤的风险和伦理道德的限制，它能分化形成200 多种类型的人体组织器官细胞。也就是说，胎盘干细胞可以在人体出现重大疾病，比如身体的某些组织器官损伤、病变，需要进行移植或修复时，可以将已有的胎盘干细胞进行定向培养成所需要的人体组织细胞，用于疾病的治疗。这样，诸如脑瘫、肝硬化、急性心肌梗死、多发性硬化等难治性疾病，就有法可医了！这是人类的重大发现，世界上已有多位科学家早已着手研究，今年的诺贝尔奖也被干细胞研究学者收归囊内。& & & 现在，国内已经出现专门保存胎盘干细胞的机构。如何来评定干细胞保存机构的水平呢？高端的干细胞库是要通过国际AABB标准认证的，这是国际上的最高标准，除了能保证存储的干细胞的质量外，也为将来干细胞治疗提供了更可靠和全面的保障。通过AABB标准认证的干细胞库所提供的干细胞可以在全球任何一家开展干细胞治疗的医院里使用，这样就没有国家或地域的限制，病患在疾病治疗时也多了选择的机会。所以，不仅保存胎盘干细胞很重要，选择一个好的胎盘干细胞存储机构更能为将来干细胞的治疗解决很多后顾之忧。说了这么多，胎盘干细胞倒底是如何进行采集的呢？下面我就把所查找到的信息跟大家分享一下吧。& & & 一、当孕妇有分娩征兆入院时，要第一时间通知干细胞库工作人员，他们会将准备好的专业采集用品运到分娩医院，并会与医务人员交接好采集注意事项，在新生儿娩出、胎盘剥离子宫排出后，由接生的医务人员在短短几钟内，按照干细胞库胎盘标准采集规程将完好的胎盘进行清洁并放入无菌的装置中，倒入胎盘保护液来保证不受细菌污染，然后放置在专业的采集箱内。
&&& & & 二、专车运送胎盘是必不可少的，因为必须在24小时内将胎盘运送到干细胞库，整个运输过程非常关键，对温度有很严格的要求，最佳的运输温度是2-24℃，过高或过低都有可能影响到胎盘干细胞的质量！2010年3月发生的甲流疫苗失效事件的重要原因即在运输过程中，温度的变化导致疫苗的失效，引起极大的危害。同样，胎盘在运输过程中也可能存在着这样一个问题，我了解到有一种可以实时监控温度的BACCS系统，它可以监控运输过程中每一分钟的温度状态，导入电脑后能形成运输中的温度参数，确保运输安全。
&& & & &三、当胎盘运达干细胞库后，工作人员会仔细核对采集信息及检查样本，这步也很关键，因为一旦胎盘信息发生错误或是错乱，将会造成几乎不可挽回的后果。所以干细胞库工作人员在接到孕妇入院的电话后，就会为这位孕妇的采集装置上配有独一无二的身份信息，来确保不会发生样本混淆。
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Oct-4在精原干细胞定向诱导分化中的表达
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&&目的：检测Oct-4在小鼠精原干细胞(mouse spermatogonial stem cells,mSSCs)体外诱导分化中的表达。方法：①体外培养mSSCs;②用干细胞因子(SCF,stem cell factor)对mSSCs进行精母细胞方向诱导分化;③通过形态学观察和c-kit,GCNF间接免疫荧光染色鉴定mSSCs是否发生分化;④通过间接免疫荧光染色和RT-PCR分别从蛋白水平和mRNA水平检测Oct-4在mSSCs诱导分化前后的表达情况。结果
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你可能喜欢一种定向诱导鸡胚精原干细胞分化为成骨细胞的方法
专利名称一种定向诱导鸡胚精原干细胞分化为成骨细胞的方法
技术领域本发明涉及鸡胚精原干细胞分化为成骨细胞的方法，属于细胞工程
背景技术 鸡精原干细胞(SSCs)具有分化的多能性，在体外培养过程中加入合适的诱导分化剂可以诱导出所需要的特殊类型细胞和组织，从而引起了人们的极大关注。目前人们对干细胞诱导分化为成骨细胞的研究多限于在哺乳类动物(大鼠、小鼠)，Gopalakrish.V等利用鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导为成骨细胞，Deliloglu-gurhan从分子水平研究BMSCs诱导成骨细胞的内在机理；张维成、丁亮华等分别利用大鼠和人的骨髓基质干细诱导成骨细胞，均获得了成功。
但是对家禽SSCs的研究目前还处于起步阶段，鸡胚SSCs的研究多见于分离方法、提取纯化，获得鸡精原干细胞，多种细胞因子离体培养，SSCs冷冻保存以及SSCs或睾丸组织移植等方面，而对其体外诱导分化为多种细胞的能力的研究尚未见有报道。本实验目的旨在研究鸡胚SSCs体外定向诱导向成骨细胞分化的能力，为探索精原干细胞(SSCs)的临床应用价值和多能性提供素材。
本发明的目的是提供一种定向诱导鸡胚精原干细胞分化为成骨细胞的方法，将所提取获得的鸡精原干细胞，通过研究对鸡精原干细胞进行体外诱导培养，获得有效的诱导成骨细胞的方法，为诱导后对其继续进行体外扩增培养并应用于临床实验，使其成为一种成熟的技术。
本发明的技术方案是一种定向诱导鸡胚精原干细胞分化为成骨细胞的方法，其特征是将所提取获得的鸡精原干细胞接种于无饲养层培养瓶内，利用条件培养液进行诱导培养，所述培养液为DMEM高糖培养基中含有10％小牛血清、2％的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/L β-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、10-7mol/L地塞米松、0.01mol/L β-磷酸甘油钠、0.05g/L维生素C。
本发明工艺先进简单，无需专门的仪器设备，只要掌握细胞培养的基本操作规则，简便易行。通过研究干细胞具有分化潜能的多能性为探索精原干细胞(SSCs)的临床应用价值和多能性提供素材，对诱导后的成骨细胞进行体外继续扩增培养并应用于临床实验，使其成为一种成熟的技术，实施细胞替代疗法，为最终实现组织器官的再生和替换提供可能，并借此希望找到一条建立大规模生产所需细胞平台的途径，进而为发育生物学、医学、遗传学领域开拓一个崭新的研究前景。本发明所采用的诱导方法也适用于其它禽类的精原干细胞的诱导研究，且可操作性强。
图1、图2为经ALP染色后的成骨细胞图片；图3、图4为经Von kossa’s染色后的成骨细胞图片；图5、图6为免疫组化(I型胶原)染色后的成骨细胞图片。
具体实施例方式
步骤1鸡胚SSCs的分离与纯化取孵化16-19天鸡胚胎，无菌获取鸡睾丸。经胶原酶(1mg/ml)消化，后用胰蛋白酶(0.25％)消化，以获取生精上皮上的SSCs、支持细胞和间质细胞等，后经350目过滤筛过滤、percoll梯度离心、贴壁速度差，以获取较高纯度的精原干细胞，用台盼蓝染色计数，调整细胞密度为1x105个/ml，接种于6孔培养板，置于38℃、5％CO2培养箱中培养。
步骤2鸡胚SSCs的离体诱导培养SSCs培养3-4天后，用预热的条件诱导液(基础培养基+10-7mol/L地塞米松+0.01mol/L β-磷酸甘油钠+0.05g/L维生素C)进行半量换液。以后每24小时观察，每72小时全量换液。观察时随机抽取10个非重叠视野(×100)，计算成骨细胞占SSCs细胞数的比例。(表1)步骤3碱性磷酸酶(ALP)改良钙钴法对鸡SSCs在体外条件诱导剂培养3周左右，弃去诱导剂，置固定液中固定8-10分钟，蒸馏水冲洗3次。置基质液中，37℃孵育4-6小时。取出滴加数滴硝酸钴，作用5-7分钟，PBS冲洗。滴加20g/l硫化铵数滴，作用5-8分钟，PBS冲洗。伊红复染5分钟，冲洗，晾干，镜检。
碱性磷酸酶(ALP)改良钙钴法鉴定结果在显微镜下观察经ALP染色后的成骨细胞，其细胞胞浆内有黑褐色颗粒或块状沉淀，即ALP染色呈阳性。观察发现有的细胞融合成大片状，细胞间隙难以区分，也有许多以单个细胞形式存在，细胞核很明显(见图1、2)。
步骤4钙结节Von Kossa’s法对鸡SSCs在体外条件诱导剂培养3周左右，弃去诱导剂，PBS冲洗，于95％的乙醇中固定8-10分钟，PBS冲洗，5％硝酸银常温避光15分钟，紫外线照射15-20分钟，蒸馏水冲洗，5％硫代硫酸钠中2-3分钟，蒸馏水冲洗，伊红染液复染3-5分钟，冲洗，晾干，镜检。
钙结节Von Kossa’s法鉴定成骨细胞结果在显微镜下观察经Vonkossa’s染色后的成骨细胞，可清晰看见钙盐沉积区域即结节呈黑色，其黑色沉淀物分布于细胞的形成基质中(见图3、4)。
步骤5免疫组化I型胶原(Collagen I)鉴定将已诱导4周的成骨细胞弃去诱导液，用固定液(冷丙酮∶无水乙醇＝3∶2)固定1小时，PBS冲洗，加入过氧化物酶阻断液阻断内源性过氧化物酶8-10分钟，加入5％BSA封闭液15-20分钟，加入Collagen I单克隆抗体，37℃水浴1小时，PBS冲洗，加入二抗(生物素标记)，室温孵育15-20分钟，蒸馏水冲洗，加入链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)溶液，室温孵育15-20分钟，冲洗，DAB显色，晾干，镜检。
免疫组化I型胶原(Collagen I)鉴定方结果定向诱导后的细胞经SABC法染色后，细胞呈棕褐色，表明鸡胚SSCs定向分化为成骨细胞，并且分泌I型胶原，呈阳性反应(见图5、6)。
SSCs诱导分化为成骨细胞结果Table 1 The differentiation rate of induction of osteoblasts (n＝10)
注字母d表示孵化天数，字母ab之间表示差异极显著(P＜0.01)。
1.一种定向诱导鸡胚精原干细胞分化为成骨细胞的方法，其特征是将所提取获得的鸡精原干细胞接种于无饲养层培养瓶内，利用条件培养液进行诱导培养，所述培养液为DMEM高糖培养基中含有10％小牛血清、2％的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、10-7mol/L地塞米松、0.01mol/Lβ-磷酸甘油钠、0.05g/L维生素C。
本发明公开了一种定向诱导鸡胚精原干细胞分化为成骨细胞的方法，属于细胞工程技术领域。其特征是将所提取获得的鸡精原干细胞接种于无饲养层培养瓶内，利用条件培养液进行诱导培养，所述培养液为DMEM高糖培养基中含有10％小牛血清、2％的鸡血清、2mmol/L L－谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10
文档编号C12N5/06GK
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者李碧春, 孙国波, 陈国宏, 吴信生, 赵文明, 徐琪, 葛剑辉, 魏彩霞, 戴建明, 孙鹏翔 申请人:扬州大学工艺技术书店24、一种定向诱导鸡胚精原干细胞分化为成骨细胞的方法
开&&&&&&本：页&&&&&&数：字&&&&&&数：I&&S&&B&&N：售&&&&&&价：280.00元 品&&&&&&相：运&&&&&&费：北京市丰台区
至快递：0.00元上书时间：购买数量：（库存20件）微信购买商品分类：关 键 字：详细描述：正版光盘&，专利文献技术光盘资料，纯文字叙述，里面详细介绍了关于这一项的关键技术。详细内容：1.技术名称2.技术摘要.技术背景.技术领域.方法内容3.具体实施方式.均属于专利技术光盘资料.&客服QQ:&&款到发货
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