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第三章 核酸的分离与检测.ppt97页
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第三章 核酸的分离与检测
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实验步骤 6、按以下混合好样品（以下为参考值，可视实际样品作调节）。①2 微升样品A，2微升加样缓冲液，10 微升电泳缓冲液。②2 微升样品B，2微升加样缓冲液，10 微升电泳缓冲液。③2 微升样品C，2微升加样缓冲液，10 微升电泳缓冲液。7、在玻片上各把上述样品混合均匀，用微量取液器分别吸取样品，小心将样品注入点样孔内，记录样品的点样顺序。8、点样孔那端的电泳槽负极连接电泳仪负极，另一端连接电泳仪正极，打开电泳仪电源开关（每次打开电源开关时，应检查电压旋扭是否置于零位），调电压至5v/cm（以水平大电泳槽的两极算距离）。9、待溴酚兰带走入凝胶6 厘米后，小心取出微型电泳槽，勿使凝胶滑出，置于保鲜纸上，放在紫外检测仪上，打开紫外灯，观察电泳结果，绘好DNA区带电泳图。 【注意事项】 1.?溴化乙啶是一种强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴手套。 2.?紫外线对人体，尤其是眼睛有危害性。为减少紫外线照射，必须确保紫外线光源受到遮蔽。
基因工程：第三章 Questions 核酸提取的原则和要求？ 核酸提取的一般步骤？ 核酸提取的常用方法有哪些？ 核酸提取过程中SDS、CTAB、EDTA有何作用？ 核酸提取过程中乙醇（无水和70%）有何作用？ 如何除蛋白？ 如何破细胞？在破细胞时需要注意哪些事项？ 如何防止内源性核酸酶对核酸的损失？ 检测核酸浓度和纯度的方法有哪些？基本原理？ 基因工程：第三章 保证完整性：保证核酸分子的一级结构（储存全部遗传信息） * 样品准备： 1、动物材料：清洗-胰酶消化 2、植物材料：清洗-液氮冻结
物理法：超声波法、匀浆法、液氮破碎法、研磨法（动植物细胞） 化学法：去污剂法（SDS法、CTAB法）
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我准备做两重taqman荧光定量PCR,将两对引物放在一起走了荧光定量曲线,用sybr看引物在一起是否能产生特异性的产物.荧光定量PCR后跑电泳检测,现在发现有问题了,大家可以看荧光定量PCR扩增图中绿色的溶解曲线,一个在Tm为80左右的小峰对应的是电泳图上稍大一些的目的产物,而在Tm为86左右的的大峰对应的是电泳图上稍小一些的目的产物,我的问题是,为什么电泳图上亮度差不多,在荧光图上峰却差别那么大呢?不是说峰面积代表了产物量吗?
原因会不会是EB和sybr greenI插入DNA的方式不一样,请大家讨论阿.谢谢了.
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个人的一点看法,供参考.
我认为融解曲线的峰面积并非表征产物的量.先从数学上进行理解,融解曲线是荧光信号对温度的一阶负导数,所以融解曲线的纵轴高度表征的是原始荧光信号的变化率,Tm值对应的融解曲线的峰高表征了目标产物的纯度,生物学含义表征的是表达丰度.打个比方,两个复孔得到同样的Tm值,但融解曲线的高度不同,表征的是在两个复孔中目标产物所占的比例融解曲线峰高的比例高,所以在Tm值位置上变化率最大.从你上面的融解曲线图上,只能说86度左右的产物纯度较高,而80度以下的产物(疑似引物二聚体)纯度较低(里面可能包括很多几个碱基错配的产物,且所占比例相当),所以电泳图产物较亮,而融解曲线峰值不高.
不知解释清楚没有,说起来还是挺复杂的.
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1：我感觉峰高就象您说的是代表目标产物的纯度。
2：峰面积的话我觉得还是应该代表在该峰在Tm范围内的荧光量，也就是我需要的目的产物的荧光量，这个可以通过积分来算。
3：接着2，也可以象您这样的解释，我目标产物较大的片段在电泳图中显示的条带中有其他的带，从而导致在溶解曲线中表现出来峰小，而且矮。
4：我上次看到过一篇关于讲荧光染料的文章，上面说sybr greenI 对CG碱基比较偏爱，这也正好比较符合我的电泳图和real time PCR溶解曲线的峰。因为我较小片段的CG含量丰富，而较片段CG含量较低，这也在一定程度上说明峰的面积还是表示在该Tm范围内荧光量的，请见下文。而EB有没偏爱就不是很清楚了。
Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperature
Nucleic Acids Research,
Haukur Gudnason1, Martin Dufva1, D.D. Bang2 and Anders Wolff1,*
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今天把荧光定量PCR做了pure dye的校正，终于做上FAM和HEX的双重荧光定量，但是问题马上随之而来了。下面是我做的荧光定量图，两条探针分别用FAM和HEX标记。下面3个图依次是：两个目的基因同时扩增（FAM+HEX），一个基因单独扩增（FAM），另一个基因单独扩增（HEX）。这三个反应都重复2次，图1中也就是有8条曲线（FAM 4条，HEX 4条）。模板用量均为转化后提纯的质粒100000copies/ul 加1ul。从图上可以FAM这个基因扩增量明显比HEX更好。
我的问题是：
1：我看到这几个probe反应，一开始荧光量都很高，一般都在之间，比我以前做过的sybr green I荧光值高多了。
2：我两个质粒的用量都是100000个copies左右，得到的CT值在21-23左右，是否可行了？并且我觉得CT值在双重PCR中比单独做还小，这个可能和域值有关系，但是我到时应该怎么选择才好阿？
3：这两个探针的效果怎么样？我没什么经验，只是感觉FAM这个比较好，而HEX这个不是很好，是这样吗？这样的效果能用到双重定量吗？
4：感觉曲线好象还是S型，应该怎么优化呢，退火温度吗？我用的是两步法，62度1min。
5：两个染料在一起做的时候感觉HEX这个扩增曲线不行（见图1），图一中比较高的四条曲线是FAM的，而趴在那里的是HEX。但是单独拿出来分析的时候又觉得不错（见图3），两者的区别只是纵坐标发生了变化。这个又该怎么分析处理呢？
问题好多，谢谢谢谢了。很多naive的问题高手们见笑了。
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试着回答一下：
1.我做实验的时候也发现是这样，可能与发光机理相关。SYBR Green染料法只有双链存在的情况下发光比较强烈，而探针虽然说在水解后5‘端发出强光，但其实在反应初期3’端也会发光，背景比较高；
2.从图上来看，重复样本的重合性也较好，个人认为可以使用。就Ct值来说，的确如你所说，单独做的时候Ct值还比较靠前，这可能与阈值的位置选择有关，双荧光要兼顾两种荧光。不知你使用的定量PCR仪是否有最大二阶导数法的Ct值分析法，采用这种方法不受阈值的限制，可以应用于双荧光分析。如果没有这种分析方法，可以再看看背景基线调整的算法是否有比例法（常用的为算术法），一般做双荧光或多荧光时最好使用比例法的基线调整法，会平衡不同荧光间的差异，然后再调整阈值线，得到Ct值就比较接近单光了；
3.其实不同的荧光标记探针，受染料本身的消光系数、量子产率，以及荧光的光谱和所用仪器的激发光（决定于激发光源是光谱还是单色，及不同谱带上的强度等）、检测器件（不同的检测器件对不同谱带的接受情况不同）的影响，即便是使用同一摩尔浓度的探针，平台期的高度也会不同，这是正常的。如上一条所说，可以用比例法调整基线后进一步分析。如果想了解扩增产物终产量的情况，还是跑个电泳看看更直观；
4.个人认为不需要优化条件了，重复样本的重合性较好（除了HEX有一条差异较大除外）；
5.参见1及3的建议。
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大家好，我最近一直在做多重荧光定量PCR，想做标准曲线，即同管跑两组标准品，从copies/ul，25ul体系里各加1ul。但是结果总不是很好，请帮我分析分析原因，FAM的相关系数很好为0.998，但是扩增效率很低，只有81.8%，而且10copies的浓度中3个重复只有2个有CT值，HEX就更加奇怪，由于10copies的其中一个重复不知什么原因CT下降很多，致使标准曲线很难看。我的问题是：
1：从下图看应该从哪些方面进行优化？FAM的扩增效率为81.8%，如果发文章的话有没影响？
2：HEX的那个点是否可以去掉，我想如果去掉的话应该实验结果不错了。
3：发文章的话，这些扩增图和标准曲线放在文章中，是直接运用原始图的还是在特定的软件中弄好后再放中文章中的？
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继续上面的图，来张HEX的，是和上面的同管。
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下面这张是两条标准曲线在一起的。
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下面是对应的FAM扩增曲线
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下面是对应的HEX扩增曲线
[ 本帖最后由 七彩星星 于
16:12 编辑 ]
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荧光定量问题汇集
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3秒自动关闭窗口荧光定量RT-PCR的操作过程中经常遇到的问题?毕业论文中遇到的困难,比较难解决,荧光定量RT-PCR检测蚊虫中的某种病毒,用的是核酸染料,结果出了两个峰值,有哪些原因呢?
非特异性扩增,或者引物二聚体,建议跑琼脂糖电泳确定,然后调整PCR条件.
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