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常用原代细胞培养方案
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小鼠心肌细胞原代培养
小鼠心肌细胞原代培养
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整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。二、试剂1、培养液：1：1 混合的DMEM / F12 培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素。2、消化液：胰酶（效价为1：250） 0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg） 0.05% ，用pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制，-20 ℃保存。3、D-Hanks溶液（pH 7.2-7.8）：KCl 0.4 g 、KH2PO4 0.06 g 、NaCl 8.00g 、NaHCO3 0.35 g 、Na 2HPO4o7H2O
0.09 g 、酚红 0.01 g 1L。三、实验步骤取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3 大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5 min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振摇几下），用吸管吹打1min 后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000 rpm 5min ，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml， 1500 rpm 10min ，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中m二氧化碳培养箱中（37℃ 5%CO2）培养。 四、培养结果在二氧化碳培养箱中（37℃ 5%CO2）培养24 h后可见搏动的单层心肌细胞。
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小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养
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&&目​的​：​观​察​原​代​培​养​的​小​鼠​乳​鼠​心​肌​细​胞​的​形​态​特​征​。​方​法​：​Ⅱ​型​胶​原​酶​、​胰​蛋​白​酶​消​化​心​脏​组​织​,​差​速​贴​壁​分​离​法​。​结​果​：2​h​心​肌​细​胞​基​本​贴​壁​,​第天​可​长​成​单​层​,​第～天​细​胞​伸​出​伪​足​相​互​接​触​交​织​成​网​,​逐​渐​形​成​细​胞​簇​或​细​胞​单​层​,​搏​动​呈​同​步​性​,​收​缩​明​显​有​力​,​搏​动​频​率​为0​～2次​／​m​i​n​。​结​论​：​用​Ⅱ​型​胶​原​酶​、​胰​蛋​白​酶​分​离​培​养​小​鼠​乳​鼠​心​肌​细​胞​可​获​得​形​态​、​活​力​良​好​的​心​肌​细​胞​。
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你可能喜欢胎鼠原代心肌细胞中miR-17-92基因簇对FOG-2基因转录后调控作用--《重庆医科大学》2012年博士论文
胎鼠原代心肌细胞中miR-17-92基因簇对FOG-2基因转录后调控作用
【摘要】：人类先天性心脏病由于在胚胎发育时期受到病毒感染、药物、电离辐射以及遗传等因素影响导致心脏结构或者功能的异常，其发病率大约为12‰。心脏发育是一个非常精细的过程，它由不同的心脏前体细胞如心肌细胞、间充质细胞、心内膜细胞等分化发育而来。各种前体细胞在精细调控下发育成各腔室、心脏传导系统以及瓣膜间隔系统。因此心脏发育过程中的精确调控对发育成正常结构和功能的心脏而言至关重要。心脏发育过程中受很多转录因子的调控，其中FOG-2（又名zfpm2）为多锌指核辅阻遏蛋白，属于GATA转录因子家族，在心脏发育过程中必不可少。FOG-2与GATA因子结合后调节GATA因子依赖的转录活性，既可以作为激活子也可为抑制子，此取决于启动子和细胞类型。FOG-2-/-基因敲出小鼠于胚胎期E13.5天左右因心脏缺陷导致胚胎期致死，其心脏发育缺陷主要包括心肌发育不良心室壁变薄、大的室间隔缺损、严重的房室心内膜垫缺失、主动脉骑跨和严重的冠状动脉血管丛发育不全。microRNAs（miRNAs）是近年来发现的一种高度保守的非编码单链微小RNA，约20余个核苷酸，通过特异性结合到与其种子序列互补配对的靶基因3’非翻译区上降解靶基因mRNA或抑制该基因的翻译，起到转录后调控该基因的作用。最近大量研究显示miRNAs作为调节子在胚胎发育过程中发挥重要的调控作用，但是目前为止miRNAs在调节心脏发育过程中的文献报道并不多，并且研究显示了大约30%的编码基因均受miRNAs的调控。之前研究已经证明FOG-2基因在心脏发育过程中具有非常重要的作用。我们假设FOG-2基因在心脏发育过程中也可能受miRNAs的调控，基于此研究目的我们通过生物信息学的方法分析了FOG-2基因的3’UTR全长，发现有62个miRNAs可能和FOG-2基因的3’UTR相互作用，并且其中34个miRNAs可能可能和FOG-2基因3’UTR的17个保守的靶位点相互结合。34个miRNAs中又有5个miRNAs属于miR-17-92基因簇中，这5个miRNAs又可能和3个保守的靶位点相互结合。这5个miRNAs包括miR-17-5p、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a。并且目前有文献报道miR-17-92在心脏发育过程中发挥很重要的调控作用。miR-17-92-/-基因敲出小鼠于出生后2小时内死于心肺功能异常，心脏表型有心肌发育异常和间隔缺损。为了证实miR-17-92是否转录后调控FOG-2基因，我们首先通过荧光素酶报告基因检测系统检测了miR-17-92各个miRNAs能否和FOG-2基因的3’UTR相互作用。然后通过提取培养原代心肌细胞，Northern blotting方法检测miR-17-92在心肌细胞的表达量，过表达miR-17-92后利用RT-PCR及Western blot方法检测了FOG-2基因的mRNA及蛋白表达变化情况。最后通过EdU及TUNEL方法分别检测了心肌细胞增殖及凋亡情况。首先，荧光素酶报告基因系统结果提示miR-17-92簇中miR-17-5p和miR-20a可以直接和FOG-2基因的3’UTR相互作用；然后检测原代心肌细胞miR-17-92簇各个miRNAs均有表达，并且转染miR-17-92表达载体后检测各个miRNAs表达量均明显升高；接着我们在原代心肌细胞中过表达miR-17-92后检测了FOG-2基因的mRNA和蛋白水平的变化，发现过表达miR-17-92后心肌细胞FOG-2基因的mRNA水平没有明显变化，但蛋白水平明显降低，提示miR-17-92转录后抑制了FOG-2基因的表达，并且发现过表达miR-17-92后明显抑制了心肌细胞的增殖，促进了心肌细胞的凋亡，同时过表达FOG-2基因补救后发现心肌细胞的增殖率较单独过表达miR-17-92后有明显的恢复，但是并没有逆转miR-17-92引起的心肌细胞凋亡。研究结果表明miR-17-92基因簇转录后调节FOG-2基因的表达并且通过FOG-2基因抑制心肌细胞的增殖。该结果提示miR-17-92基因簇在心脏的发育过程中可能发挥非常重要的作用。
【关键词】：
【学位授予单位】：重庆医科大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：R541.1【目录】：
英汉缩略语名词对照5-8摘要8-11ABSTRACT11-14前言14-18第一部分 miR-17-92 对 FOG-2 基因 3’UTR 的作用18-51 1 材料与方法18-40 2 实验结果40-46 3 讨论46-49 参考文献49-51第二部分 miR-17-92 转录后调节 FOG-2 基因及抑制胎鼠原代心肌细胞的增殖51-75 1 材料与方法51-62 2 实验结果62-69 3 讨论69-73 参考文献73-75全文总结75-77文献综述77-88 参考文献83-88致谢88-89博士期间发表的论文89-90博士期间参加学术会议90-91
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