做标准曲线的这些疑问你有吗？
做标准曲线的这些疑问你有吗？
标准曲线法是仪器分析中最常用的方法，这类仪器包括原子吸收分光光度计、发射光谱仪、分光光度计、气相（液相）色谱仪等。标准曲线的制作中，会有这样那样的问题，大家多数都是口口经验相传，至于是否有相关文件规定到底怎样的才是标准，很多人是不确定的，比如，常有人问：一定要做5个点？线性相关系数R值必须几个9才达标？标曲是每天都做还是每次都做？标曲是否必须通过原点？。。。今天小编整理了标曲相关问题，一起来解惑吧！
GB/T中标准曲线的做法
GB/T《基于标准样品的线性校准》中：1、标准曲线的浓度范围应覆盖正常操作条件下的被测量范围；2、标准样品的组分尽量与被测样品组分一致；3、标准样品的浓度值应等距离的分布在被测量范围；4、标准样品的个数至少应有3个浓度；5、每个标准点至少重复2次，这个重复是指从稀释开始；如果国家标准有相应的浓度系列推荐，尽量按国家标准。工作中我们经常采用线性校准，因为线性方程最为简洁。
首先标曲要做几个点？标准曲线需要几个数据点，是由所检测组分的浓度范围、分析仪响应特性、干扰因素、浓度与检测信号响应类型有关的。3个点：对于一些低浓度，特别是微量分析，并且浓度范围不是很大的，检测器响应可靠，背景干扰非常小的，则可以选用较少的工作点就行，一般有3个浓度点就足够了，有些甚至可以只用一个浓度点就行，另一个点直接用坐标原点。4~6 个点：对于平时测量的样品浓度范围较宽，并且检测器响应不完全是一次曲线（直线）的，可以采用二次曲线或分段校正方式，以减少数据偏差，这种情况就需要多用几个数据点，如果不分段，数据点有4~6 个就够用。至少两个点：但如果是分段校正，则每段需要至少两个数据点。而对于一些样品无浓度范围规律的，特别是一些检测机构，如果分析仪的检测响应可靠，环境因素影响少的，可以做校正曲线。若是环境因素影响大的，则不必做校正曲线，而采用标准加入法或标准加入-一次稀释法反而简便一些。 实际上，我们一般是做五个点（不包括零浓度）；一般以检出限的5~10倍为第一个点，以后根据1倍（或接近一倍）递增，最高浓度是最低浓度的10~20倍为宜。当然，要根据仪器的灵敏度来调整。 标曲R值是几个9才合格？ 实验室应按检测标准（方法）的要求使用标准溶液或标准物质建立标准曲线。所用标准溶液或标准物质应覆盖被测样品的浓度范围。检测标准（方法）如无具体的要求，至少使用5个标样（除空白外）建立线性标准曲线，每个点重复测定1-3次，对于筛选方法，线性回归方程的相关系数不应低于0.98，对于确证方法，相关系数不应低于0.99。其实〉0.99是判断是否为线性相关的一个标准，实际应用中线性 〉0.999才是比较理想的。线性在0.99到0.999之间的监测结果只用接近最高浓度一半（中间浓度）的位置才比较准确，如果线性大于0.999的话，在整个线性范围内都会有一个比较满意的结果。 如果检测的线性不好，可以减少标准的覆盖范围，将标准的浓度调整到待测样品浓度附近，这样结果也是非常准确的。例如，样品的浓度约20ppb,但在0~50ppb范围建立标准曲线，但线性非常不理想，这时可以将标准范围调整到15~25ppb之间，作五个标准。
标准曲线建立后。。。 标准曲线建立后应在样品的检测中消除空白造成的影响。高于接受限的试剂空白表示与空白同时分析的这批样品可能受到污染，检测结果不能被接受。标准曲线建立后，必要时应在分析样品前加标，添加物浓度水平应接近分析物浓度或在校准曲线中间范围浓度内，加入的添加物总量不应显著改变样品基体。 标准曲线有效期到底怎么规定的？ （1）标准曲线属于实验室质量控制的范围，按照《实验室资质认定评审准则》中结果控制的要求：定期使用有证标准物质（参考物质）进行监控和/或使用次级标准物质（参考物质）开展内部质量控制。（2）准则中并未对“定期”进行规定，所以如果“定期”，就根据实验室的实际情况来定了。（3）既然准则上没说明，那根据一般的分析教材，当实验条件（包括药剂、人员、仪器等）发生变化时，最好重新制作标准曲线。一般来说仪器如果长期使用，并经过检定，是处于稳定状态，而人员药剂的变化往往会较大。如果说每次换个人操作都要换曲线，那工作量就太大了。每次开机都必须做标准曲线？从药品检测的要求来说，因为：1、每天所配的流动相都会有所不同，导致出峰的时间都会有一定的差异，峰面积相应都有所差异。2、检测器光能也在不断的衰弱，因此其每天的相应值也有所不同，其峰面积也有差异。基于以上原因，原则上应该是每天都要进行标准曲线校正的。 标准曲线不要每次都做，但是每次必须进标准品样品；因为每次你的流动相和原来的不可能完全一样，同时仪器的状态也在变化，所以不同批次间的保留时间是不一致的，所以你必须用随行标准品来定位与定量；你可以这样解决标准品很贵的问题：如果你的样品很稳定，你到是可以配成储备液，配成浓溶液保存，每次用的时候再稀释，但请注意比较每次标准品的吸收峰面积，如果变化很少，证明你配的储备液还可以，否则就需要新配了！ 一般校准曲线不能长期使用每批样品应测定一个校准曲线中间点浓度的标准液，其测定浓度与校准曲线标准点的浓度相对误差不得超过规定范围，如果超过规定相对误差，需重新绘制校准曲线。也可以这样说，不同的分析项目,不同的分析方法,校准曲线斜率的稳定性不同。如校准曲线的斜率较为稳定,则在样品分析时,可只测定两个标准点,当此两个标准点与原曲线相应点的相对偏差均小于5%时,可使用原校准曲线。因此,样品分析前,需根据斜率的稳定性来确定是否需同时制作校准曲线。 所以，标曲不需每天都做！我们一般的做法是，根据检测的频率来做，如果该项目天天都要检测，并且检测量较多时，要求至少每周做一次曲线。如果检测量上，一个月都没有几单的话，就一个月做一次曲线。当然，仪器如果出现故障并大修后回来的，经过检定后，需要重新做曲线。 标准曲线是否必须过原点？标准曲线不一定非要过原点，只要线性好就可以了。因为做空白的话基本上不会过原点。过原点是强制过的，实际曲线可能不过，就会造成误差。不过原点是因为有系统误差。不过系统误差的话，大家都误差也就抵消了，没有太大影响， 针对是否过原点(0,0)问题，我想可以从原点(0,0)代表的意义来考虑：即所测组分浓度为零的时候，信号响应值（液相色谱也就是峰高或者峰面积）是否也为零。通常来说色谱分析是属于这种情况的，因而可以把（0,0）点作为一个浓度水平计入标准曲线（甚至不需要真的去配一个浓度为零的标准溶液来进样），这也是单点法定量的一个依据；而类似的情况在光谱法测定时就讲不通了，浓度为零的标准溶液（本底）响应信号（吸光度）往往不是零，这个时候标准曲线就不一定过原点了。 标准曲线的线性范围 线性范围这个大家都比较清楚，主要从相关系数r看，一般要求r大于等于三个九。之前做实验有时候浓度高时，线性不好，高浓度点不在标准曲线上，而是在标准曲线的下面，而且离拟合的标准曲线比较远。遇到这种情况，标准曲线的线性相关系数就很差，有时候才一个九，最后我终于想明白了，如果自己用手动拟合的话，用平滑的曲线去连接所有点的话，你就会发现，如果在线性范围内，连接起来就是直线，如果超出了线性范围，连接起来就是一条弯曲的曲线。 标准曲线的相关系数的有效数字该如何保留呢？ GB6 8.2.7项有如下规定：校准曲线相关系数只舍不入，保留到小数点后出现非9的一位，如0.98。如果小数点后都是9时，最多保留小数点后4位。
小结标准曲线法有一定的优势，也有一定的缺陷，它特别适合于大量样品的分析。但由于每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。
了解各个分析项目校准曲线斜率的稳定性及影响稳定性的主要因素,可决定是否能采用带标点检验原校准曲线,省略重新制作校准曲线;从校准曲线斜率的变化,可判断标准溶液的稳定性,从而确定其标定周期;分析低浓度样品时,应使用高纯度的水和试剂,以减少空白值,降低样品的分析误差。总之,科学地运用校准曲线,对于降低分析成本、提高检测质量有着重要的意义。（本文资料部分来自标准体系文件，由实验与分析编辑整理，版权所有，转载请联系小析姐，征得同意后方可转载，并在显眼处注明来源，否则一律做侵权行为处理，谢谢大家关注！）
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你可能喜欢吸光度和样品稀释问题 - 实验交流 - 生物秀
标题: 吸光度和样品稀释问题
摘要: [吸光度和样品稀释问题] 你好，向大家请教一下，我的是要做总糖含量测定，但是我的葡萄糖标线读数最小的就是1 7，后面几个浓度读数都一样，这是不是就说明我的葡萄糖标准品浓度过大，需要稀释呢，我目测我的样品颜色比葡萄糖深好多，是不是更加需要稀释，而且样品要比标准品稀释倍数更大，这样做会不会误差也很大，我应该具体怎么稀释能让我的样 关键词:[还原糖 稀释倍数 吸光度 葡萄糖 标准品 硫酸 苯酚]……
你好，向大家请教一下，我的是要做总糖含量测定，但是我的葡萄糖标线读数最小的就是1.7，后面几个浓度读数都一样，这是不是就说明我的葡萄糖标准品浓度过大，需要稀释呢，我目测我的样品颜色比葡萄糖深好多，是不是更加需要稀释，而且样品要比标准品稀释倍数更大，这样做会不会误差也很大，我应该具体怎么稀释能让我的样品的吸光度落在标准曲线上面呢？另外，是所有的紫外的读书都是在0.2-0.8之间是最准确的吗？希望赐教！万分感谢！！！！回复基本上读数落在0.2-0.8.不可以稀释3倍或4倍再进行操作，结果就比较精确。祝成功！回复基本上读数落在0.2-0.8.可以稀释3倍或4倍再进行操作，结果就比较精确。祝成功回复
基本上读数落在0.2-0.8.不可以稀释3倍或4倍再进行操作，结果就比较精确。祝成功！ 标线稀释3倍或4倍，那样品是不是要稀释的更多倍数回复我一般是按照梯度稀释法10倍，100倍这样稀释的，最好是能一步稀释到位，而且样品和标品应该稀释相同的倍数，否则误差很大。吸光度不一定非要在0.2~0.8之间，0~1之间就很合理了。回复
我一般是按照梯度稀释法10倍，100倍这样稀释的，最好是能一步稀释到位，而且样品和标品应该稀释相同的倍数，否则误差很大。吸光度不一定非要在0.2~0.8之间，0~1之间就很合理了。 我这样问不知道你能不能理解：标线稀释了10倍，得到的OD要乘以稀释倍数就是10，才是原来标线的OD，对吧，然后样品要是也想稀释同样的倍数，得到的OD直接在标线上找出对应的含糖量，含糖量再乘以稀释倍数是样品正常应该含有的糖量，是这样做吗？还是要样品稀释后得到的OD乘以稀释倍数再在标线上找出对应的含糖量，这样的话，结果肯定不在标线所测的范围内啊:sweat:回复
我这样问不知道你能不能理解：标线稀释了10倍，得到的OD要乘以稀释倍数就是10，才是原来标线的OD，对吧，然后样品要是也想稀释同样的倍数，得到的OD直接在标线上找出对应的含糖量，含糖量再乘以稀释倍数是样品正常 ... 我觉得不对。OD值是不应该换算的，能换算的只能是浓度。你的稀释只是把样品浓度稀释了，而不是OD值。我觉得应该是这样子的：首先，将标线按10或者其他倍数浓度稀释，稀释之后的浓度是可以算出来吧，OD也是可以测出来的。这样就有了浓度和吸光度的标准曲线。然后你的样品按一定倍数稀释，稀释之后的OD能在标准曲线上找到一个浓度值，这个浓度乘以样品的稀释倍数，就是样品的浓度了。不用考虑标线原来的浓度，浓度可以换算，OD不可以。回复假如你标线稀释10倍，样品稀释50倍的话，计算总糖时要乘于的稀释倍数是(50/10=5)，即乘于5。尽量使吸光度落在0.2-0.8这样精确些，所以你的标线和样品都要稀释到0.2-0.8。但是稀释倍数可以不一样，到时候按上面的方法算就行。如果你不想麻烦，可以增大你的分取倍数回复
我觉得不对。OD值是不应该换算的，能换算的只能是浓度。你的稀释只是把样品浓度稀释了，而不是OD值。我觉得应该是这样子的：首先，将标线按10或者其他倍数浓度稀释，稀释之后的浓度是可以算出来吧，OD也是可以测出 ... 我用硫酸苯酚法测总糖含量，DNS法测还原糖含量，但是葡萄糖标准品和样品在测总糖的时候吸光值超过了紫外范围，所以我就稀释了一百倍做的，然后还原糖的时候没有稀释（还原糖要是稀释测不出来吸光值），现在结果是还原糖含量比总糖含量高，请问这是什么原因？回复
假如你标线稀释10倍，样品稀释50倍的话，计算总糖时要乘于的稀释倍数是(50/10=5)，即乘于5。尽量使吸光度落在0.2-0.8这样精确些，所以你的标线和样品都要稀释到0.2-0.8。但是稀释倍数可以不一样，到时候按上面的方法 ... 我用硫酸苯酚法测总糖含量，DNS法测还原糖含量，但是葡萄糖标准品和样品在测总糖的时候吸光值超过了紫外范围，所以我就稀释了一百倍做的，然后还原糖的时候没有稀释（还原糖稀释测不出来吸光值），现在结果是还原糖含量比总糖含量高，请问这是什么原因？回复
我用硫酸苯酚法测总糖含量，DNS法测还原糖含量，但是葡萄糖标准品和样品在测总糖的时候吸光值超过了紫外范围，所以我就稀释了一百倍做的，然后还原糖的时候没有稀释（还原糖稀释测不出来吸光值），现在结果是还原糖 ... 还原糖测不出吸光度可能空白没做好，或者样品没摇匀，总糖低可能开始硫酸没有完全水解糖类，还有就是计算的时候稀释倍数计算不正确。葡萄糖标线如果不在0.2-0.8也需要稀释，而且计算的时候需要用样品稀释倍数除于标线稀释倍数才是真正稀释倍数回复
我用硫酸苯酚法测总糖含量，DNS法测还原糖含量，但是葡萄糖标准品和样品在测总糖的时候吸光值超过了紫外范围，所以我就稀释了一百倍做的，然后还原糖的时候没有稀释（还原糖要是稀释测不出来吸光值），现在结果是还 ... 我没测过糖。能想到的只有两点：1. 浓度换算有没有出错。 2. 实验操作误差是不是没控制好呢。回复
我用硫酸苯酚法测总糖含量，DNS法测还原糖含量，但是葡萄糖标准品和样品在测总糖的时候吸光值超过了紫外范围，所以我就稀释了一百倍做的，然后还原糖的时候没有稀释（还原糖要是稀释测不出来吸光值），现在结果是还 ... 我也遇到了相同的问题，请问你现在解决这个问题了吗？麻烦告诉我一下该怎么办呢。我现在都纠结死了。。。而且测了好几次了，测出来都是相同的结果。万分感谢！
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测定吸光度怎么去除样品颜色影响？
分别取1mL样品液，加入2.5mL磷酸缓冲液(200 mmol/L，pH6.6) 以及2.5mL 1g/100mL铁氰化钾溶液，混匀。50℃恒温水浴20min后加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸溶液，3500r/min 离心10min。取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1g/100mL三氯化铁溶液。静置10min后，在700nm波长检测吸光度。吸光度越大,说明还原能力越强。每个样品都做对应的空白背景值测定(即实验步骤中不加入铁氰化钾溶液，以蒸馏水替代)。以抗坏血酸(30～210&&μg/mL)作标准曲线，还原能力用抗坏血酸当量AAE (ascorbic acid equivalents)表示，单位为 μg AAE/mL。
方法如上所示。
问题如下：
做标曲的时候调零用的应当是用蒸馏水替代抗坏血酸吧？
在测定样液（茶汤本身有颜色，且在测定波长中有吸光值）吸光度的时候，调零的时候应该用什么呢？蒸馏水代替显色剂（铁氰化钾），然后应当加入样液？
方法中说的空白背景值是这个意思吗？
样品不能稀释不能过滤
谢谢，我决定用第3种~
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主题：【求助】样品浓度偏高超出曲线范围，稀释之后再测吸光度几乎跟空白一样怎么回事？
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发表于： 11:07:21
其中一个样品浓度超曲线范围，稀释5倍之后再测吸光度几乎跟空白一样，有的样又是正常？之前也出现类似情况,20ppb的Cr标液进样量20ul，吸光度0.4XXX，觉得太高超过了0.3，然后改进样量为10ul后，吸光度几乎跟空白一样变成0.01XX，感觉不合理啊。各位能帮忙想想是什么原因吗？
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11:10:49 Last edit by v2725311
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你做过样品的优化升温程序吗？会不会灰化或原子灰温度过高
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ID：yang_qingwen
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没遇到过，不好判断。你可以先进个稀释后的标液看下会咋样？
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ID：abzh99312
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楼主说说什么样品，经过什么处理。结合你现在的信息，我觉得有几种可能：1. 如果只是偶然一次发生，则进样系统问题可能性比较大，请长期观察进样稳定性，包括燃烧头火焰也要观察；2. 如果这个样品重复稀释还是这样的结果，建议考虑是否存在溶液基体影响，稀释时用原溶液匹配基体稀释；3. 光谱干扰，这种可能在AAS里其实不大，但是光谱干扰有这种现象，干扰离子被稀释后导致吸光度变化很大；
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sunbird664
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不知您仪器的自动稀释是如何进行的，如果是仅进样体积改变，如开始20uL，稀释五倍成进样4uL，那就很可能是样品挂壁没全打进石墨管造成的值偏小。
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首先排除是否各个关键部分是否受到污染。
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谁说的吸光值大于0.3Abs就是超标了？一般说吸光值在0.7Abs以下其可靠性是保证的。并且20ppb的Cr的吸光值为0.4是非常理想的。此外如果楼主采用了仪器自带的自动稀释功能，那么就要考虑进样针与石墨管之间的距离是否合适了。
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原文由 夕阳(anping) 发表:谁说的吸光值大于0.3Abs就是超标了？一般说吸光值在0.7Abs以下其可靠性是保证的。并且20ppb的Cr的吸光值为0.4是非常理想的。此外如果楼主采用了仪器自带的自动稀释功能，那么就要考虑进样针与石墨管之间的距离是否合适了。 楼主关注的是超出曲线范围
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补充一下：1，我是手动稀释，不是让仪器自动稀释，仪器自动稀释后计算浓度会自动乘以稀释倍数的，结果肯定不是这个结果。2，我同时稀释了3个样，Q1，Q2，Q3，另外Q1，Q2比较正常，稀释5倍后，测得的浓度为原来的1/5左右，就Q3稀释之后没吸光度了
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原文由 Chem李(v2725311) 发表:补充一下：1，我是手动稀释，不是让仪器自动稀释，仪器自动稀释后计算浓度会自动乘以稀释倍数的，结果肯定不是这个结果。2，我同时稀释了3个样，Q1，Q2，Q3，另外Q1，Q2比较正常，稀释5倍后，测得的浓度为原来的1/5左右，就Q3稀释之后没吸光度了 请将Q1,Q2,Q3的浓度给出来，此外将三个样品的原始记录（吸光值）也一并上传来。
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原文由 Chem李(v2725311) 发表:补充一下：1，我是手动稀释，不是让仪器自动稀释，仪器自动稀释后计算浓度会自动乘以稀释倍数的，结果肯定不是这个结果。2，我同时稀释了3个样，Q1，Q2，Q3，另外Q1，Q2比较正常，稀释5倍后，测得的浓度为原来的1/5左右，就Q3稀释之后没吸光度了 是按照一样的条件进行稀释的吗，你可以试试仪器自动稀释做一下}