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第一次做RT-,也没人具体带,所以比较迷茫
荧光定量PCR,用了4个动物标本的CDNA,测同一个指标
目的基因的曲线大多杂乱,极个别有单峰曲线,但是CT值也非常大
4个的内参的曲线单峰,CT值30几
把PCR结果跑了下胶,
4个标本的都没有跑出条带,内参的可以跑出目的条带
请问下 这种情况是可能是引物原因还是加样之类的? 有什么方法可以确定么?
另:因实验室分光光度计不太准,没有测过
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可以先用CDNA和内参基因跑一下普通的PCR，如果能有目的条带，可以说明是引物的问题。如果加样不准确会造成峰值高低的不一致，但不会出现杂峰之类的。
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之前用realtime pcr做的
CDNA和内参基因的扩增产物跑胶可以得到目的条带 是不是和普通PCR的效果一样？
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是的。其实RT-PCR也是PCR的一种，只是加了荧光染料便于实时监测。
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那么根据realtime pcr结果理论上来说
我的CDNA 没问题?
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基本应该是这样，如果你得到的目的条带没有引物二聚体的干扰。
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感觉是引物问题吧
更新你的简历，加入生物秀人才库，高薪工作基因编辑峰会支持人类胚胎研究(胚胎、基因细胞治疗：生物医药产业下一个风口(细胞治生物秀论坛手机版全新改版,更快速度,更好体聚焦“基因剪刀”奠基人的科研历程
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murongxiaoxiao大叔级摄影爱好者，喜欢分享绝对零度积极有责任心，热心公益事业yiii红米达人，爱拍照的北京女孩关注今日：9 | 主题：278240
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【求助】荧光定量PCR操作规程（组织）
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这个帖子发布于7年零104天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
:)急，希望快点！
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总RNA提取：1．
用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品，保存于液氮内样品需要用研钵磨碎，每50~100mg组织加1ml的裂解液RL后匀浆。组织样品容积不能超过RL容积的10%。2．
将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15 -30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。3．
每1mlRL加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。4．
于4℃12，000rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。5．
加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内）。6．
10，000rpm 离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。7．
加500μl 去蛋白液RE，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液。8．
加500μl 去蛋白液RD，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液。9．
加入700μl漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。将吸附柱RA放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。10．取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加50-80μl RNase free water（事先在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000 rpm 离心1分钟。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟,或者另外再加30μl RNase free water，离心1分钟，合并两次洗脱液。如有DNA污染，请用DNAase消化。cDNA合成：1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物：模板RNA：总RNA 2μg引物：Oligo(dT)18 (0.5μg/μl) 1μl无RNA 酶去离子水（RNase-free ddH2O）：定容至11μl。2．轻轻混匀后，在70℃水浴5 分钟后，冰浴。3．将试管冰浴，再加入如下组分：5×Reaction Buffer 4μlRNase Inhibitor (40U/μl) 0.5μldNTP Mix(10mmol/L) 2μl加水至19μl，轻轻混匀后，在37℃水浴5 分钟。4．轻轻混匀后离心3~5 秒。加入1μl M-MLV RT（200U/μl），终体积为20μl。5．反应混合物42℃水浴60 分钟。6．在70℃加热10 分钟结束反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。定量PCR：定量PCR反应体系：cDNA　　　　　　　　　1μl引物10pm/μl　　　　　
0.4/0.4μlSYBR PCR mix　
10μl去离子水　　　　　　　 8.2μlTotal
20μl反应程序：循环数
起始模板变性40
每增加0.5℃反应十秒
试验仪器：荧光定量仪器biorad iq5:)希望对你有所帮助。
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谢谢楼主 真的很实用
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【求助】荧光定量PCR引物
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这个帖子发布于3年零128天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已关闭悬赏丁当:2
最近做荧光定量PCR, 用的SYBR green I , 模板是基因组DNA，内参引物和目的引物都来自文献，内参引物是用的β-globin，但PCR批不出来。文献用SYBR green I做这方面的比较少，用探针的比较多，但是用SYBR green I的文献内参用的β-globin，而探针的内参用的β-actin，这是什么原因呢？我们相用SYBR green 做，但globin引物不好用，请问各位站友，我是否可以用探针法的引物β-actin呢？探针法和荧光法Q-PCR引物有什么区别吗？
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染料法扩增产物电泳必须得是单一条带，而探针法有时候不单一，从电泳上看有非特异性反应。为什么不能自己设计一下染料法的引物呢？
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梦飞翔荣 最近做荧光定量PCR, 用的SYBR green I , 模板是基因组DNA，内参引物和目的引物都来自文献，内参引物是用的β-globin，但PCR批不出来。文献用SYBR green I做这方面的比较少，用探针的比较多，但是用SYBR green I的文献内参用的β-globin，而探针的内参用的β-actin，这是什么原因呢？我们相用SYBR green 做，但globin引物不好用，请问各位站友，我是否可以用探针法的引物β-actin呢？探针法和荧光法Q-PCR引物有什么区别吗？换引物
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tiantian 染料法扩增产物电泳必须得是单一条带，而探针法有时候不单一，从电泳上看有非特异性反应。为什么不能自己设计一下染料法的引物呢？我用的基因组DNA做q-PCR，这样设计引物应该更简单吧，不用考虑跨内含子什么的吧？
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给你个技术交流电话，是主做PCR的
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楼主用的是什么物种的DNA呢，真核还是原核？真核是不能用DNA的，中间有内含子。既然文献报道ACTB既然可以做内参，那么不论在探针法还是荧光法Q-PCR中都是可以用的，楼主可以用的。
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jianzh84 楼主用的是什么物种的DNA呢，真核还是原核？真核是不能用DNA的，中间有内含子。既然文献报道ACTB既然可以做内参，那么不论在探针法还是荧光法Q-PCR中都是可以用的，楼主可以用的。我用的人的基因组DNA，引物也是根据基因组dna设计的，所以没问题。之前可能是普通pcr摸退火温度只是一个大概，我后来做q-pcr，融解曲线还不错。
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关于丁香园& 【求助】怎么筛选合适的QRT-PCR引物
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【求助】怎么筛选合适的QRT-PCR引物
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【求助】怎么筛选合适的QRT-PCR引物
各位秀友，我要做一种真菌的定量pcr,查阅资料发现已经有报道的特异性引物4对，两对曾用于普通PCR，另外两对曾用于荧光定量PCR,为了确定哪对更适合，我已全部合成，我如何看哪对更适合，初步想法是先做普通PCR,从中挑选出两对再做荧光定量，看溶解曲线再确定最佳引物，每对引物都要进行体系优化，退火温度优化，好浪费时间，我该怎么设计这个实验？请大家多给我这个小白提提建议，谢谢！
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TAKARA免费设计啊
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我本来也已经设计好了，但是老板说前人有过报道就要站起人家的肩膀上继续做，不要再重新设计，呜呜~~~~(&_&)~~~~
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lz,&&大家都是这么做的&&
只不过我们用普通pcr试引物时，虽说不上实时定量机器，也用实时定量用的pcr酶来做
省的一换酶又不行
takara的sybr检测，标准程序是60度退货+延伸。所以我们设计引物是就尽量调整好Tm值
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现在我是用普通酶普通PCR,全都扩出来了目的条带，下一步找其他菌来验证是否这四个引物具有较强特异性，这一步应该不会出什么岔子，然后灵敏性检验，我郁闷的是，这些引物别人都用过来做定量了，我怎么才能说明哪个最好，担心做出来效果都好，无法抉择，其实我觉得用一个就可以了，但老师说那样不具有科学精神……纠结啊纠结
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都能做出来不是都一样吗，何必再这上面纠结！关注今日：28 | 主题：304150
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【求助】荧光定量PCR如何该快速设计引物。
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这个帖子发布于2年零44天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
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各位前辈们，小弟正在做荧光定量PCR，关于引物如何设计一头雾水。现在是从NCBI上查到了完整的CDS序列，我该如何根据这个CDS序列进行实时荧光定量PCR的引物呢？恳请各位前辈能帮帮小弟。告知小弟你们的切实可行的办法，越详细越好，谢谢大家了！
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很简单，去IDT网站，他们有个网站可以辅助设计。你选择一个即可。我们试过100多个基因，都没有问题的。
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按照常规设计引物的方法，长度确定为20个碱基，GC含量在40-60，5’端和中间GC含量尽量高一些，3‘末端5个碱基最好少于3个GC，但最后一个碱基是G或者C效果会更好，Tm值在60左右，稍高一点，引物结合目的序列的效率会更高，两对引物之间的Tm值越好在1度以内。记住这几点的话，目测设计就可以了。 不要犯大的错误，比如3‘端后三个碱基互补、有明显的发卡结构。自己设计不是更好么？
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1、查找该物种或近缘物种信息，看是否能确定内含子序列的位置，在CDS上设计跨内含子的引物，以避免基因组污染；2、扩增片段大小最好在200bp左右，太大会影响扩增效率；3、最好一次分别设计两条上游（距离较近）和下游引物（距离较近），组合成4个扩增片段；4、用任何方法或软件设计好的引用都要用少量cDNA样本来验证引物扩增效果：主要是有无二聚体？有无非特异性扩增？5、筛选出一对最满意的引物上机，祝你实验顺利。
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小弟试了一下，不能用啊。。。
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多谢各位前辈，待小弟前去一试
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请问freecell前辈，我进去你说的网站之后，讲CDS序列填了进去。显示(multiple sequences in FASTA format with exons in uppercase letters and introns in lowercase letters, positive orientation, maximum 10) 这是让我分外显子内含子吗？可是我的是CDS序列，没有内含子啊，我该怎么办呢？
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按照常规设计引物的方法，长度确定为20个碱基，GC含量在40-60，5’端和中间GC含量尽量高一些，3‘末端5个碱基最好少于3个GC，但最后一个碱基是G或者C效果会更好，Tm值在60左右，稍高一点，引物结合目的序列的效率会更高，两对引物之间的Tm值越好在1度以内。记住这几点的话，目测设计就可以了。 不要犯大的错误，比如3‘端后三个碱基互补、有明显的发卡结构。自己设计不是更好么？
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sqlove 按照常规设计引物的方法，长度确定为20个碱基，GC含量在40-60，5’端和中间GC含量尽量高一些，3‘末端5个碱基最好少于3个GC，但最后一个碱基是G或者C效果会更好，Tm值在60左右，稍高一点，引物结合目的序列的效率会更高，两对引物之间的Tm值越好在1度以内。记住这几点的话，目测设计就可以了。 不要犯大的错误，比如3‘端后三个碱基互补、有明显的发卡结构。自己设计不是更好么？如果要是全基因序列很长，CDS分好几段，怎么设计引物呀？要设计多对引物么？
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freecell很简单，去IDT网站，他们有个网站可以辅助设计。你选择一个即可。我们试过100多个基因，都没有问题的。亲测有效，投票支持
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