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关于qPCR内参CT值始终过大的原因
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请教各位，组织提好rna，260/280在1.8-2.0之间，浓度尚可，逆转录用2ug，20ul体系，qPCR后内参GAPDH的CT值一直在28左右，中间多次调整cDNA的浓度和量，也试过不稀释cDNA直接加2ul，20ul体系，可CT值还是变化不大，请问就是RNA存在降解的原因吗？还有其他原因吗？如果电泳下来确实有降解，有什么解决办法吗？做了好多次做不出来，急死了，求教！！！附内参的溶解曲线
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内参做不好多数是降解导致的，当然也要排除试剂问题建议找个之前做过的，没有问题的cdna做阳性对照
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seuzsl 内参做不好多数是降解导致的，当然也要排除试剂问题建议找个之前做过的，没有问题的cdna做阳性对照谢谢！做其他样本是有做出过内参正常的，试剂应该没问题，那么请问是我的标本存放过久呢？还是抽提的过程中产生的降解呢？组织大约放-80冰箱放了三个月左右，如果有降解为什么测得rna浓度还可以，不低，有什么办法解决呢？
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zhangyiecho seuzsl 内参做不好多数是降解导致的，当然也要排除试剂问题建议找个之前做过的，没有问题的cdna做阳性对照谢谢！做其他样本是有做出过内参正常的，试剂应该没问题，那么请问是我的标本存放过久呢？还是抽提的过程中产生的降解呢？组织大约放-80冰箱放了三个月左右，如果有降解为什么测得rna浓度还可以，不低，有什么办法解决呢？首先你要明白rna浓度跟降解没有多大关键性，虽然发生了降解，但是残存的rna还很多，也就是不完整的rna，要判断是否降解只能靠跑电泳-80摄氏度冻存标本前要先放液氮速冻1分钟然后快速转移到冰箱，这样可以保存2年，或用rna locker预处理可长期保存
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seuzsl zhangyiecho seuzsl 内参做不好多数是降解导致的，当然也要排除试剂问题建议找个之前做过的，没有问题的cdna做阳性对照谢谢！做其他样本是有做出过内参正常的，试剂应该没问题，那么请问是我的标本存放过久呢？还是抽提的过程中产生的降解呢？组织大约放-80冰箱放了三个月左右，如果有降解为什么测得rna浓度还可以，不低，有什么办法解决呢？首先你要明白rna浓度跟降解没有多大关键性，虽然发生了降解，但是残存的rna还很多，也就是不完整的rna，要判断是否降解只能靠跑电泳-80摄氏度冻存标本前要先放液氮速冻1分钟然后快速转移到冰箱，这样可以保存2年，或用rna locker预处理可长期保存嗯嗯，是这样处理的！十分感谢?我会再跑个电泳看看，以及逆转录的试剂盒再换一个试试
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zhangyiecho seuzsl 内参做不好多数是降解导致的，当然也要排除试剂问题建议找个之前做过的，没有问题的cdna做阳性对照谢谢！做其他样本是有做出过内参正常的，试剂应该没问题，那么请问是我的标本存放过久呢？还是抽提的过程中产生的降解呢？组织大约放-80冰箱放了三个月左右，如果有降解为什么测得rna浓度还可以，不低，有什么办法解决呢？如果其它样本不是同一类组织细胞，那就有可能是因为内参在这种组织细胞内的表达量低
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还要看看做反转的试剂盒的说明书，看20ul体系最多能反转多少量的RNA。如果超出范围，会影响qpcr的。
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特洛克 zhangyiecho seuzsl 内参做不好多数是降解导致的，当然也要排除试剂问题建议找个之前做过的，没有问题的cdna做阳性对照谢谢！做其他样本是有做出过内参正常的，试剂应该没问题，那么请问是我的标本存放过久呢？还是抽提的过程中产生的降解呢？组织大约放-80冰箱放了三个月左右，如果有降解为什么测得rna浓度还可以，不低，有什么办法解决呢？如果其它样本不是同一类组织细胞，那就有可能是因为内参在这种组织细胞内的表达量低嗯嗯，这个也是可能的原因之一，不过还是先排除rna降解这个问题
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气气fly4 还要看看做反转的试剂盒的说明书，看20ul体系最多能反转多少量的RNA。如果超出范围，会影响qpcr的。20ul体系都是加的2ugRNA，就是做qPCR的时候加多少量的RNA合适还在摸索中
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有的20ul体系只反转1ugRNA，后面可以做个梯度试试看
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气气fly4 有的20ul体系只反转1ugRNA，后面可以做个梯度试试看嗯嗯，做过几十钠克到2ug的几个梯度，结果相差不大，加的多的CT值较小
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zhangyiecho 请教各位，组织提好rna，260/280在1.8-2.0之间，浓度尚可，逆转录用2ug，20ul体系，qPCR后内参GAPDH的CT值一直在28左右，中间多次调整cDNA的浓度和量，也试过不稀释cDNA直接加2ul，20ul体系，可CT值还是变化不大，请问就是RNA存在降解的原因吗？还有其他原因吗？如果电泳下来确实有降解，有什么解决办法吗？做了好多次做不出来，急死了，求教！！！附内参的溶解曲线各位，我重新提了新鲜的组织，也换了新的RNA提取试剂盒，结果GAPDH的CT值还是在25-28，现在只能怀疑是不是在这个组织里GAPDH的表达量本来就不好了...我的组织是人的胃黏膜...
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靠，我是肠粘膜，也很高！不知道是啥原因，请问楼主找到解决方法了吗
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非人类de生物 靠，我是肠粘膜，也很高！不知道是啥原因，请问楼主找到解决方法了吗没有呢，我打算换个内参试试
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zhangyiecho 非人类de生物 靠，我是肠粘膜，也很高！不知道是啥原因，请问楼主找到解决方法了吗没有呢，我打算换个内参试试我换了好几个不同的gapdh都不行，现在想换βactin
简直要怀疑人生了
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楼主，请问你找到原因了没有，我也试过同样的情况，同样新鲜提取的还是这样。。。我用的是beta catin 和ubc。。。我的天。。。我的还是肿瘤组织。。。。
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看一下引物的扩增效率
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引物特异性没有问题，浓度增加没有问题，试剂也没有问题，那只能说明要么rna 讲解，引物要么扩增效率不高。建议做个跑胶，或者提新鲜组织试一下，做个标准曲线看看扩增效率，要么换个内参看看如何
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遍地花香 引物特异性没有问题，浓度增加没有问题，试剂也没有问题，那只能说明要么rna 讲解，引物要么扩增效率不高。建议做个跑胶，或者提新鲜组织试一下，做个标准曲线看看扩增效率，要么换个内参看看如何谢谢！我换了beta-actin，CT值降到20左右了！
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【求助】内参Ct值比目的基因Ct值还要高？？
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这个帖子发布于6年零295天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位前辈你们好，最近我做了两次real time PCR，结果是内参（GAPDH）和目的基因的Ct都是在26-27附近，而且内参的Ct值比目的基因的还要大一点儿，我用的是ABI7500，试剂盒是Takara SYBR(R) Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）条件是按说明书上（退火60度，时间34秒）。有一个问题是我的RNA提出来后测的OD值都比较低（DEPC水溶解），A260/A280和A260/A230分别为1.7、1.0（样品1），1.53、1.48（样品2），1.7、1.85（样品3），1.91、1.85（样品4），可能有蛋白质或酚的污染，请问有没有可能是RNA质量差造成上边的结果？这样的RNA质量作Real time PCR，结果是不是就不准了？？谢谢指点
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1. Ct值在12～32之间均可；2. Ct值由基因丰度和cDNA稀释倍数决定；3. 设NTC排除基因组污染，或RNA用Dnase处理，或使用跨内含子引物；4. 测RNA时OD值影响因素很多，如果整个上样液都用DEPC水，A260/A280大于1.6是可以接受的（1.5的也做得出！）；A260/A230当然最好大于2.0。特别注意到是上样稀释不要太稀，单个OD值（尤其是A260）小于0.1（不同等机器不同，我们这里用的eppendof的）结果不可靠，这个影响对A260/A280的影响似乎更大！当然你不放心最好再纯化一下：）
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今天换了个内参的引物（还是GAPDH），平均Ct值为24.273，目的基因是27.948，溶解曲线显示没有二聚体，跑了个胶显示条带也是我要的大小，请问这样的内参数据可以吗？内参Ct是不是要在20以内才行啊？
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你的cDNA里有没有基因组DNA污染啊？你试着把当时提的RNA当模板，看是不是也能批出你要的条带，是的话你的实验就不准确了。
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1. Ct值在12～32之间均可；2. Ct值由基因丰度和cDNA稀释倍数决定；3. 设NTC排除基因组污染，或RNA用Dnase处理，或使用跨内含子引物；4. 测RNA时OD值影响因素很多，如果整个上样液都用DEPC水，A260/A280大于1.6是可以接受的（1.5的也做得出！）；A260/A230当然最好大于2.0。特别注意到是上样稀释不要太稀，单个OD值（尤其是A260）小于0.1（不同等机器不同，我们这里用的eppendof的）结果不可靠，这个影响对A260/A280的影响似乎更大！当然你不放心最好再纯化一下：）
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请问如果两个样本之间有50倍差异，CT值差别会大约是多少？谢谢！
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ddkeepmoving
各位前辈你们好，最近我做了两次real time
PCR，结果是内参（GAPDH）和目的基因的Ct都是在26-27附近，而且内参的Ct值比目的基因的还要大一点儿，我用的是ABI7500，试剂盒是Takara
SYBR(R) Premix Ex TaqTM II（Perfect Real
Time）条件是按说明书上（退火60度，时间34秒）。有一个问题是我的RNA提出来后测的OD值都比较低（DEPC水溶解），A260/A280和A260/A230分别为1.7、1.0（样品1），1.53、1.48（样品2），1.7、1.85（样品3），1.91、1.85（样品4），可能有蛋白质或酚的污染，请问有没有可能是RNA质量差造成上边的结果？这样的RNA质量作Real
time PCR，结果是不是就不准了？？谢谢指点 您好！请问您的问题解决了吗？我最近在做miRNA,内参u6的CT值比目的基因还要大，不知道是怎么回事。
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各位前辈，我最近刚开始做miRNA预实验，内参U6 CT值比目的要大，选择二个miRNA都是这样，期待大家的回复
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panyonglu ddkeepmoving各位前辈你们好，最近我做了两次real time
PCR，结果是内参（GAPDH）和目的基因的Ct都是在26-27附近，而且内参的Ct值比目的基因的还要大一点儿，我用的是ABI7500，试剂盒是Takara
SYBR(R) Premix Ex TaqTM II（Perfect Real
Time）条件是按说明书上（退火60度，时间34秒）。有一个问题是我的RNA提出来后测的OD值都比较低（DEPC水溶解），A260/A280和A260/A230分别为1.7、1.0（样品1），1.53、1.48（样品2），1.7、1.85（样品3），1.91、1.85（样品4），可能有蛋白质或酚的污染，请问有没有可能是RNA质量差造成上边的结果？这样的RNA质量作Real
time PCR，结果是不是就不准了？？谢谢指点您好！请问您的问题解决了吗？我最近在做miRNA,内参u6的CT值比目的基因还要大，不知道是怎么回事。请问你解决了吗？我也是血浆跑miRNA用U6的内参出现了这样的情况，内参比目的基因大。
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ddkeepmoving 今天换了个内参的引物（还是GAPDH），平均Ct值为24.273，目的基因是27.948，溶解曲线显示没有二聚体，跑了个胶显示条带也是我要的大小，请问这样的内参数据可以吗？内参Ct是不是要在20以内才行啊？我用的跟你一样的试剂盒，内参也是GAPDH,为什么我的内参ct全是14点多啊
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歪歪yy哈叫刘二胖 panyonglu ddkeepmoving各位前辈你们好，最近我做了两次real time
PCR，结果是内参（GAPDH）和目的基因的Ct都是在26-27附近，而且内参的Ct值比目的基因的还要大一点儿，我用的是ABI7500，试剂盒是Takara
SYBR(R) Premix Ex TaqTM II（Perfect Real
Time）条件是按说明书上（退火60度，时间34秒）。有一个问题是我的RNA提出来后测的OD值都比较低（DEPC水溶解），A260/A280和A260/A230分别为1.7、1.0（样品1），1.53、1.48（样品2），1.7、1.85（样品3），1.91、1.85（样品4），可能有蛋白质或酚的污染，请问有没有可能是RNA质量差造成上边的结果？这样的RNA质量作Real
time PCR，结果是不是就不准了？？谢谢指点您好！请问您的问题解决了吗？我最近在做miRNA,内参u6的CT值比目的基因还要大，不知道是怎么回事。请问你解决了吗？我也是血浆跑miRNA用U6的内参出现了这样的情况，内参比目的基因大。我现在在锐博公司合成RT引物和PCR引物，用takara试剂盒跑，效果还可以，至少比以前的好。
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panyonglu 歪歪yy哈叫刘二胖 panyonglu ddkeepmoving各位前辈你们好，最近我做了两次real time
PCR，结果是内参（GAPDH）和目的基因的Ct都是在26-27附近，而且内参的Ct值比目的基因的还要大一点儿，我用的是ABI7500，试剂盒是Takara
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time PCR，结果是不是就不准了？？谢谢指点您好！请问您的问题解决了吗？我最近在做miRNA,内参u6的CT值比目的基因还要大，不知道是怎么回事。请问你解决了吗？我也是血浆跑miRNA用U6的内参出现了这样的情况，内参比目的基因大。我现在在锐博公司合成RT引物和PCR引物，用takara试剂盒跑，效果还可以，至少比以前的好。请问你也是用的血浆？
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关于丁香园急问：内参照的Ct值(内参照,指数增长,循环次数,实时定量) - PCR实验 - 生物秀
标题: 急问：内参照的Ct值(内参照,指数增长,循环次数,实时定量)
摘要: [急问：内参照的Ct值(内参照,指数增长,循环次数,实时定量)] 通过前辈的介绍了解到：正常的ct值范围在18-30之间，ct值应是荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数 如果正常情况下大于30应可以定为阴性。因为最近我也在用SYBR Green做实时定量PCR, 所以也想向各位前辈请教一下有关Ct值的问题。我的结果中待测基因的Ct值大多在18-25之间，但唯独内参照的Ct值很低。第一次做时基本都在10左右，将模板稀释10倍后第二次的内参照的C 关键词:[内参照 循环次数 实时定量 指数增长 荧光信号 模板稀释 准确度]……
通过前辈的介绍了解到：正常的ct值范围在18-30之间，ct值应是荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数 如果正常情况下大于30应可以定为阴性。因为最近我也在用SYBR Green做实时, 所以也想向各位前辈请教一下有关Ct值的问题。我的结果中待测基因的Ct值大多在18-25之间，但唯独内参照的Ct值很低。第一次做时基本都在10左右，将模板稀释10倍后第二次的内参照的Ct值还是在12-14之间。以这样的数据分析会影响结果的准确度吗？或者还是将模板继续稀释，直到ct值都达到18-30之间呢多谢指点！
回复没必要吧一般ct超过30是不好但要是三个重复都这样也还是可以用的啊每次都做阴性对照阴性对照ct为0，那ct30就肯定不是污染而是基因表达量低或是模板太稀内参ct为10－14都正常啊没必要再稀释模板了那样你的目的基因ct又要超过30了不过内参ct太低低于10也是不太好结果可能会有偏差回复个人觉得内参Ct值太低了，可以再稀释100或者1000倍。回复我已经把c模板稀释100倍，重跑内参后Ct值达到了18-25，但以同浓度的c模板检测目的基因后，目的基因的Ct值又高于30了。我用的内参是大鼠的18sRNA, 它的表达太强了。强烈建议大家以后不要选它做内参！所以现在想换其他内参试试，前辈们能再给提点建议吗，是选GAPDH 还是β-actin 更适合大鼠组织呢？多谢!回复我早说过不能稀释模板了我说的“不过内参ct太低低于10也是不太好结果可能会有偏差 ”就是指的18s我们以前也用过ct小于10结果偏差很大所以我们现在都不用它了我想用GAPDH还是ACTIN其实都差不多很多人都觉得GAPDH很不准选用ACTIN的可能比较多但是若你的样品是病毒诱导的，或是对细胞骨架有影响的还是不要用a"c"tin所以就很矛盾了要严格点就做实验证明你选用的内参不会因为你的处理而改变不过一般人都不会花这个时间做这个那怎么办呢我个人认为这部分结果要是不是你主要结果你就不用考虑那么多选actin做内参即使不准，至少可以反应一个趋势你可以用其他实验来验证你的结果本来很多专家都不是很相信realtime的结果作那么认真还不如多用几种方法来验证如果这是你文章非常重要的结果那么你就做实验验证你的内参把回复感谢 jiangjun82313 的详细解答。 我用的样本是胰岛，检测与增殖、凋亡有关的基因，所以应该可以用actin。回复我用的是GAPDH，在小肠里表达太高，CT16-18，而目的基因CT35-36，这怎么办？回复對了，我用的小肠cDNA稀释了十倍回复可以稀释的，目的基因Ct值略高于30完全没有问题，稀释100倍后，你的所有扩增曲线都应该在18－30＋，肯定是可以分析的。最好你能把图贴上来看看。
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电话：021-用SYBR Green-PCR做相对定量,加RNA量一致,那么所有内参的CT值是不是要求一致,至少相差不大?
理论上是越一致越好.如果有很大的差异,说明实验有较大的误差,或者样本有降解.
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当然内参的CT最好一致喽，不过许多情况下内参（比如GAPDH什么的）是不一致的，但是考虑到各种组织中内参含量几乎没有太大差异，可以得出相对的比值来反应目的片段在各种组织或者处理下的差异
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请问：做荧光定量pcr时,△△ct值是什么意思,它的计算公式是什么?
    优质解答△△ct = △ct(试验样品) ― △ct(基准样品)△ct(试验样品) = ct（试验样品,目的基因） ― ct（试验样品,内参基因）△ct(基准样品) = ct（基准样品,目的基因） ― ct（基准样品,内参基因）2 －△△ct =2 －（－1.2）= 2.30阿里-29
收录时间:日 14:45:19 来源:未知 作者:匿名
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