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异体肌腱移植的实验研究与临床应用
&&作者单位：南方医科大学南方医院创伤骨科　广州　510515&注：本文发表于《异体肢体移植》人民卫生出版社，2009年5月　第1版　&肌腱损伤较为常见，而肌腱缺损约占手部肌腱损伤的25%。单条肌腱缺损的修复，目前仍以自体肌腱移植为主。但对于多条肌腱及多段肌腱缺损的患者，由于自体肌腱供体来源有限且影响取材部位的外观与功能，组织工程人工肌腱移植虽已有成功应用的报道，但其材料和受体肌腱愈合等问题短时间内还无法完全解决，尚难以真正应用于临床。自上世纪80年代起，随着对异体组织制备与保存方法的改进以及检测手段的提高，使异体肌腱在临床上取得与自体肌腱移植相似的效果，并且具有来源充足、取材方便、手术时间短、可避免造成患者机体原有的结构与功能损伤等优点，是目前修复该类肌腱缺损较为理想的方法。目前国内外学者已对异体肌腱移植进行了大量的研究，对异体肌腱的获取、保存、处理、移植后的实验效果、临床应用和预后等方面进行了广泛的研究工作，使异体肌腱移植技术日臻完善，为临床进行异体肌腱移植提供了理论支持与应用经验。一、异体肌腱移植的历史最早关于异体移植的报告是在1881年，此后相继出现了一些关于异体组织保存方法的报告。Inclan于1942年报告了世界上第一个骨库用于储存骨与肌腱。20世纪50年代早期骨库开始在美国广泛建立，并于1976年创立了美国组织库协会，简称（AATB）。1959年Peacock首次报告了新鲜异体肌腱移植，由于移植是未经处理的新鲜异体肌腱，结果发生了明显的炎症反应和排斥反应。由于免疫排斥反应问题未能解决，使得本项工作尚未能取得突破性进展。为降低异体肌腱的抗原性，人们曾先后采用三氯甲烷浸泡、乙烯氧培养、脱氧鸟苷培养、γ射线照射等方法处理，但都存在处理复杂、不易贮存、对肌腱造成损害等缺点，难于推广应用。后来发现深低温冷冻或冷冻干燥保存可明显降低肌腱的抗原性，在此基础上Peer于1955年首先创立了同种异体肌腱深低温冷冻或深低温冷冻干燥处理后进行移植的实验研究，取得了与自体肌腱移植相似的结果。1967年Peacock和Madden再次报告了12例临床异体肌腱移植取得了70%的成功率。1976年Friedlaender在兔身上使用冻干异体骨移植，未发现明显的免疫反应，他认为深低温冷冻干燥方法处理的异体骨破坏或改变了细胞膜表面存在的HLA抗原成分，从而抑制了免疫反应的发生。20世纪80年代，Minami等作了两株纯系鼠异体肌腱移植实验，并通过补体依赖性细胞毒实验和吸收实验，确定了异体肌腱的抗原性主要存在于其腱细胞上，主要是组织相容性抗原（HLA），并发现反复冻融和多聚甲醛处理后的腱细胞抗原性明显降低，因此推测抗原性的降低是由于改变了细胞膜上的组织相容性抗原。国内关于异体肌腱移植的研究与应用开始于20世纪90年代初。张友乐、杨克非等先后对深低温冷冻的异体肌腱和冷冻干燥异体肌腱移植进行了实验研究并应用于临床，取得了良好效果。高新生与张友乐建立了应用深低温保存方法储存异体肌腱的肌腱库。1996年胡必寺、顾玉东进行了腱鞘内异体肌腱移植。1999年张友乐、王澍寰、高新生等开展了带鞘管的异体肌腱移植，探索复合异体肌腱移植修复屈肌腱II区肌腱缺损的方法，建立了无粘连修复屈肌腱II区的动物模型，并成功应用于临床，初步解决了屈肌腱II区肌腱缺损无法修复的技术难题。唐林俊等采用冷冻、冻干及化学等方法同时用脱氧鸟苷培养处理鸡趾肌腱，在降低肌腱免疫性的同时，不影响腱细胞存活及腱抗张强度，取得了与自体肌腱移植相似的实验结果。二、异体肌腱的来源、制备与贮存（一）异体肌腱的来源及选择供体的来源主要为健康尸体志愿捐献者以及外伤截肢无条件再植的废弃肢体。合格供体应具备阴史和阴性的感染监控资料，经微生物学、血清学（包括HIV、HBV、HCV）检测，病理组织检查均为阴性。在无菌室对供体进行严格的消毒，切取肌腱时尽可能保留其腱旁组织，肌腱长度尽可能长（达15~20cm），并用生理盐水漂洗 2~3次。细菌与病毒感染、病原体通过肌腱移植传播是异体肌腱移植需要解决的重要问题。1992年Simonds报告了通过异体组织移植传染的HIV-1型病毒。1994年Barrios等检测987份-80℃保存的异体组织，细胞污染率达6.6%，其中80%是革兰阳性菌。1997年Sanzen发现经深低温冷冻方法处理的异体骨移植仍然可以传染I型人类T-淋巴细胞病毒（HTV-I）。异体移植物移植前用抗生素浸泡也可以达到一定的灭菌作用，胡蕴玉在骨库的质量监测中，测试未经抗生素液冲洗的移植物，约40%被细菌污染；经抗生素液冲洗后，细菌培养约80%转阴性。目前世界各国肌腱库用来控制病原通过肌腱移植传播的方法主要有：①严格的供体筛选和检测措施，包括全面的体检，对肌腱供体进行血清学检查（包括爱滋病毒HIV、乙型病毒HBV、病型病毒HCV检测）、病理组织检查，一旦出现阳例，该供者所有样本都将被抛弃；②异体肌腱的取材、处理、保存、运输的无菌操作；③在保存期间用环氧乙烷或γ射线对异体肌腱进行二次灭菌；④移植前用庆大霉素生理盐水浸泡处理。采用上述方法可以保证移植的异体肌腱不被污染及传播疾病。由于现阶段HIV的检测主要限于抗体水平，在供者遭受感染而未出现抗体的“窗口时期”即不能被检出。为彻底杜绝疾病传播，国外许多组织库还对标本用环氧乙烷或60Co照射处理。早期应用环氧乙烷具有很强的穿透力，能有效地杀灭真菌、细菌和病毒。但环氧乙烷的代谢产物氯乙醇相当于半抗原，可和体内其它蛋白结合引起排异反应，导致移植物的破坏，且这两种物质也是很强的诱变剂，故目前很少使用。（二）异体肌腱的制备与贮存为了避免因病原微生物感染和免疫排斥反应引起的负面作用导致异体肌腱移植失败，在进行移植之前，有必要对异体肌腱进行物理和化学处理，提高移植的安全性，减少移植的副作用。自从本世纪50~60年代以来，许多学者就对同种异体肌腱的制备与贮存进行了多方面的尝试，致力于寻找一种既能长期保存，又能显著降低抗原性，且对其原有生物学性能无明显影响的方法。目前异体肌腱的制备与贮存方要有3类方法，即深低温新鲜冷冻、深低温冷冻干燥和化学处理。1、生物材料的低温保存技术在异体肌腱移植的研究中，需要探索并改进肌腱的保存方法，使其既可以降低肌腱的抗原性，又可以保存异体肌腱的生物学活性。低温生物医学技术是由多学科间相互协作和渗透而发展起来的，它的研究对象是温度这一物理量的变化对生物体产生的影响。温度降低会引起细胞溶液产生冰晶、溶液浓度升高等变化，若控制不当会导致细胞内液外渗，细胞死亡。因此在生物学材料的保存过程中，需要采取干预措施，减少细胞的死亡，保持材料的活性。深低温冷冻方法目前已经成为异体肌腱移植材料的主要处理方法，在美国骨库的异体骨和肌腱的抗原处理中应用广泛。美国组织库协会对全美42家组织库进行问卷调查，发现其中33家采用深低温冷冻法处理异体骨和肌腱，7家应用冷冻干燥法处理的异体骨和肌腱。冷冻温度从-40~-150℃，绝大多数使用的温度为-70~-80℃，有5家可以提供液氮处理的异体骨和肌腱。荷兰的一个中心骨库，在年间用于异体移植修复肌腱与韧带损失的异体移植材料全部采用深低温冷冻法处理。1）低温生物冻存技术　指将活的生物体在冷冻过程中加入冷冻保护剂（甘油或二甲基亚砜等），采用特殊的方法冷却至低温并长期保存；待需要时可将生物体按特殊的方法加热至正常温度仍获得活的生物体。特殊的降复温程序一般都是慢冻、速融。目前深低温保存红细胞、精子均可获得较高的存活率。生物体在降温和复温的过程中极易受损而死亡。在此过程中包括三个主要的物理化学过程，即液体的固化、固化后的溶化和水分通过细胞膜的渗透过程。由此引起的溶液中冰晶形成和生长、冰晶的再结晶、高渗压应力和溶液的高浓度毒性等因素均会损伤细胞。因此，若不进行特殊的控制，绝大多数生物体在经历低温时都会因损伤而死亡。低温损伤主要发生在降温和复温过程中的结冰、融冰、再结晶，这种损伤主要发生在0℃～-60C即“危险温度区”。为了保存组织的活性，在进行低温冻存时，应采用保护措施，主要有低温保护剂和控制降温的速率。低温保存细胞时，冷冻保护剂可以均匀充分地和细胞相接触，保护效果好。对组织而言，保护剂只能作用于其表面，对深层细胞无法起到保护作用。为了提高组织的存活率，应同时控制降温的速率。控制降温速率的慢速降温可以使细胞外溶液中的水结冰，导致细胞外溶液浓度升高，胞内水向膜外渗出，在达到一定温度时，将组织置于深低温冰箱或液氮中冻存，可以减轻细胞内结晶对细胞的损伤，保持细胞的活性。采用计算机控制的慢速降温能够更加有效的保护组织中细胞的活性。2）肌腱制备的冷冻速率与复温　慢速冷却低温保存法是目前较为常用的生物体保存方法，其工作程序为：先将细胞放在含有抗冻剂的溶液中进行预处理，接着用程序降温仪将细胞连同溶液以较慢的速度降温。首先是细胞外溶液中的水份结冰使溶液的浓度升高，细胞内的水份透过细胞膜向外渗出，细胞体积收缩，细胞内液的浓度与渗透压增加，冰点下降；随着温度的下降，上述过程继续进行，到一定的温度时迅速降低到-80℃（干冰温度）或-196℃（液氮温度）结冰，并在此温度下长期保存。在零下某一温度结冰时，先是凝结成小冰晶，细小的冰晶对细胞损害较少，但小冰晶表面势能大，往往互相结合成大冰晶。该现象易发生在-30℃~-40℃。大冰晶破坏细胞结构，使细胞坏死。即使小冰晶在冷冻过程中末完全形成大冰晶，在复温过程中也会结成大冰晶，同样导致细胞死亡。不同的细胞要求不同的降温速率，速率过快则在细胞内形成冰晶，在复温过程中细胞内冰晶会产生再结晶，而使细胞损伤。若降温速率过慢，会导致细胞收缩剧烈，并且细胞较长时间处于高渗溶液中也同样会造成细胞的损伤。降温的过程是传热与渗透两个因素相互作用的过程，所谓的最佳降温速率是指这两个因素的最好配合。&& 　为了防止在冷冻过程中对肌腱组织的损伤，掌握与控制冷冻温度的速率及复温相当重要。目前实验数据认为：冷冻降温速率2℃／min，降至4℃后维持20min，再继续将上述速率降至-40℃，维持20min，转入-80℃低温冰箱保存。采用20℃速率快速复温。应用计算机控制降温方法处理的肌腱，其细胞数量明显高于直接一次性降温的比率。目前，肌腱处理方法与模式已基本以此为依据。3）异体肌腱处理过程中防护剂的应用　低温防护剂的工作原理是由于冷冻保护剂提高了细胞内外溶质的浓度，减少了降温和复温过程中细胞内外出现玻璃化现象，减少细胞内大量小冰晶和大冰晶的形成，保护细胞膜的完整性和生物大分子的功能，从而降低对细胞的损伤，使肌腱在处理过程中存活尽可能多的细胞。目前冻存处理的低温防护剂很多，一般可分为可渗透性防护剂和不可渗透性防护剂两大类。前者主要有二甲基亚砜（dimethlsulfoxide，DMSO）、甘油（glycerd）、丙二醇等，后者主要有蔗糖、右旋糖苷、白蛋白等。可渗透性防护剂可渗入细胞内，与细胞内水分子结合，并通过氢键与细胞内大分子结合，从而减少细胞内游离水，增加细胞内液的粘滞性，在冷冻处理时使细胞产生较少的冰晶，减弱冰晶对细胞和细胞内生物大分子的破坏作用。不可渗透性防护剂增加细胞外液的渗透压使细胞内的游离水向细胞外转移，减少细胞内的冰晶形成，并对细胞膜有稳定作用。一般认为防护剂浓度越大，对降温速率的要求越低，冰晶的形成越少，越有希望达到玻璃化状态，对细胞的保护作用越好。不同实验证实，作为细胞的低温冷冻剂，DMSO和甘油的效果是肯定的，其中以10％～15％的浓度最为常用；由于DMSO的作用机制较为复杂，毒副作用较大；而甘油的结构简单，毒副作用小，更适合异体肌腱的冷冻处理。在其复合的防护剂中加入了MEM液，其中的大分子蛋白增加了低温防护作用，较单独应用甘油为低温防护剂的作用更为明显。2、深低温冷冻新鲜异体肌腱的制备与贮存新鲜冰冻是将在无菌条件下获得的异体肌腱直接置于-40℃~-196℃的低温下保存，不添加任何物质，术前融化，直接用于移植。其具体方法为：新鲜肌腱取材后经生理盐水漂洗，浸泡在MEM液（含10%小牛血清）或1640营养液中10~15min，然后置于无菌容器内密闭封装，贴标签记录取材日期、肌腱类型等项目。标记后置于可控深低温冰箱中，逐步降温至-80℃，或逐步降温至-196℃，10d后可作移植用。由于降温过程中的冰晶形成和细胞内外理化环境的改变，移植物中的细胞成份大多在冻、融过程中死亡。该种处理方法获得的基本上是一个无活细胞、低抗原性支架材料。3、深低温冷冻干燥异体肌腱的制备与贮存冷冻干燥是一种综合性的操作方法，其基本原理是使冰冻物质中的水份或其它蒸气压力较高的物质，在低温真空中升华而使样品干燥，这种方法目前已成为若干不稳定物质特别是蛋白质的一种良好保存方法。其具体方法为：肌腱经生理盐水漂洗后，浸泡在含10%甘油与MEM混合液中10min，然后置于无菌容器内密闭封装，贴标签记录取材日期、肌腱类型等项目。标记后置于-80℃可控深低温冰箱中冷冻，10d后取出置于-45℃/105Pa的真空冷冻干燥机内进行干燥处理，24h后肌腱约保留5%水分，再置于密封避光4℃保存即可作移植用。50年代开始，即有人开始研究和制备同种异体组织如皮肤、骨骼、肌腱用于临床，并发现冻干法可以基本上保存组织原有的形状、结构，且移植后免疫反应较新鲜对照组明显减轻。但冻干需要在冰冻干燥机中处理10~20d，术前需水化24h，如果水化不充分，则可能引起胶原断裂。但亦有研究发现，冻干处理后的移植物力学性能下降。Indelicate于1990年比较新鲜冷冻和冷冻干燥韧带异体移植重新前交叉韧带，经过2年的观察，未发现排斥反应，膝关节功能恢复与自体移植效果相当，但新鲜冷冻的韧带异体移植效果好于冷冻干燥的异体移植。4、化学处理异体肌腱的制备与贮存化学处理异体肌腱主要是采用化学物质，如戊二醛、丝裂霉素C、三氯甲烷/甲醇（CM）混合液、脱氧鸟苷培养液及95%乙醇等进行浸泡处理，其目的在于去除细胞成份、降低抗原性，获得一个天然的胶原支架。如采用CM混合液处理异体肌腱，则在无菌操作下切取肌腱后，立即浸入CM（1﹕1）混合液中，25℃浸泡36h，然后置入含有0.01mol/L乙二胺乙酸、0.01mol/L碘乙酸、0.01mol/L叠氮钠及pH = 7.4的磷酸缓冲液中，于4℃浸泡 24h，取出后置在－4℃下真空冷冻干燥 8h，环氧乙烷消毒，聚乙烯分袋封装备用即可。采用95%乙醇浸泡处理肌腱是一种简单易行的方法，可先浸泡在95%乙醇中96h后取出，再浸泡于75%的乙醇中备用即可。杨文龙等实验表明，用95%乙醇浸泡的异体肌腱，在移植后2~3周，腱连结处已被新生毛细管、成纤维细胞及间充质细胞连接，移植后4周成纤维细胞成熟，穿插于移植细胞之间，缝合处已愈合；移植后6周成纤维细胞肌腱长轴长入异体腱束间，缝合端组织结构同正常腱组织，周围仍有成纤维细胞增长，表明应用95%乙醇浸泡的异体肌腱在临床上修复肌腱缺损的可行性。Minami认为异体肌腱多聚甲醛处理可明显降低抗原性，而唐林俊等在用多聚甲醛处理的肌腱作异体移植，出现强烈的炎症反应，移植结果和新鲜异体肌腱无明显差异。Tauro等（1987）用CM液处理异体肌腱，认为可移除肌腱内的细胞及绝大多数基质成份，明显降低抗原性而对其原有的力学性能无明显影响。但有人指出化学处理毒性物质可能对受体及操作人员造成潜在的毒害。Zimmerman等（1994）认为，经化学处理的细胞，死后产生碎片及炎性物质可导致移植物的排斥反应和炎性反应，他们采用渗透增强技术（Permeation enhanced，PE）和据称无害的化学物质，在破坏细胞成份的同时，能更充分地移去其碎片，更显著地降低抗原性，移植后6个月，未发现类似CM处理肌腱引起血管壁增厚的慢性炎症现象。（三）异体肌腱的消毒组织在保存期间易受细菌污染，病毒就更不能被常规方法灭活，较为稳妥的方法是二次灭菌。常用有灭菌方法有高温、环氧乙烷和γ射线照射，但经物理和化学方法处理后的异体肌腱对移植效果会产生一定的影响。高温因使胶原变性不适用于肌腱灭菌，环氧乙烷处理的肌腱因其残留有毒物质而产生滑膜炎等并不适用于临床应用。Silvaggio等发现经环氧乙烷处理后的异体肌腱移植时，环氧乙烷残留物可引起由白介素I（IL-I）介导的局部炎症反应，导致移植的失败。γ射线照射穿透力强，是一种安全有效的消毒方法，可通过破坏DNA杀灭病毒，目前已广泛使用。但用多大剂量照射才能既达到灭菌，又不破坏组织结构尚有争议。60Co剂量取决于两方面的因素：（1）必须完全达到灭菌的目的，包括杀灭HIV和病毒；（2）必须保证肌腱有足够大的机械强度。剂量过大会破坏胶原纤维，影响移植肌腱的力学性能，故国际原子能机构推荐使用2.5Mrad作为医疗产品的标准灭菌剂量。目前大部分异体肌腱组织库仍使用1.5~2.5Mrad作为标准剂量。但有报道2.5Mrad剂量并不能完全杀灭活HIV病毒，PCR检测仍能发现HIV的遗传物质。Fidller等提出3.0~3.5Mrad能完全杀灭HIV。Schwartz 等采用自身对照对18头山羊双侧前交叉韧带重建，实验侧采用经4 Mrad剂量的γ射线照射处理的异体髌腱，对照侧采用冷冻的异体髌腱。术后6个月实验侧的移植肌腱强度与承受最大应力均差于对照组。作者认为，4 Mrad剂量的γ射线照射处理虽可杀灭病原体，但影响异体移植肌腱的生物力学特性，因此并不适于临床应用。Goble等研究发现应用辐射方法处理会使冷冻异体半月板移植的失败率增加。Toritsuka比较新鲜冷冻、干燥冷冻、新鲜冷冻加γ射线照射、干燥冷冻加γ射线照射四种方法处理的异体肌腱的移植效果。发现后三组异体肌腱移植后移植物降解的速率明显快于新鲜冷冻的异体肌腱，干燥冷冻加γ射线照射方法处理的异体肌腱在移植后降解的速率最快。Kerboull L研究发现，冷冻干燥加γ射线方法处理异体肌腱对移植物的破坏性最大，不适于作为移植材料应用于临床。化学处理、冷冻干燥、低温保存均能显著地降低移植物的抗原性，且低温新鲜冷冻及冷冻干燥保存法对移植物中所含的高分子聚合物，如蛋白多糖、糖蛋白成份等无明显影响，这些物质对细胞的增殖、分化、迁移及移植物的磨造均产生重要影响，但新鲜冷冻、冻干及化学处理的移植物均是一种灭活组织，其主要起支架作用，完全依赖于外源性的血管及成纤维细胞对其进行爬行替代，针对象骨骼这样的支持性组织来说，移植物后功能影响不大，而对肌腱这样的需要良好的滑动性能的组织来说，爬行替代将会引起严重的粘连，尤不适合于手部屈肌腱的移植，而冷冻保存处理的肌腱在降低抗原性的同时，保留大部分主体细胞的存活，移植物在血运尚未建立之前，可依靠周围的组织液，淋巴液及滑液提供营养，维持浅层细胞的存活，增强内源性愈合能力，相对减少外源性愈合的参与，同时，移植腱原有的生物力学及组织学特性得以较好地保持，有利于早期功能锻炼，更进一步减少粘连。三、异体肌腱移植后的生物学过程肌腱组织是一种致密的结缔组织，由腱细胞、腱基质及胶原纤维束组成，胶原纤维束的排列有特定的轴向、长度和密度，腱细胞具有分泌基质及胶原的功能，最大限度地保留移植异体肌腱的生物学活性，是异体肌腱移植基础研究的关键课题。许多学者的研究表明，无论是异体还是自体肌腱在游离移植时都作为一个整体存活，并通过修复过程重建，但异体肌腱移植后的修复过程要比自体肌腱复杂。因此，在这个过程中存在着免疫反应导致大量炎性渗出及组织代谢水平不一等生物学特点。（一）异体肌腱移植的细胞转归传统观点认为，移植肌腱内腱细胞在受体体内是否存活，经深低温冷冻处理的异体肌腱其肌腱细胞受到损伤，已不存在具有活性的肌腱细胞，移植到受体体内后异体肌腱仅仅作为生长支架，经历移植物的坏死、重新血管化、细胞成分的增殖、胶原纤维的重建，通过爬行替代达到移植物的“复活”。近年来众多学者在细胞水平对自体肌腱的愈合机制进行了深入的研究，发现了肌腱细胞主动参与了肌腱内源性愈合过程，并在肌腱愈合中发挥了重要作用。肌腱细胞的本质是成纤维细胞，光镜下呈细长梭形，彼此间有伪足相连，外延性单层生长。天青-伊红-苏木素染色是成纤维细胞的染色方法，成纤维细胞经染色后可见细胞核呈蓝色，细胞浆呈灰蓝色。电镜观察可见细胞呈细长梭形，细胞外表凹凸不平，有分泌物覆盖。肌腱中胶原的含量占70％，胶原中的羟脯氨酸是脯氨酸在肌腱细胞内羟化而成，含量恒定，通常可根据羟脯氨酸的含量来推测胶原纤维的含量，并进一步反应肌腱愈合的质量。许多学者的实验证明，深低温冷冻后仍有肌腱细胞存活并有合成胶原纤维的能力。Abrihanison（1989）等建立孔径小于0.3~0.45um的皮下透析室模型，组织液可自动出入，而细胞成份则被隔离在外，利用该模型发现游离肌腱在组织液的营养下，同样可产生胶原并恢复肌腱光滑的表面。有研究表明肌腱在移植后4~6周，异体与自体肌腱都表现出腱细胞的再聚集。1985年Amoeczky等对兔的异体肌腱移植研究发现，在移植肌腱坏死和塑型的同时，宿主的腱细胞迁移到移植入肌腱的胶原纤维构架上。通过对移植肌腱内腱细胞的转归进行PCR分析，发现在移植后第2周即可测出供体组织细胞呈阳性，但数量明显减少；移植4周后却不能测出供体细胞。这种供体肌腱细胞的衰亡起始于移植术后，最终胶原纤维架上的腱细胞均来自宿主腱细胞的迁移聚集，其数量多少与植入肌腱的再血管化程度相关。张前法等（1999）采用冻存复苏后的异体腱细胞修复新西兰兔后肢肌腱缺损，发现移植的异体腱细胞亦有增殖和合成胶原的能力。杨志明等（2000）用异体腱细胞和人工支架复合材料构建的组织工程肌腱修复人喙锁韧带，术后6月采用短串联DNA检测，亦证明异体腱细胞在受体内存活，而未被排斥。唐林俊（1996）等用脱氧乌昔（dGuA）培养处理肌腱，选择性杀死抗原辅佐细胞（APC），而保留绝大多数主体细胞的存活，移植后获得与自体移植相似的效果。他们认为经培养处理后的肌腱移植，供体细胞在受体体内持续存活而不被排斥，产生了内源性愈合。高新生（1996）等用MEM液浸润肌腱后缓慢冷冻保存于-80℃的冰箱中，10d后作异体移植发现抗原性显著降低，同时也发现该种深低温保存的肌腱的愈合速度要快于冻干肌腱，他们认为这是由于深低温处理的肌腱在降低抗原性的同时保留了部分肌腱细胞的活性，移植后借助周围组织液营养及两端血管的迅速长入，使存活细胞复苏、增殖、分裂。刘波等（2005年）将供体大鼠跟腱移植桥接于36只受体大鼠跟腱缺损处，术后取移植肌腱提取细胞DNA，以DNA微卫星重复位点为分子标记，采用聚合酶链反应扩增移植物细胞DNA的微卫星重复序列。通过变性高效液相色谱（DHPLC）技术分析移植物DNA的基因型。实验证实深低温冷冻方法处理后的肌腱中仍存在活性的腱细胞，但活性的供体腱细胞的数量在第1周时已显著地减少，在第8周时已基本消失，其原因尚不明确。这些供体活性腱细胞虽然很少，但仍具有增殖与合成胶原的能力。因此，在移植早期参与肌腱修复过程，但其细胞数量少、抗原性低，使宿主仅发生可以耐受的不影响肌腱愈合的轻微免疫反应。Jackson等在进行异体肌腱移植的同时进行了异体皮肤移植。术后1周内，同时移植的异体皮肤并未观察到明显的免疫排斥反应，说明受者体内并不存在已致敏的淋巴细胞，没有产生超急性免疫排斥反应。免疫学研究显示，对于外来新抗原，体内若不存在致敏的淋巴细胞，那么机体在产生初次免疫应答反应之前有 1～2 周的潜伏期。而术后1周内异体移植皮肤的完好也说明异体肌腱细胞的大量死亡早于初次应答反应之前发生。因此，免疫排斥并非术后1周内细胞迅速死亡的原因。Goertzen 等研究显示，经过深低温冻存的腱细胞，复苏后在体外培养基中能存活很长时间，而异体细胞不能适应移植后的微环境，可能是异体细胞早期大量死亡的原因。影响体外肌腱的细胞生长因素包括细胞的来源，培养条件和接种细胞的数量。最近有研究表明（2006），在同样的培养条件下，经低温冷冻处理方法的肌腱中仍存在具有活性的腱细胞，但活细胞的数量显著少于新鲜肌腱中活细胞的数量；应用计算机控制慢速降温方法处理的肌腱活细胞的数量有所提高，但仍低于新鲜肌腱中活细胞的数量；经深低温冷冻方法处理后存活的细胞具有与新鲜肌腱细胞相似的形态和分裂增殖的能力，并具有合成胶原的能力；异体肌腱活细胞的数量增多，移植时免疫排斥的风险也相应增大。新鲜肌腱细胞的生长速度明显决于深低温冷冻利程序降温方法处理的肌腱细胞，而程序性降温方法处理的肌腱细胞生长速度快于深低温冷冻方法处理的肌腱细胞。但这3种细胞进行等数量传代后，其生长速度的差异明显缩小，3种细胞的生长曲线显示生长差异很小。这是因为新鲜肌腱细胞培养接种时活细胞的数量最多，而经过深低温冷冻处理后的异体肌腱在冷冻的过程中肌腱细胞受损死亡，活细胞数目下降，因而在原代培养时生长速度较慢。另有研究表明，深低温冷冻的异体肌腱移植与自体肌腱移植形态学改变大致相同。光镜下，深低温冷冻后的异体肌腱腱束结构清楚，无明显变性坏死，结合部有大量新生毛细血管或成纤维；电镜下见胶原原纤维呈平行排列，腱细胞细胞器活跃。但其连接部胶原原纤维和腱细胞的超微形态观察结果提示，经深低温冷冻处理后的肌腱与受体肌腱具有相容性，但光镜下仍可见连接部有少量淋巴细胞及单核细胞的浸润，故其慢性或迟发性的细胞免疫是否会影响移植后的同种异体肌腱的存活尚有待进一步研究。因此，如何实现使植入的异体腱细胞保持存活，并发挥原有生物学功能，继续合成具有正常肌腱三维构像的胶原纤维，保持原有生物力学特性将是一个诱人的课题。要实现这个目标，首先就要解决异体肌腱细胞移植后的存活问题。因此，今后尚需开展细胞生物学、分子生物学等多学科的合作，对肌腱细胞在体内微环境中的生物学改变、细胞基因调控等多方面进行深入研究。同时探索更佳的肌腱预处理方法，在降低异体肌腱免疫原性的同时更好的保持肌腱细胞的生物学特性。& 　（二）异体肌腱移植的再血管化&&& 　无论异体还是自体肌腱，在游离移植时都要经历一个再血管化的过程。异体肌腱的愈合时间比自体肌腱愈合要延迟，再生时间较长。Jackson在实验观察中发现异体肌腱在移植后第2周出现血管化征象，6~8周进入高峰。而移植肌腱的中央部分的血管化在相当一段时间内呈低调。异体肌腱的完全血管化需30周，达到正常水平需1年左右时间。Horibe等经动物实验显微血管造影证实，移植后肌腱的再生血管和成纤维细胞均来自供体组织周围和缝合口两端。移植后2周时已开始有毛细血管长入，移植后6周腱细胞开始浸润，移植肌腱中坏死的胶原组织被新生的成纤维细胞替代。高新生等认为，将低温冷冻保存的异体肌腱移植后，虽失去了代谢功能，但保持肌腱的连续性，为肌腱重新血管化和活细胞化奠定了结构基础；其实验观察到肌腱移植后，大量新生成纤维细胞、结缔组织细胞及毛细血管，沿两端肌腱表面及腱束间浸入移植腱表面及周围组织，其修复随时间的推移而趋向成熟，最终演变为排列整齐呈波浪型的胶原纤维束，使移植肌腱成为具有活细胞代谢功能的肌腱组织。（三）异体肌腱移植的修复方式肌腱移植后，其愈合机制可分为内源性愈合和外源性愈合。①内源性愈合：肌腱断裂修复后，肌腱本身的腱外膜、腱内膜参与愈合过程，由肌腱断端直接生长修复肌腱，其腱细胞可自行愈合。创伤可以激发腱内膜和腱外膜的成纤维细胞的活性，促进其分裂增殖。通过自身，形成正常肌腱胶原纤维。②外源性愈合：肌腱愈合是由其周围组织的细胞增殖，进入肌腱断端间并将其修复，而并非由肌腱本身内在细胞的反应所完成。来自肌腱周围的组织（滑膜、鞘管、腱周组织等）纤维母细胞和毛细血管，在肌腱断裂缝接后侵入断端并增殖，合成分泌胶原。早期形成的胶原方向与修复的肌腱纤维长轴垂直，2~3周后胶原受张力的影响重新排列，其方向逐渐平行于肌腱的长轴。其中，少量的发生内愈合现象，腱细胞向腱端迁移，合成并分化胶原。移植肌腱组织存活少许细胞，特别是腱外膜的细胞早期为休眠状态，后渐开始增殖，并在细胞问有新生的腔厚纤维充填，但最终的修复过程及原理尚不明了，例如肌腱基质中的大分子物质在愈合中的作用等。同种异体肌腱移植为多条肌腱缺损的修复提供了一种新的方法。异体肌腱移植后，经历了与自体肌腱相同的生物愈合过程，但愈合时间要长于自体肌腱移植。由于肌腱进行深低温冷冻处理时，在消除异体肌腱的抗原性的同时，肌腱细胞的活性也受到不同程度损伤，以往人们认为肌腱缺乏内源性愈合的能力，异体肌腱移植的主要作用是提供一个“生长支架”。异体肌腱移植后的修复机制是经冷冻、化学等处理后破坏其细胞成分，在肌腱内形成“空穴”，大量受体成纤维细胞或间充质细胞、毛细血管等向移植肌腱两端表面及腱束间侵入生长，细胞逐渐成熟，数量减少，最终完全转化为腱细胞；而新生的细胶原原纤维逐渐替代原粗大胶原原纤维，逐渐形成完全由致密的细胶原原纤维组成，排列整齐，与肌腱纵轴一致，形成波浪型胶原纤维束。&&& 　后来的大量的基础研究改变了人们对肌腱愈合机制的认识。1976年Lundborg将撕裂的兔的屈肌腱置于膝关节内，依靠关节液的营养作用。在原位形成了无粘连的愈合。Becker等于1981年对鸡的肌腱片断进行体外培养，观察到腱细胞向肌腱的断端迁移、合成并分泌胶原蛋白。1984年Manske对屈肌腱的内源性愈合进行了组织形态学的观察，认为内源性愈合是在滑液的营养下，腱细胞的增殖，向断端迁移包裹断端，合成并分泌胶原纤维，对肌腱进行修复。1988年Gamer等应用免疫组化和放射自显影的方法显示，体外培养的鸡的屈肌腱的内源性愈合源于肌腱的腱外膜。体外培养2d后腱外膜细胞开始增殖，并向断裂处迁移。4d后，腱外膜细胞开始分化并合成胶原蛋白。放射自显影证实早期的胶原蛋白的合成来自腱外膜。8d时肌腱的断端完全由腱外膜迁移来的细胞所覆盖，绝大多数被迁移来的细胞具有胶原蛋白合成的能力。在培养第3、4周时腱内膜的细胞开始与腱外膜的细胞共同参与肌腱的内源性愈合过程。Gamer推测腱内膜细胞在愈合时的延迟起动可能是缺乏营养所致。1991年Mass等对断裂的人指浅屈肌腱进行体外培养发现，腱外膜细胞的增殖开始于培养后2周，腱外膜出现拉长的烟卷形的腱细胞桥接于肌腱的断端，并与肌腱的长轴平行。断端缝合处的腱外膜增厚，桥接于断端处的细胞外形似纤母细胞，电镜观察细胞内包含大量的粗面内质网、高尔基体，细胞核大胞浆中的微丝与肌腱的长轴平行。增厚的腱外膜深层的细胞周围可见新生的胶原纤维。4周后，桥接于断端的细胞层随着腱细胞的增殖和胶原纤维的合成而增厚。腱细胞更加拉长、扁平，相互重叠，不同于2周时的梭形的腱细胞。紧贴腱外膜的两断端之间的2~3层腱细胞之间有广泛的重叠，彼此紧密靠近。腱外膜下较深层的腱细胞之间的间隙较大，细胞之间填充于新生的胶原纤维。电镜下可见腱细胞高电子密度的粗面内质网，提示腱细胞正处于活跃的胶原纤维合成期。第8周时，肌腱的连续性恢复，表面光滑。由于内源性愈合不依赖腱周组织的纤母细胞和毛细血管的侵入，可以恢复肌腱平滑的表面，减少或不形成粘连，因此在肌腱的愈合观察中应该尽可能的促使肌腱的内源性愈合。由于内源性肌腱愈合的主要靠肌腱组织的再生，弹性好，粘连不明显；而外源性肌腱愈合的主要靠腱旁组织的长入，并替代肌腱组织，弹性差，粘连明显，实为粘连性愈合。当外源性愈合占优势时，肌腱愈合后将不可避免与周围组织之间形成较重的粘连，而内源性愈合由于愈合过程建立在肌腱内部的细胞活力基础上，粘连程度将明显轻于外源性愈合。一般认为，在大部分临床情况下，内、外源性愈合可能都参与肌腱愈合过程。至于哪种方式占主导地位，则取决于肌腱的营养状况和环境条件，肌腱的内源性愈合必须以自身的良好营养状态为基础。Potenza于1982年观察到冷冻可以杀死腱细胞，导致肌腱丧失了内源性愈合的能力，只能以粘连较重的外源性愈合方式愈合。四、异体肌腱移植粘连的预防及处理肌腱损伤后，由于肌腱周围结缔组织的成纤维细胞、血管和维生素C的浓度均较肌腱内部高，使腱周围结缔组织的成纤维细胞功能活跃，在维生素C的参与下，合成大量胶原纤维，导致肌腱周结缔组织增生快于肌腱内部再生，腱周结缔组织长入腱内，不但干扰了腱内再生，而且产生粘连。所以肌腱损伤后发生再粘连，不应视为腱再生的必然过程，而应看成腱周结缔组织增生干扰腱内部再生的产物。1、异体肌腱移植的营养与粘连肌腱的营养与粘连的关系极为密切，肌腱的内源性愈合必须以自身的良好营养状态为基础，肌腱缺血对粘连的形成是一种有力的刺激因素。May指出腱旁组织不但是肌腱的滑动机构，而且含有大量抵达肌腱的营养性血管和神经，是滑膜外肌腱的主要营养来源。Schneeding发现包有腱旁组织的移植肌腱愈合快且粘连轻。张友乐等实验研究证实采用带部分腱鞘异体肌腱经深低温处理后，肌腱营养良好，组织修复能力同自体移植，愈合后腱鞘与肌腱间隙存在，移植腱鞘与正常肌腱组织结构相同。潘昭勋等进行了同时修复肌腱及腱旁组织以防止肌腱粘连的实验研究，结果表明腱旁组织内和肌腱愈合部位再生血管丰富，腱内膜增生活跃，成纤维细胞和胶原纤维出现早且多，并顺腱旁组织和腱断端有序生长，有正常腱束形成的趋势；相反仅修复肌腱而未同时修复腱旁组织，因腱旁组织的回缩及瘢痕化，其组织内再生血管稀少、幼稚、无明显腱内膜增生，纤维细胞幼稚，无序生长，无腱束形成，加之周围组织的参与，实际上是粘连性愈合（即外源性愈合）占据了主导地位。因此，作者认为修复腱旁组织即保护了肌腱的血供，促进了内源性愈合的发生，同时腱旁组织作为一层屏障阻止了周围肉芽组织的长入、粘连及其对内源性愈合的干扰，使肌腱愈合规则。而过多的创伤分离及过粗的缝线易引起腱束劈裂，增加外源性愈合的过多参与，加重粘连。因此对肌腱及腱旁组织的修复均应强调采用无创的显微缝合技术，减轻对肌腱的损伤，保持对合良好，有效的保护其营养及滑动功能，并尽量避免对血运丰富起愈合作用的束间膜的损伤，肌腱断端缝合不应出现间隙。目前临床上多采用抗拉力强，干扰血循环小的改良Kessler法缝合肌腱，腱旁组织采用显微无创伤缝线间断缝合，完整覆盖吻合口。2、异体肌腱移植的结构与粘连根据肌腱不同位置与结构可分为滑膜肌腱与非滑膜肌腱。滑膜肌腱位于鞘管内，其营养以滑膜的循环为主；非滑膜肌腱在鞘管外，其营养以腱周的血循环为主。随着肌腱移植研究的深入，发现肌腱类型不同，移植的结果也不相同。肌腱的表面结构决定了其营养途径，从而直接影响肌腱的愈合质量。滑膜肌腱表面结构易于组织液的渗透，延长了肌腱因缺血造成萎缩或坏死的时间，较快建立起血循环，提高了肌腱的愈合质量，符合不同区域肌腱缺损不同类型肌腱移植的原则。张友乐等（2006）在手指屈肌腱鞘区内应用异体滑膜肌腱与自体非滑膜肌腱移植的比较学研究结果显示，异体滑膜肌腱移植280例，优良率达57.0％，较差或差为11.0％，松解率为32.0％，松解后总优良率达93.0％。自体非滑肌腱移植98例，优良率达43.0％，较差或差为9.0％，松解率为49.0％，松解后总优良率达94.2％，两者的最终结果无明显差异。说明滑膜肌腱表面结构可加快血循环的建立，促进组织液的渗透，有益于肌腱营养，提高肌腱的愈合质量，是减少术后肌腱粘连再次松解的重要因素。&&&　 3、异体肌腱移植的术后制动与粘连异体肌腱移植后出现的粘连还与术后较长时间的制动密切相关。早期控制性活动可拉松粘连组织，增加肌腱的滑动度，有利于新合成胶原沿生物力学方向重建，同时还有利于新生血管纵形排列，促进肌腱和组织液之间的物质交换，加速其再生、修复及塑形过程，缓解粘连。但早期活动要求移植肌腱本身具有一定的机械强度，胶原替代速度不能过快。如果原胶原很快地消失，新合成胶原排列紊乱且不成熟，可能导致缝合处胶原纤维持续下降，引起肌腱断裂。目前，通常是通过增加缝合力量，并在支具保护下进行早期功能锻炼。具体锻炼时间及强度因缺乏移植后肌腱力学性能的系统研究，还存在一定的盲目性。4、异体肌腱移植的其它防粘连措施对肌腱粘连的预防还有其它物理、化学方法，诸如生物膜包裹、几丁糖、透明质酸、抗炎药物的局部应用等。通过对异体肌腱进行深低温冷冻及化学处理，消除其抗原性的同时，腱细胞的活性也将受到不同程度的损害，由此导致了肌腱丧失部分或全部内源性愈合的能力，是导致粘连形成的一个重要因素。因此，改进当前异体肌腱的处理方法，使其既能降低异体肌腱的抗原性，又能保存肌腱细胞的活性促使肌腱的内源性愈合、减少外源性愈合的参与、防止移植肌腱的粘连，已成为异体肌腱移植领域的研究热点。杨小祥报道应用透明质酸钠能防止或减轻异体肌腱移植后肌腱粘连，促进肌腱愈合。辛畅泰等（2001年）采用的bFGF复合非降解膜，既可增加肌腱内部成纤维细胞数量，又可提高维生素C浓度，增强腱内部再生和防止腱周结缔组织增生长入腱内，从而减轻或防止粘连的形成。最近，人们通过对粘连形成机制的深入探讨，发现生长因子在其中扮演重要角色，而在众多生长因子中，TGF-β的作用尤为突出。Chang（2000）等通过使用TGF-β中和抗体明显提高了实验动物（新西兰免）的肌腱活动范围，为预防肌腱粘连提供了有益的启示。对已经形成的限制性粘连，二期手术松解粘连被认为是较好的补救办法。五、异体肌腱移植的生物力学变化异体肌腱移植的最终目标是移植物能完美地替代正常肌腱。而迄今为止的研究显示，异体肌腱移植后的重塑尚不能完全重建正常肌腱的显微结构，保持原有的生物力学特性。无论自体肌腱还是异体肌腱，在植入早期均有明显的抗张强度的丢失，最终移植物不能达到植入前的强度。（一）异体与自体肌腱移植后的机械强度变化异体与自体肌腱在移植初期都有明显的机械强度丢失，异体肌腱移植后这种机械强度衰减过程更为明显。异体肌腱移植后的机械强度是否低于自体肌腱移植，一直是临床上存在争议的问题。在比较学研究中发现，肌腱移植后早期（4周），冷冻异体肌腱移植移植力学强度低于自体肌腱移植；在肌腱移植后11周，二者间差异不显著。其原因是，异体肌腱经冷冻处理后细胞的数量减少，参加内源性愈合的作用下降，胶原纤维间隙增大，胶原纤维的直径明显小于自体肌腱移植，且其新生胶原纤维直径为30nm~80nm，而相应的自体肌腱的腔原纤维直径为90nm~140nm。大直径的胶原纤维以及它们的排列分布与肌腱生物力学的效价有直接联系。但另有研究认为，在移植后6个月内自体肌腱的机械强度优于异体腱移植，随着塑形期的完成，肌腱机械强度可逐渐恢复，但最终的机械强度低于植入前的强度。Shino等（1984）应用自体与异体髌腱（冷冻-20℃后）重建狗的前交叉韧带，发现两者的机械强度没有明显的差别。Vasseur（1987）应用自体和异体冷冻前交叉韧带重建狗的前交叉韧带，术后9个月观察未发现两者在最大负载上存在显著性差异。Horibe等（1990）用冷冻犬髌腱重建犬膝关节内侧副韧带，结果在52周时生物力学测试显示正常与移植重建的韧带的弹性摸量和最大负荷等指标无统计学差异。Akira Maeda等（1997）应用新鲜自体肌腱、冷冻自体肌腱、冷冻异体肌腱移植重建鼠的髌腱，观察在塑形期移植髌腱的机械性能和形态学的差异及两者之间的相关性。结果显示冷冻自体肌腱和冷冻异体肌腱在移植后其机械强度均低于新鲜的自体肌腱移植，而冷冻自体肌腱和冷冻异体肌腱在移植后的机械强度没有明显的差异。由此推断，冷冻过程降低了肌腱的机械强度。王锡阳等研究结果表明，深低温冷冻或冷冻干燥的同种异体豚鼠跟腱移植后的生物力学测试表明，豚鼠异体跟腱在拉伸力学性能上虽稍低于自体移植跟腱，但无统计学差异（P&0.05）；异体豚鼠跟腱的早期断裂负荷及弹性刚度有所降低，以后逐渐增加，3周后其力学指标与自体跟腱移植相近。作者认为这是由于移植后早期，吻合端水肿软化、断端间隙中的肉芽组织又非常幼嫩不足以抵抗外力，随后水肿消失、肉芽组织逐渐被新生的胶原原纤维所替代。徐光晖等采用兔同种异体肌腱经深低温冷冻(-75℃)后移植，结果移植前和移植后2，4，8周时其生物力学测试的各项指标均无显著性差异，同种异体肌腱在移植后的力学性能（除衰竭应变外）均比移植前明显降低，随时间推进有上升的趋势，但8周时仍明显低于移植前。机械强度降低的原因可能是在冷冻的过程中胶原纤维之间形成了冰晶。组织学观察发现冷冻肌腱的细胞结构减少，胶原纤维之间的空间增大。冷冻自体和异体肌腱移植组术后4周时观察发现，移植肌腱的胶原纤维的直径明显小于新鲜自体肌腱移植组和对照组，24周后冷冻组的小直径胶原纤维的数目仍然多于新鲜自体移植组和对照组。Akira认为移植后早期出现的小直径胶原纤维可能是一种短暂的现象。Shino等（1995）采用关节镜对术后12～96个月异体移植肌腱进行活检，用电镜观察冷冻新鲜的异体跟腱和腓骨长、短腱重建前交叉韧带。发现移植后肌腱新生的胶原纤维直径多为30~80nm，而正常的前交叉韧带的胶原纤维直径多为90~140nm。随着小直径的胶原纤维的增多，正常形态的胶原纤维逐渐减少。这种直径上的差异产生于术后6个月，术后数年时仍可见到。Shino认为新生的小直径胶原纤维取代了原先存在的大直径的胶原纤维。Shadwick通过定量实验证实，大直径胶原纤维具有更高密度的分子间胶原交联率。因此，与肌腱的抗张强度成正相关关系。因此这种与冷冻有关的肌腱在愈合后正常形态与排列的胶原纤维的减少或丧失，是能解释肌腱移植后的力学特性衰减的一个原因。Tom等也认为，移植物的抗张强度等材料特性可能在异体细胞被自体细胞替代过程中降低。（二）不同方法处理的异体肌腱移植后的机械强度异体肌腱移植在受体体内一般都要经历一个机械强度下降、升高、维持的变化过程。异体肌腱的各种处理方法对其在体内的生物力学变化有不同的影响。Torilsuka等（1997）将冻干及低温保存的同种异体肌腱进行移植，2周后供体胶原分别占（59士11）%和（62士10）%，4周后为（18士8）%和（36士14）%。由于胶原的过快消失，新生胶原的不成熟，排列紊乱，造成冻干肌腱术后机械强度较冷冻新鲜明显下降，致使吻合口胶原持线力下降。同样，Zimmerman等（1994）在对比化学处理及冷冻髌腱重建交又韧带，6月后测试发现冷冻组髌腱的最大拉伸强度和拉伸刚度均高于化学处理组。其原因可能是低温保存较冻干及化学处理更好地保存了细胞因子及部分细胞的活性，使胶原不易在受体环境中被降解，有利于细胞的增殖。具体各种冷冻方法保存的移植物在术后各时间段的机械强度变化尚无系统的研究的报道。六、异体肌腱移植的免疫排斥反应（一）异体肌腱的抗原性异体肌腱移植成败的关键是受者对移植免疫排斥反应的强弱。肌腱是一种少血供、少细胞的组织，肌腱组织的抗原性较弱，但组成肌腱的腱细胞、基质、胶原成分，都能诱导发生免疫排斥反应，只是程度不同而己。未经处理的新鲜异体肌腱直接进行移植后，通常会引起较为强烈的免疫排斥反应，局部表现为大量淋巴细胞浸润和细胞毒反应。这种反应在移植后的第2周达到高峰，随后出现以细胞免疫为主的免疫排斥反应，可持续存在2~3个月，导致移植肌腱结构的破坏崩解，并足以造成异体肌腱移植的失败。这是异体肌腱移植研究最主要的问题，也是临床应用成功与否的关键。有人认为许多软组织异体移植物成份可能激发免疫反应，而其中的主要组织相容性抗原或人类白细胞抗原具有强烈的免疫原性，表现在基质和胶原上的抗原则较弱。1959年Peacock首次报道了异体肌腱移植，由于是未经处理的新鲜异体肌腱，结果发现有明显的炎症反应和排斥反应。Minami等（1983）通过补体依赖的细胞毒试验发现，异体肌腱的抗原性主要存在于其腱细胞（CCT）的细胞膜的糖蛋白上，属于组织相容性抗原（HLA），而胶原纤维并不表达明显的抗原性。肌腱在去除胶原后，抗原性增加；他认为胶原能起到屏蔽作用在而使肌腱的抗原性降低。进一步发现CCT上的抗原经冻干、冻融，多聚甲醛处理后会大大减弱，而X线、戊二醛、丝裂霉素C等对肌腱的抗原性基本上没有影响，但详细机理尚不清楚。他们推测抗原性降低的原因，可能是由于冷冻、多聚甲醛等处理改变了细胞表面的抗原决定簇或损伤了肌腱的细胞成份。（二）异体肌腱移植物的免疫排斥反应特点许多人认为轻度的免疫反应机体可以接受，不会产生明显的排斥反应，况且异体肌腱移植不同于器官移植，器官移植是功能性移植，出现排斥反应很可能导致移植失败，而异体肌腱移植只为受区提供一个“生长支架”。因此，经冷冻处理的异体肌腱可明显降低移植物的抗原性，基本被看作是一种极轻度或无免疫原性的植入物，使受体可以接受而不会产生明显的排斥反应，并能良好地保存移植物原有的组织结构。冷冻保存后其抗原性降低的原因可能是保存过程中杀灭低温敏感的抗原呈递细胞（Antigen presenting cell, APC）或使细胞表面的抗原决定簇发生改变所致。Guidos等（1987）认为异体移植的免疫反应中，主要组织相容性抗原不是异体移植的首要障碍。MHC抗原需要抗原呈递细胞（Antigen presenting cell, APC）通常是la阳性的巨噬细胞、树突状细胞、过路白细胞的辅佐，将抗原分子递呈给T细胞，才能启动宿主对移植物的反应，而移植物搭载的APC是触发排斥反应的首要因素。肌腱是有血供的组织，树突状细胞广泛存在于非淋巴组织、器官的间质中，肌腱中难免存在过路白细胞和树突状细胞，因而肌腱抗原性和APC有很强的相关性。唐林俊等人用脱氧鸟苷（dGUA）培养肌腱段，选择性杀灭APC而保存大部分主体细胞的存活，通过淋巴细胞转化试验及肌腱移植，证实培养后的肌腱抗原性显著降低。1994年Harner等发现，在接受冷冻异体肌腱移植术后16个月，仍可检查出供体特异性组织相容性抗体，主要是1gG。1996年Ritehie等报道用冷冻肌腱重建膝交叉韧带（ACL）的一组病例，发现在45%的患者中可以查出这种特异性抗体，但其疗效并不差于未查出抗体的患者。曲彦隆等（2001）发现腱细胞为弱抗原细胞，抗原脱落或可溶性抗原分泌较少。Jackson等则认为，免疫学因素并未完全解决，冷冻肌腱移植后的轻度排斥反应就具有潜在的危害性，需要进一步研究。&&& 　采用深低温冷冻方法处理的肌腱，其活肌腱细胞明显少于新鲜肌腱活细胞的数量，而肌腱中活性腱细胞的数量与免疫原性显著相关。杨光等和Jonas等在实验中证明液氮低温保存后存活的平滑肌细胞和内皮细胞能表达MHC-R和MHC-R类抗原，Khourv等报道1例半月板移植，经过2次深低温冷冻-冻融循环后仍保留MHC-R和MHC-R类抗原。计算机控制的慢速降温方法处理的肌腱中活细胞数量多，理论上有利于肌腱组织的修复。但细胞活性与免疫原性的相关性有待进一步研究。（三）异体肌腱移植物的免疫监测异体肌腱移植后的组织免疫水平的监测是非常重要的。了解移植物植入后机体的免疫反应机制如何，直接关系到移植物能否被受体所接受。异体肌腱的抗原性来源于肌腱细胞表面的MHC-1型抗原，MHC-I抗原可激活体内T细胞介导的细胞免疫反应。T细胞被MHC抗原激活并在细胞表面表达特定分子，转化为CD4＋ T细胞和CD8＋ T细胞，即辅助T细胞和细胞毒T细胞，参与组织免疫反应。而B淋巴细胞介导的体液免疫反应在深低温冷冻方法处理的异体肌腱的移植中的作用很小。由于肌腱属于低抗原性组织，组织移植后引起的反应很小，常规监测方法很难表达出来。目前常用的检测方法有淋巴细胞毒检测和白细胞介素系统监测，但也仅在实验中进行的监测，临床上尚有一定的困难，尚需进一步研究。（四）异体肌腱移植物的免疫排斥反应预防肌腱组织属于低抗原性组织，其抗原性主要存在于肌腱细胞的细胞膜上，为组织相容性抗原(HLA)，而其胶原纤维并不表达明显的抗原性。如何最大限度地降低组织抗原性，同时维持其组织活性是异体肌腱移植的关键。降低异体肌腱的抗原方法很多，主要有物理的和化学的方法。X射线、γ射线照射、戎二醛、高浓度酒精和丝裂霉素C、胶原溶酶处理等。实验证实以上方法都可以降低组织的抗原性，但对组织的损伤较大。经上述处理的肌腱组织，移植后易发生坏死。深低温冷冻和冷冻干燥处理方法不仅可以降低腱组织的抗原性，且保留了相应的组织活性，是目前较为理想的组织移植处理方法。Urist首先应用CM浸出技术处理异体骨以降低其抗原性。Tauro等经过多次改进建立了处理牛肌腱的CM浸出技术，并作牛→兔的异种移植，用酶联免疫法证实CM处理的牛肌腱免疫原性显著降低，无明显排斥反应发生，移植获得成功。唐林俊等采用经低温冷冻与CM浸出技术处理的鸡肌腱做同种异体移植，该异体肌腱免疫原性极小，通过对手术趾主动屈曲功能测定，移植肌腱大体形态及组织学观察、移植肌腱羟脯氰酸含量测定及生物力学性能测定等，证实异体肌腱移植可取得与自体移植相似的效果。并认为化学处理冻干技术对肌腱胶原纤维无明显损害，主要去除细胞成分及部分基质，这样使CM处理的冻干肌腱保留了足够的抗张强度；且由于细胞成分去除所残留的“空穴”，有利于周围成纤维细胞长入及生成胶原原纤维。这两个特点的具备使 CM处理的冻干肌腱成为一种良好的供宿主成纤维细胞“爬行替代”的架构，从而形成了一个可选择性地去除其腱细胞成分而不破坏其胶原纤维，是一种能显著降低肌腱抗原性而不明显损伤肌腱强度的异体肌腱处理技术。用乙醇处理肌腱可使腱组织表面蛋白质变性、沉淀，改变了细胞膜表面抗原结构而降低抗原性，移植后不致引起受体产生明显的排斥反应。俞婴敏等实验研究证实鸦胆子处理异体肌腱成本低、腱细胞损伤小、免疫性大大降低，具有较好的抗排异作用，适合基层医院应用。李靖杨等采用兔经深低温冷冻处理的同种异体肌腱移植证实移植后三周电镜下观察腱活跃、数量多、细胞器发达、新生的细胶原原纤维较多，与自体肌腱移植后的电镜观察结果接近，从而证实同种异体肌腱经深低温冷冻处理后可有效降低其免疫原性，显著减轻排斥反应。&&&　 目前对冷冻处理能降低异体肌腱的免疫原性的结论，己获得广泛的共识。鲁晓波等的研究表明，经冷冻处理的异体肌腱仍可导致免疫排斥反应，以受区局部组织为重。就减低抗原性而言，冷冻干燥方法处理的异体肌腱要比新鲜冷冻方法好。七、异体肌腱的临床应用近年来，国内外在异体肌腱移植实验研究的基础上，应用异体肌腱移植修复临床肌腱缺损也取得了许多可喜的进展。异体肌腱应用方法的多样性，改变了一些传统的肌腱修复方法观念，引发了人们对肌腱缺损治疗新的思考。目前一致认为，异体肌腱具有获取方便、不增加手术切口，特别是对多处肌腱韧带损伤的患者，简化了手术、缩短了时间、降低了并发症等优点。其缺点是愈合时间相对较长，并有潜在的排斥反应和传染疾病的可能。&&&　 （一）异体肌腱修复多条肌腱缺损由于异体肌腱库的建立，使异体肌腱取材、保存、处理更加安全可靠，保障了临床患者的需要。近年文献报导中，大量的病例为多条肌腱缺损，甚至屈伸肌腱同时缺损的病例，采用异体肌腱同时成功地修复。异体肌腱的移植长度可自行选择，避免了由于自体肌腱不足1条肌腱移植于几条肌腱，或肌腱长度不够采用临近肌腱移位的方法，使肌腱移植的质量有了保障。异体肌腱移植基本做到了缺什么修复什么，缺多少长度补多少长度的要求。高新生等报道自1992年以来，共应用深低温冷冻肌腱274条，冻干肌腱56条，临床修复手部肌腱缺损230例，最长随访3.5年，疗效满意，并建立了肌腱库。其临床应用结果表明，深低温冷冻和冷冻干燥两种方法处理贮存的异体肌腱，移植后能为受体所接受并迅速血管化而发生组织间的愈合，具有抗张力的功能活动作用，其疗效与自体肌腱移植相似。张友乐等报道应用超低温冷冻异体肌腱移植修复各种原因所致手部肌腱缺损15例（33条肌腱），术后石膏制动4周，去除外固定后开始活动并进行理疗及体疗。结果术后一般情况好，无发热及组织排斥反应，随访2.5~22个月（平均6个月），未发现异常反应，移植后的手功能均有不同程度的恢复，经TAM法测定，优良率为60%，可为17%，需行二期松解者为23%。到目前为止，经10余年200多例长期随访，已证实移植后肌腱存活，功能恢复良好。杨文龙等应用95%乙醇浸泡的异体肌腱移植修复10例12根手指肌腱，术后随访6个月~2年，各手指无异常反应，手指伸屈活动按TAM标准评定，优：7指，良：4指，差：1指。谢唏衷等应用戊二醛及深低温处理的同种异体肌腱移植修复手部肌腱缺损13例，优良率53.34%，主要存在问题为移植后局部粘连较重。战杰等应用经深低温冷冻的异体肌腱为86例115条肌腱缺损患者进行了移植手术，远期效果良好。郭强等应用冷冻干燥同种异体肌腱移植修复肌腱缺损，术后均未见有急性排斥反应，半年后行肌腱松解术时与自体肌腱移植无明显差异。杨小样采用普通低温（-17℃）冻存的胎儿肌腱移植修复小儿肌腱缺损l7例31根，取得了较为满意的疗效。在张子清、袁永健、唐林俊等异体肌腱临床的疗效报告中，随访时间7个月~7.8年，平均5.8年，优良率为72%，没有明确的失败例数或失败率的报告。（二）分类型、分部位的异体肌腱移植肌腱大致可分滑膜肌腱与非滑膜肌腱。由于其所在部位不同，肌腱的表面结构不同．它是由于所处部位、营养环境不同所决定的，肌腱表面结构直接影响肌腱愈合质量。研究表明，在鞘管内的滑膜异体肌腱移植结果明显优于自体非滑膜肌腱移植。这可能是由于肌腱移植后，周围组织液提供营养，滑膜肌腱表面结构具备渗透组织液的途径，更易于获得营养；而非滑膜肌腱表面为腱周组织，依赖于血液循环重建而获得营养。周围组织细胞及新生血管长入为其唯一的途径，发生过程速度要慢，粘连的机会也会更多些。伸指肌腱II区的肌腱缺损，临床上修复非常困难。传统的方法常是伸指功能恢复，屈指功能差，甚至肌腱修复后的功能，屈伸活动不如术前。其主要原因是不符合原来的伸指装置的活动要求，即中央束及侧腱束联合体的协调运动。为解决上述问题，有学者采用腱帽及周围腱束联合移植，即在指伸肌腱取材时，将腱帽连同周围的中央束和侧腱束一同切取，修复时分别修复中央束和两侧腱束，临床应用早期效果满意。（三）手部以外的异体肌腱移植除手部以外，临床上应用异体肌腱最多的是重建膝关节的稳定性，其临床疗效总优良率可达85%。Peterson等对关节镜下用异体、自体肌腱移植重建膝交叉韧带的病例进行前瞻性非随机研究。两组各30例，手术由同一术者完成。术后观察55~78个月，平均63个月。自体组1例在术后3年因运动伤断裂，异体组失败1例。术后5年随访时两组病例的临床疗效无明显差别。Moyes等也作了长期观察，包括不同材料与不同时间的前后对照。术后随访最长9年，平均为7年，异体肌腱的总优良率为66%、失败率为7%。在肩关节、踝关节韧带的修复中也有许多异体肌腱应用的报告，其临床疗效、优良率一般在75%左右。八、展　望同种异体肌腱移植经过几十年的研究，已取得了一些进展，在组织工程肌腱尚未进入临床的一段时期内，异体肌腱的应用势必有增长的趋势，将会越来越多的应用于临床修复腱性组织的缺损。就目前而言，对临床肌腱缺损病例首选的治疗方案是自体肌腱移植，异体肌腱移植仅适用于修复多条肌腱缺损或无法提供自体肌腱移植的患者。尽管异体肌腱移植具有许多优点，但不容忽视的是，它仍具有潜在的免疫排斥反应和传染疾病的可能。因此，对异体肌腱的取材、制备、检测、储存均需更规范化的管理。为了进一步完善异体肌腱的研究和临床应用，尚有不少亟待解决的问题：①如何寻找一种既能明显降低抗原性又对其细胞活性及其它生物学性能无明显影响且能长期保存的方法；②探讨肌腱细胞在异体肌腱修复过程中的作用，肌腱基质在愈合中的影响，深入了解肌腱生长因子、促肌腱生长因子的结构与生理功能；完善肌腱移植后肌腱细胞追踪技术等；③加强对异体肌腱移植术后生物力学行为的研究，探讨如何提高肌腱愈合速度与强度，并科学界定术后早期功能锻炼的时间和强度，寻找一条既能促进愈合又能防止粘连的新方法，将异体肌腱的研究向更深层次发展；④如何对供体进行安全高效的检测，杜绝疾病的传播。⑤按照循证医学的要求，如何更好地对异体肌腱移植病例进行长期随访，特别是通过对5年以上的大宗病例随访分析，取得对异体肌腱移植研究的科学资料。相信随着科技的进步与肌腱外科的不断发展，这些问题将会被逐渐解决，异体肌腱移植将成为一种更安全有效、更成熟与推广应用的治疗方法。参考文献&1.&张友乐，杨克非，朱伟，等. 异体肌腱移植的实验研究与临床应用. 中华外科杂志，9-541.2.&唐林俊，陈秉礼，丁钦蓉. 脱氧鸟苷培养处理的同种异体肌腱移植的实验研究. 中华骨科杂志，5．3.&高新生，尹大庆，金瑞侠，等．同种异体肌腱移植与肌腱库的建立．中华手外科杂志，-92.4. 张友乐，杨克非，高新生，等．冷冻干燥异体肌腱移植的实验研究及临床应用．中华骨科杂志，-62.5.&杨文龙，袁永健，王丹，等. 95%乙醇浸泡异体肌腱移植的临床应用. 中华手外科杂志，4.6.&徐光辉，顾洁夫，李丽．深低温冷冻同种异体肌腱移植的生物力学研究．滨州医学院学报，6-529.7.&王锡阳，李康华，王卫国. 同种异体肌腱移植的实验研究. 湖南医科大学学报, 8-140.8.&张友乐，王澍寰，高新生，等．带腱鞘异体肌腱移植的实验研究．中国修复重建外科杂志，-95.9.&&袁永健 杨文龙 徐旭纯，等. 95%乙醇浸泡异体肌腱移植远期疗效观察. 中华手外科杂志，9-190.10.&辛畅泰，张辉，安贵林，等. bFGF复合膜对同种异体肌腱移植的作用的实验研究. 解剖科学进展，1-214.11.&俞婴敏，刘英彬，浦江晨．鸦胆子在异体肌腱移植中抗排异作用的实验研究．中华创伤杂志，612. 杨小样．透明质酸钠在同种异体肌腱移植中的应用. 实用手外科杂志，-87．13.&战杰，田立杰，许杨，等. 深低温冷冻同种异体肌腱移植的远期疗效观察．实用手外科杂志，)：47-48.14.谢唏衷，余林权，盂宏，等．戊二醛及深低温处理的肌腱移植修复手部肌腱缺损. 中华显微外科杂志，5-306．15.&郭强，崔树森，林东，等. 冷冻干燥同种异体肌腱移植修复肌腱缺损．实用手外科杂志，2-103．16.&杨小祥．普通低温冷冻的胎儿肌腱移植修复小儿肌腱缺损. 中国修复重建外科杂志，017.&王锡阳，李康华，雷光华，等. 同种异体肌腱的抗拉性能. 中南大学学报（医学版），7-468.18.&李靖杨，艾台买捉·玉素甫，刘大鹏，等．兔同种异体肌腱移植的电镜观察．新疆医科大学学报，8-450．19.&刘波，王澍寰，张友乐，等. 同种异体肌腱移植后的细胞转归. 中华手外科杂志，2005,& 21: 138-141.20. 邓万祥，赵胡瑞，董晖，等. 异体肌腱移植在临床修复中的应用. 中国修复重建外科杂志6-668.21.&张友乐，朱伟，孙燕琨，等. 手指鞘管区异体滑膜肌腱与自体非滑膜肌腱移植的比较学研究. 中华手外科杂志，1-132.22.&孙燕琨，张友乐，孙磊，等. 深低温冷冻肌腱细胞活性的研究. 中华手外科杂志，3-136.23.&Mina A, Ishi S, Asino T, et al．Effect of the immunological antigenicity of the allogeneic tendons on tendon grifting. The Hand, 1-119．24.&Richard H, Gelberman MD, Jerry S, et al．Flexor tendon healing and restoration of the gliding surface．J Bone Joint Surg, -79.25.&Shino K, Kawasaki T, Hirose H, et al．Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogentle tendon graft. J Bone Joint Surg (Br), -72．26. Horibe S, Shino K, Nagano J, et al．Replacing the medial collateral ligament with an allogeneic tendon graft: An experimental canine study. J Bone Joint Surg (Br), 4.27.&Shadwick RE. Elastic energy storage in tendons: mechanical differences related to function and age. J Appl Physiol, 33-1040.28. Jackson DW, Grood ES, Cohn BT, et al. The effects of in situ freezing on the anterior cruciate ligament. An experimental study in goats. J Bone Joint Surg (Am), 1-213.29.&Conway B, Tomford WW, Mandin HJ, et al Radiosensitivlty of HIV-potential application to steriliation of bone allograpts．AIDS, 8-61230.&Gibbons HJ, Butler DL, Grood ES, et al．Effects of gamma irradiation on the initial mechanical and material properties of goat bone patellar tendon bone allografts. J Orthop Res, 9-218.31.&Macda A, Inoue U, Shino K, et al．Effects of solvent prservation with or without gamma irradiation on the material properties of canine tendon allografts. J Orthop Res, 1-189.32.Zimmerman MC, Contiliano JH, ParsonsJR, et al. The biomechanic and histopathology of chemically processed patellar tendon allografts of anterior cruciate ligament replacement. Am J Sports Med, 8-386.33.&Hirsch C. Tensile properties during tendon healing: acomparative study of intact and sutured rabbit peroneus brevis tendons. Act Orthop Scand, 1994, 22(Supply): 135-153.34.&Shino K, Oakes BW, Horibe S, et al. Collagen fibril populations in human anterior cruciate ligament allografts electron microscopic analysis. Am J Sports Med, 3-209.35.&Harner CD, Olson E, Irrgang JJ, et al. Allograft versus autograft anterior cruciate ligament reconstruction: 3 to 52 year outcome. Clin Orthop, : 134-144.36.&Shelton WR, Papendick L, Dukes AD. Autograft versus allograft anterior cruciate ligament reconstruction. Arthroscopy, 6-449.37.&Goertzen MJ, Buitkamp J, Clahsen H, et al. Cell survival following bone anterior cruciate ligament bone allograft transplantation: DNA fingerprints, segregation, and collagen morphological analysis of multiple markers in the canine model. Arch Orthop Trauma Surg, : 208-214.38.Strickland JW. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am], 4-235.39.&Peterson RK, Shelton WR, Bomboy AL. Allograft versus autograft patellar tendon anterior cruciate ligament reconstruction: A 52 year follow-up. Arthroscopy, -13.40.Tom JA, Rodeo SA. Soft tissue allografts for knee reconstruction in sports medicine. Clin Orthop, 5-156.41.&Eastlund T. Bacterial infection transmitted by human tissue allograft transplantation. Cell Tissue Bank, -166.42.&Schwartz HE, Matava MJ, Proch FS, et al. The effect of gamma irradiation on anterior cruciate ligament allograft biomechanical and biochemical properties in the caprine model at time zero and at 6 months after surgery. Am J Sports Med, 47-1755.
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