测定熔点时,若遇到下列情况将产生什么结果?1）毛细管壁太厚2）样品熔封不严,尚有针孔3）熔点管不干净4）样品不干燥5）样品不够细,填装不够紧密6）加热速度较快7)重新固化的样品再测熔点
轻尘女王387
1）毛细管壁太厚升温过慢,壁厚看不很清,没有及时发现初熔,2）样品熔封不严,尚有针孔会有气体残存,将样品吹起,3）熔点管不干净因有杂质熔点下降4）样品不干燥水汽阻碍观测,不纯熔点下降5）样品不够细,填装不够紧密有塌陷6）加热速度较快7熔化过快,看不清晰7)重新固化的样品再测熔点结晶体被破坏,熔程变长
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扫描下载二维码[转载]两种不同稀释液对犬精液保存效果的影响
Comparison of the effect of two extenders on
canine semen conservation
（北京康乐佳宠物医院&
&&& 系统地对比了两种常用稀释液对犬精液保存的效果，在此基础上，同时设计并进行了第四组实验，对比了四组液氮熏蒸距离冷冻犬细管精液对精液品质的影响。得出以下结论：
在常温（30℃）条件下，犬新鲜精液中的精子活力下降很快，采精后1小时，精子活力下降到50%左右，7小时下降到5%左右；两种稀释液对犬精子都有明显的保护作用，稀释液Ⅰ效果更好，但在30℃条件下，稀释液Ⅰ中的精子活力也下降明显，保存7小时后，精子活力降到62%左右。
在低温（5℃）条件下，未经处理的犬新鲜精液的精子活力下降明显，经过24小时，活力下降到5%左右；两种稀释液对犬精子都有十分明显的保护作用，两者保护效果差异不明显，稀释液Ⅰ中的精子经过288小时（12天）的体外保存，活力下降到60%左右，经过21天，活力下降到5%左右。
经过液氮的冷冻（-196℃）保存，两种稀释液对犬精子都有良好的保护作用，稀释液Ⅱ保存的效果略优于稀释液Ⅰ；稀释液Ⅱ中的精子，解冻后精子活力为60.0%，37℃水浴6小时后，活力降到28%左右；稀释液Ⅰ中的精子，解冻后精子活力为52.3%，37℃水浴6小时后，活力降到22%左右。
使用液氮熏蒸法对犬细管精液进行降温冷冻时，将犬细管精液放在距离液氮面2cm位置进行熏蒸，比放在3cm、4cm和6cm位置效果好一些。在其他稀释液成分不变的情况下，稀释液中添加0.5%的（一种表面活性剂）能有效地提高犬冷冻精液解冻后精子的活力。
这两种稀释液都是在临床中广泛被使用，同时制作也比较方便。
稀释液Ⅰ含2.422 g Tris（三羟甲基氨基甲烷）、1.36 g 柠檬酸、1.0 g
果糖、20ml卵黄，加蒸馏水定容至100ml，同时加入青霉素和链霉素各10万单位，若用于精液冷冻保存时，稀释液Ⅰ中还应加入8ml的甘油；此稀释液配方广泛用于国内的犬精液冷冻技术研究。
稀释液Ⅱ含3.025g Tris（三羟甲基氨基甲烷）、1.7 g 柠檬酸、1.275 g
果糖、20ml卵黄，加蒸馏水定容至100ml，同时加入青霉素和链霉素各10万单位，若用于精液冷冻保存时，稀释液Ⅱ中还应加入5ml的甘油；此稀释液配方在近期发表的国外相关文献中多次出现。
Ⅰ保存效果更好；液氮冷冻保存时，稀释液Ⅱ保存效果更好。但统计结果表明，两种稀释液中犬精子活力差异不显著，这可能与样本数不足和实验重复次数少有关。
关键词：犬，精液，常温保存，冷藏保存，冷冻保存
&&& In this
study, the screening of diluent formula was carried out for canine
semen stored at room temperature, low temperature, as well as
cryopreservation and systematical comparison was performed on the
effects of two commonly used extenders for the preservation of
canine semen. On this basis, the distance of four groups of liquid
nitrogen fumigation was compared on the effects of frozen semen
quality. Conclusions are summarized as follows:
At normal temperature (30 ℃), the sperm motility of fresh semen
decreased rapidly, down to about 50% in one hour, and about 5% in
seven hours. Two extender solutions had obvious protective effect
on sperm. The effect of extenderⅠ was better. However, in 30 ℃
conditions, the motility of sperm stored in extenderⅠalso decreased
significantly, reduced to about 62% after seven hours of
preservation.
At low temperature (5 ℃), the motility of untreated fresh semen
decreased obviously, down to about 5% after 24 hours. Two extender
solutions had obvious protective effect on sperm. No difference of
the two extenders was observed on the protective effect. After 288
hours (12 days) of in vitro preservation in Ⅰ, the motility of sperm drops to
around 60%, and down to about 5% after 21 days.
After frozen and stored in liquid nitrogen (-196 ℃), two
extender solutions both have good protective effect on canine
Ⅱ seemed to be a little better than extender Ⅰ.The
motility of sperm stored in extender Ⅱ was 60% after thawing. The
motility reduced to about 28% after 6 hours in water bath at 37℃.
The motility of sperm stored in extender Ⅰ was 52.3% after thawing.
The motility decreased to about 22% after 6 hours in water bath at
37℃.
When using liquid nitrogen fumigation method for cooling on
canine straw semen, 2 cm distance above liquid nitrogen surface
produced the best effect than that of 3 cm, 4 cm and 6 cm.（a surface active
agent）in the extenders could effectively improve the vitality of
frozen-thawed semen sperm.
These two kinds of extenders are widely used in clinic, and the
production was not difficult.
Ⅰcontains 2.422 g of Tris
(trihydroxymethyl aminomethane), 1.36 g of citric acid, 1.0 g of
fructose, and 20 mL of egg yolk. Distilled water was added and
diluted to 100 mL. 100 000 units of penicillin and streptomycin was
added, respectively. If used for cryopreservation of semen, 8 mL of
glycerol should be added in extender I. this dilution formula was
widely used in the study of cryopreservation of canine semen in
Ⅱ contains
3.025 g of Tris (trihydroxymethyl aminomethane), 1.7 g of citric
acid, 1.275 g of fructose, and 20 mL of yolk. Distilled water was
added and diluted to 100 mL. 100 000 units of penicillin and
streptomycin was added, respectively. If used for cryopreservation
of semen, 5 mL of glycerol should be added in extender Ⅱ. This
dilution formula was mentioned several times in the recently
published reference.
Ⅰ obtained better effect
in the liquid storage of canine sperm, while extender Ⅱ was better
in the cryopreservation. The statistical results show that, the
differences of the canine sperm motility between two extenders were
not significant, which maybe related with the short of sample
numbers and the low experimental repetition.
Keywords: canine, semen, normal temperature preservation, low
temperature preservation, cryopreservation
研究目的和意义
犬人工授精（artificial insemination,
AI）技术是一种代替犬自然交配的繁殖技术，是在人工辅助下，采集种犬精液、经过品质检测和稀释保存等处理，再将精液输送到母犬生殖道内，使母犬受孕的配种技术。精液冷冻（semen
cryopreservation）技术是指将采集到的新鲜精液，经过特殊处理后，利用液氮（-196℃）、干冰（-79℃）或其他冷源，以冻结形式长期保存精液的技术。精液保存在超低温（-196℃）条件下，这时细胞的代谢几乎完全停止，从而达到长期保存的目的。精液冷冻保存技术是保存物种遗传资源的一个重要方法。
国内外研究现状
犬作为宠物、警用、肉用和医学研究动物模型等的需求，在国内外已经发展成为重要的产业，同时关于犬的人工授精及精液冷冻技术的研究已在全世界范围内得到迅速发展。精液保存技术和人工授精技术的发展是密切相关的，此方面最早的记录是在1776年，意大利生理学家Spallanzani尝试用雪冷冻精液，到了1780年，Spallanzani使用犬的新鲜精液进行人工授精，第一次成功地使母犬受孕产仔。此后近二百年间，犬的人工授精技术发展缓慢，直到1954年，Harrop第一次报道使用犬的冷藏精液进行人工授精获得成功，他的方法是使用牛奶稀释犬的精液，同时将稀释后的精液储存在低温的室内100小时后注入母犬体内；同年，Rowson第一次发表了犬精液冷冻成功的报道[2]。1969年，Seager等首次用冻精进行犬人工授精，成功地使母犬受孕。从此之后，犬精液冷冻技术成为犬繁殖生理学研究的一部分，科技工作者进行了大量犬精液冷冻方法的研究，相继建立了关于犬精液采集、品质分析、稀释保存、冷冻、解冻及人工授精的一系列参数，研制了许多稀释冷冻液和操作技术。
精液冷冻保存是人工受精的一项重大技术突破，它解决了精液的长期保存问题，使精液保存不受时间、地域和种畜寿命的限制，极大限度地提高了优良公畜的利用率，加速了品种的育成和改良步伐[3]。
相比其他家畜，特别是牛，犬精液冷冻技术的发展及应用还不理想。造成此结果的原因是多方面的，其中重要一个因素是由于犬一般不作为规模化养殖动物。在一些经济发达的国家，犬不被列为家畜，而是人类的伙伴，有立法禁止虐待犬，更不准屠宰犬吃肉，从而导致支持这方面的研究经费有限，统计数据不足。目前没有一种稀释液和冷冻解冻操作程序被认为是最好的，关于影响犬精液冷冻技术的因素还在不停研究中[4-6]。
精液冷冻技术核心步骤是精液的稀释，特别是稀释液的配制，也是国内外相关研究的热点难点。稀释液成分及作用原理相当复杂，其中许多成分“身兼数职”，同时在稀释液中扮演多种作用。如稀释液中添加卵黄时，卵黄中的卵磷脂能稳定精子细胞膜，抵抗冷刺激；而且卵黄也具有缓冲能力，有助于稳定精液的PH值和渗透压，因此采用卵黄的量也与稀释液中其他成分的缓冲能力有关；同时还需要考虑到，卵黄也能传播疾病，因此采用卵黄时尽量使用无特定病原的鸡蛋，或者采用其他类似物，如丁基羟甲苯（butylated
hydroxytoluene, BHT），这类物质也能保护精子免受冷休克时的损伤。
精液稀释主要目的是扩大精液的容量，同时提供合适的保护物质和营养物质，延长精子体外存活时间并保持受精能力。稀释液成分包括：稀释剂、营养剂、保护剂和其他添加剂（详见精液保存技术综述）；其中保护剂组成复杂，包括维持精液PH值和渗透压稳定的缓冲剂、防止精液冷休克的抗冷物质、防止精子细胞内形成致命冰晶的抗冻物质和减少精液细菌污染的抗菌物质等。
犬精液稀释液经过一个长时间的发展完善过程，使用过多种配方，包括脱脂乳（Martin,
1963）、磷酸盐葡萄糖缓冲液、柠檬酸盐、果糖、Tris等，近年来人们采用Tris-果糖-柠檬酸稀释液较多。此外也有人在此基础上进行大量改良工作，例如使用葡萄糖代替果糖，或蔗糖和乳糖。商用犬精液稀释液主要有以Tris作为主要的缓冲系统的Trilady1(Minitub,
Tiefenbach, Germany)，CLONE（Pennsylvania, USA）、ICG（Pennsylvania,
尽管犬精液冷冻技术存在许多困难，还未实现冻精的规模化生产和应用，但依靠几十年来大量实验研究和经验数据，目前在世界上一些发达国家，犬的人工授精与冷冻精液研究已经得到广泛开展，并运用于实际生产中，最高受胎率达92％，而且幼犬的死亡率、畸形率、初生重及性别比例与自然交配相似[7]。同时还出现了一批商业化的冻精生产企业，并且建立了一些良种犬精子库。美国养犬俱乐部（American
Club,AKC）在20世纪70年代即花费大量的资金用于犬的冷冻精液和AI研究，并详细制定了冷冻精液生产及AI各主要环节的操作规程；同时规定从1981年起，只有经过审验合格的配种站才有资格提供犬的冷冻精液。亚洲的日本、韩国液进行了大量这方面研究。
在国内，这方面的研究起步较晚，目前尚处于试验研究阶段，与发达国家相比，差距比较明显。随着我国经济的快速发展，养犬业也得到迅速发展，军犬、警犬、导盲犬等工作犬需求旺盛，特别是宠物犬的大量增加，这些因素都加速了对犬精液方面的研究。1997年禹学礼等对豫西土狗的冷冻精液和AI试验获得成功，受胎率最高可以达到57．1％，平均窝产仔3只。
已故冠军犬精液冷冻22年后人工授精成功（每日邮报2011年报道）
研究目的和意义
家犬的驯化过程可追溯自12
000年以前，是人类最早驯养的动物，在长期与人陪伴过程中，人类不断认识和利用犬的本能为生产生活服务，渐渐拓宽了犬的使用范围。早期半驯化的家犬可能多用于牧羊和保护家畜，而非作为宠物饲养；考古证据显示，早在古罗马时代，同一区域内的犬体型已经有了明确差别，这说明许多犬的特性已经定型，当时驯养犬的目的是：打猎、看家、作伴；而现在犬的用途已经大大扩大，除了看家护院和牧羊狩猎，也大量用于军事和公共安全领域，同时作为观赏和伴侣宠物广泛分布于世界各地。
随着我国经济的快速发展，近些年我国的养犬业发展迅速，犬的品种和数量呈现逐年上升趋势；市场的巨大需求加速了犬品种的引进和培育工作，同时也对犬的繁育研究工作提出更高的要求；珍惜犬种的保护是犬繁育工作基础，然而传统的保种方法需要花费大量人力、财力，而且十分费时，因此迫切需要运用现代生物学技术方法进行优良犬品种的保护和改良。使用犬人工授精技术替代传统的犬自然交配方式，能够大大地加快犬优良品种的选育工作，特别是犬精液冷冻技术的应用，极大限度地提高了公犬利用率，也解决了精液长期保存问题，加速了犬品种培育和改良步伐。
与犬自然交配方式相比，犬人工授精和精液冷冻技术有如下优越性：
减少种公犬的数量，又能充分发挥优秀个体的遗传特性；做到提高经济效益的同时，又能加快优良犬种的培育。
克服因体形差距过大、生殖道异常等原因而造成的交配困难。
能够使配种不受地域和时间的限制。
通过实施有效的AI操作流程，可以控制疾病传播，提高母犬的受胎率。
建立精液基因库，实现品种资源保护。
&犬精液保存技术是犬人工授精技术的基础和核心，根据精液保存的温度分为：常温保存、低温保存和冷冻保存。常温保存是指将精液保存在15～30℃条件下，这种方法是精液的短期保存方式；低温保存也称冷藏保存，保存温度一般是0～5℃；冷冻保存是指将采集到的精液经特殊处理，利用液氮（-196℃）或干冰（-79℃）等冷源，以冻结方式长期保持精液。各种保存方式都有各自利弊问题，冷冻保存虽然能使精子长期以冻结方式保存（精子在冷冻状态下代谢停止，理论上可以无限期得到有效保存），但存在解冻后活力差、存活时间短、畸形率提高和受胎率低等问题，而且犬精液冷冻需要较高的操作技术、相应的设备投入和更高应用成本；冷藏保存对犬精子的损伤小，但保存时间较短，一般用于采精后几天内使用，随着冷藏稀释液的改进和交通运输发展，冷藏精液在生产实践中也得到广泛的使用。
如何获得最佳的精液保存效果是科研工作者和一线生产者一贯的努力方向；为此，关于精液保存技术受到广泛的研究，这些研究涵盖了精液采集、精子质量评估、稀释液成分、冷冻保护剂、精液保存方式、冷冻降温及解冻方法等，而其中最重要的是关于稀释液成分的研究，本试验系统地对比两种常用稀释液对犬精液3种保存状态效果的影响（常温保存、低温保存和冷冻保存），为以后相关的生产者和研究人员提供参考。
建立良种犬的基因库，需要犬精液冷冻保存、卵母细胞冷冻保存和胚胎冷冻保存技术的联合应用；探讨犬精液冷冻保存的影响因素和冷冻机理，对其它细胞冷冻研究具有重要的参考借鉴价值。
精液保存技术综述
1.2.1 精子的生成和形态结构
公犬生殖系统包括睾丸、附睾、输精管、前列腺和阴茎。睾丸产生精子及睾酮，此外还能合成抑制素，雌激素和一些蛋白质。附睾是精子成熟并存储的地方。前列腺液是精清的主要成分。
睾丸中的曲细精管是精子形成的部位。曲细精管内含有两种精原细胞，一种为存储型细胞，对辐射、毒素或其他的损伤有较强的抵抗力；另一种为增殖型细胞，通过有丝分裂和减数分裂生成单倍体的精子细胞。精子细胞形成以后，需经过一系列分化变化才最终形成精子，这个过程称为精子发生（spermiogenesis）。精子发生是在曲细精管的支持细胞上进行，在任一曲细精管上都可以发现不同发生期的精子，这样能保证总是有新鲜精子产生。一旦精子发生完全，它们就会被送至附睾。精子离开睾丸时不具备游动和受精能力，当通过附睾头时，精子获得了活力，之后通过附睾体时，精子又获得了受精能力。成熟的精子被储存于附睾尾中，射精时，精子会迅速从附睾尾中送出，与前列腺分泌的前列腺液混合后最终经阴茎排出。
哺乳动物精子发生模式图
各种动物精子形态、大小及内部结构有所不同，但大体相似。哺乳动物的精子，主要有头部、颈部和尾部组成。
&&& 犬精子长度为55
65μm，与犬个体大小无关。犬精子头部为梨状，主要由细胞核、顶体组成。顶体内含顶体素等水解酶，可溶解透明带。核区是由DNA和核蛋白质等组成的一致密结构。
1.2.2 精液采集(semen
collection)
采精的原则是保证公犬正常、充分的性欲和性行为表现，使射精顺利而完全，精液不被污染。认真做好采精前的准备，正确掌握采精技术，合理安排采精频率，是保证采得大量优质精液的前提。
1.2.2.1采精前的准备
采精场地的准备&
要求宽敞、平坦、安静、清洁、专用固定，便于公犬形成稳定的条件反射，也能保证人犬安全与防止精液污染。
器械的消毒与准备&
不同的采精方法，需要准备相应的器械，但采精之前都要求对相应的器械、用具进行清洗、消毒。
台犬的准备&
目前多采用发情的母犬作为台犬，发情母犬的气味可以提高公犬的性欲，刺激射精。采精前台犬的后躯、尾根部、外阴部、肛门部位，都应彻底洗涤清洁，再用消毒过的干抹布擦干。也可采集正常母犬发情期的阴道分泌物，置于海绵中，-20℃冷冻保存备用（这些激素也有商品出售，如对羟基苯甲酸甲酯）。采精时，可用对精子无毒的润滑剂涂抹龟头球，防止采精后包皮后翻。
种公犬的准备和调教&
公犬采精前的准备包括体表的清洁消毒和诱情，公犬的调教因品种性格、体格大小、营养状况等不同，效果也有差异。对于胆怯、性欲差的公犬，需要较长时间耐心地调教。
1.2.2.2采精方法&
按摩采精法是国内外普遍采用的一种方法，其最大的优点是简单易行，并且易将射精的三阶段分开。操作人员右手戴上乳胶手套，轻缓地将公犬阴茎推出包皮，握住阴茎球给予适当的压力，公犬的阴茎便会充分勃起，经按摩1min左右即可射精。左手拿集精容器准备收集精液。
公犬为分段射精，在射精间隙更换集精容器，分段收集精液。犬的射精量为2ml～15ml，分三部分排出。第一部分是由尿道球腺分泌的水样液体，呈滴状，无精子；第二部分来自睾丸，富含有精子，呈云雾状白色粘滑液体；最后部分是前列腺分泌物，比较清亮，量多但不含精子。故主要收集第二部分精液。
阴茎完全勃起后，公犬表现为抬起一只后腿企图越过采精者的手臂，在自然交配过程中也会发生抬后腿现象，越过母犬背部将身体转向相反方向，使勃起的阴茎向后旋转180°。阴茎的扭转能引起龟头静脉的闭塞，可阻止阴茎增大的消退。该部位阴茎弹性很大，扭转不会引起公犬的不适。犬的阴茎骨能阻止阴茎在勃起和扭转过程中尿生殖道的闭塞。
在收集精液时，要特别注意器具不能触及龟头，否则会造成射精停止。另外，采精手应在龟头的背部必须保持一定的压力。犬精子对冷休克敏感性低，但易受热休克的刺激，应防止温度的突然变化，可置于体温（37℃）和室温（20℃）之间保存。
该方法是利用模拟母犬阴道环境制造的人工阴道，诱导公犬在其中射精而收集精液的方法。应用假阴道法采精的三个主要条件是假阴道的温度、压力和润滑度。有报道称，假阴道的橡胶材料容易对精子的活性质量产生影响。
是利用电刺激采精器，通过电流刺激有关神经和壶腹部，而引起公犬射精的方法。
1.2.2.3采精频率&
是指每周对公犬采精的次数，要根据正常生理状况下睾丸一定时期内产生的精子数、附睾的储精量、每次射精量、饲养管理水平等因素确定。公犬适宜的采精频度应该是1周采精2～3次，或隔日采精一次。
1.2.3 精液质量评估（semen quality
measurement）&
鲜精及解冻后的精子都需要进行品质检查，鲜精评价的主要目的是估计公犬的睾丸和附睾功能是否正常，而冻精评价则主要是确定精子细胞在冷冻解冻过程中的损伤程度，评估的最终目的是预测精子的受精能力。
精液品质检查通常分为原精和冻精品质检查，原精品质检查的内容主要包括精液量、精子密度、精子活率和活力、精液颜色、精液气味、精液PH值、精子形态学检查、细菌学检查等指标；冻精品质检查的主要内容包括精子活率和活力、形态、质膜完整性、细菌学检查等指标。在众多评估项目中，精子密度、精子活力和精子形态是最常用的三个指标[9]。
评定精液质量的方法，大致可以归纳为四种：一是外观检查；二是显微镜检查；三是生物化学检查；四是存活力测定。采用多项检查方法，能全面地确定精液的品质。随着研究的深入，更细致多样的方法被应用，包括荧光染色技术、计算机辅助精子检测、流式细胞技术、、卵母细胞结合法等，而最有说服力的检测方法就是人工授精后母犬的受孕率及产仔率。
普通光学显微镜检查是评估精子质量的常规方法，但此方法难以克服主观性，同一份标本由不同实验室和观察者检测，得到的结果可能产生较大的差异，造成这种差异的因素很多，包括操作者的熟练程度、环境温度、取样的剂量、设备的精密度等等。
精子的检测指标与精子的受精能力有密切的关系，但与人工授精后最终的受胎率之间关系却不稳定，不同的实验室所得的试验结果是不一致的。例如，在活力方面，精子活力与受精能力的相关性范围可以从最低的0.15到最高的0.83；在精子质膜完整性方面，精子质膜完整性与受精能力之间具有显著但可变的相关性（r=0.39～0.57）。任康2009年试验报道猪的精子活率、质膜完整精子比率和活精子顶体完整比率等检测指标之间呈正相关性；质膜不完整精子比率、死精子低能线粒体比率和死精子比率等检测指标之间呈高度正相关性。
1.2.3.1 外观评定
犬精液量因品种、个体存在差异，同一个体又可因年龄、健康程度、采精方式及技术水平、采精频率和营养状况而有所变化。将所采集到的精液倒入高精度的刻度离心管进行读数，一般种公犬富含精子部分（第二部分精液）的精液量为0.5～5ml。
犬的正常精液颜色，一般为乳白色，有时也呈乳黄色(通常在公犬采精间隔时间很久的情况下发生)。如果精液颜色异常，表明公犬生殖器官可能有疾病。精液呈乳清样说明精子稀少，提示睾丸发育不良或附睾炎、隐睾等；精液带有浅绿色，可能混有脓液；呈黄色，则可能混有尿液；若带有淡红色，提示生殖道可能有出血；若含有块状物或絮状物，表明生殖道可能有炎症，特别是精囊腺有炎性渗出物。
公犬正常精液略带腥味。如带有其他的异常气味，则可能混有脓液、尿液、灰尘等异物，常伴有色泽的改变，应废弃。
1.2.3.2显微镜检查&&
精子活力（sperm motility）&
精子活力是指精液中呈直线前进运动的精子数占总精子数的百分率。而精子活率是指精液中能够活动的精子所占的百分率，精液中，活的精子除了直线前进运动外，还以漩涡式运动、原地摆动等形式存在，所以，精子活率≥精子活力。因为只有直线前进的精子才可能具有受精能力，所以精子活力与母犬受胎率密切相关，这部分精子越多母犬的受胎率就越高。
精子的活动常见有3种类型：直线前进运动、旋转运动和原地摆动，而只有直线前进运动的精子才有受精能力，所以精子活力与母犬受胎率密切正向相关。
评定精子活力常用十级评分法，即视野中100％的精子呈直线前进时评为1.0分；90％的精子呈直线前进时定为0．9分，其他的依此类推。一般新鲜精液的精子活力在0.7分以上。
精子活力检查方法有多种，比较常用的三种方法是：目测评定法、计算机辅助精液分析和死活精子计数法。
目测评定法：利用普通显微镜或相差显微镜，在37℃条件下，放大200～400倍，对精液样品进行目测评定。如果样品精子浓度很高，可用温的生理盐水或Tris-果糖稀释后再检查（Rigau等，2001）。用显微镜估计活精子的数量简便快速，但主观性很强，而且难以预测精子的生育力（Linford等，1976）。
计算机辅助精液分析（computer assisted semen analysis, CASA）:
利用转换镜头和数据线，将显微镜视野接入计算机并显示在屏幕上，再根据特定的软件对视野内的精子进行统计分析。常用血球计数板代替普通载玻片，盖上盖玻片后，使精液形成100微米厚度的均匀液面，被测样本形成一个精子层。
死活精子计数法&
利用活精子对特定染料不着色而死精子着色的特点来区分活精子和死精子。最简单的染色法可采用单纯的5%伊红或1.1～1.5%红汞溶液作为染色剂。但此法只可用作对原精液检查，而不适用于冷冻精液，这是由于甘油能使精子细胞膜渗透性增强，可造成着色精子数异常增多。此外，还可以采用升温法检查死活精子的比例：把适当倍数稀释后的精液样品置于血细胞计数板上，在恒温显微镜下首先统计出死亡的精子数，然后加热（100℃恒温干燥箱内，2min）以使精子全部死亡，再计算精子总数，便可算出死活精子的百分率。
精子密度(sperm concentration)&
指每毫升精液中所含精子数。通常公犬每毫升精液中精子数为1.25（0.4～5.4）亿。目前测定犬精子密度的主要方法有血球计数板计数法、光电比色计测定法和电子颗粒计数仪测定法。
血球计数板计数法&
该法计算精子数与计算血液中的红细胞和白细胞数的方法相似。此法需要设备比较简单，但操作步骤多，较费时。其主要操作步骤是：用3%氯化钠溶液将一定量（取样通常是10微升）精液稀释100倍，然后使用显微镜和血球计数板计算稀释精液中的精子数，最后根据计数板原理（血球计数板的计数室深0.1mm，底部为正方形，边长是1.0mm；底部正方形又划分成25个小方格，每个小方格又是由16个小正方形组成；计算室容积是0.1立方毫米）换算出精子密度。
lml原精液中的精子数=5个大方格内的精子数(即记数室中5个读数视野的精子总数)&5(等于整个计数室中25个大方格内的精子总数)&10(等于1立方毫米内的精子总数)&1000(等于lml被检测的稀释精液样品内的精子总数)&100
(被检测精液的稀释倍数) 。
使用计算机辅助精液分析系统（CASA）计算精液的精子浓度比较直观、方便，而且可以将被测精液的相关数据全部存入电脑，便于日后的需要。
光电比色计测定法&
是根据精子数越多，透光性越差的特点，能准确测定精子浓度。此方法测定结果与使用血细胞计数器计数的测定结果近似，相关系数在0.93以上。精子密度测定仪是最新型的光电比色计，可快速、准确、方便地测定精子密度，已被冷冻精液生产单位普遍采用。
电子颗粒计数仪测定法&
稀释的精液样品通过特制直径很小的毛细管时，每次只有一个精子细胞在两个电极之间通过，精子头部引起的电阻徒增被计数器记录。次方法准确度更高，但仪器价格昂贵。
精子形态是否正常与受胎率密切相关，精子形态学检查通常分为精子的畸形率和顶体完整率两项内容，如果精液中含有大量畸形或顶体异常精子，受胎率就会降低。
精子畸形率（abnormal sperm rate，ASR）&
指精液中形态和结构不正常的精子占精子总数的百分率。正常精液中也有一定量的畸形精子，但不会超过20%，一般对受精力影响不大。根据精子不同的变态部位，精子畸形一般分为4种：头部畸形、颈部畸形、中段畸形和主段畸形。测定方法：将精液均匀涂抹在载玻片上，自然干燥后，用95%酒精度的3min，然后用普通染色液（如伊红、美蓝）或红、蓝墨水染色5min,水洗干燥后，400～600倍显微镜下随即检查500个精子，可计算出畸形精子百分率。
精子顶体异常率（abnormal acrosome rate,AAR）&
正常精子顶体内含有多种与受精有关的酶类，一般认为只有直线前进并且顶体完整的精子才可具有正常的受精能力。正常精液中可能存在少量顶体异常的精子，如果精子顶体异常率过高，将直接导致受精力下降。测定方法：将精液制成抹片，自然干燥后，固定液中固定90min,经水洗风干后用姬姆萨染色90min,再水洗风干后于1000倍显微镜下随机观察500个精子，可计算出顶体异常率。采用电子显微镜观察精子顶体破损情况比光学显微镜要准确得多。
精子质膜完整性 (membrane integrity of sperm)&
精子质膜是精子的基本组成部分，是覆盖整个精子表面的一层半渗透性膜，是精子重要的保护性结构。质膜的破裂会引起精子细胞内容物的流失，导致精子死亡（Graham
and Moc’e,
2005）。精子质膜完整性是精子新陈代谢和受精能力的基础，因此精子质膜是否完整时区分精子死活的一个重要特征，同时精子质膜也是精子最易损伤的部位（Krogenes
et al., 1994）。
精子质膜在精子上分为三个不同的区域：覆盖于顶体区域上的质膜、覆盖与精子头部非顶体区的质膜，以及覆盖于精子颈部和尾部的质膜。对不同区域的质膜，检测其完整性需要不同的检测方法：对覆盖于精子头部区域的质膜检测主要采用常规染色法和荧光探针染色法，对覆盖于精子尾部质膜的检测可以使用低渗肿胀法检测（hypo-osmotic
swelling test, HOST）。
采用低渗肿胀法（HOST）进行测量。配置含75mM果糖和25mM柠檬酸的低渗透压水溶液（100
mOsmol/L）。取20μL精液用低渗液稀释至200μL，在37℃水浴中放置45min后在相差显微镜40倍物镜下观察。质膜完整的精子在低渗环境中，会出现鞭毛卷曲现象，而质膜不完整的精子鞭毛卷曲不明显（见下图）。每张抹片观察200个精子。
通过对精清的生化分析判断精子的代谢能力和副性腺及其分泌物是否正常，在一定程度上反映精子的生化特性及其受精潜能。
精液pH检查&
犬的精液pH值平均为6.4（6.1～7.0），pH值的高低与副性腺分泌物有关，第一部分精液pH 值居中、第二部分精液的
pH值最低；第三部分精液的 pH值最高。pH值偏低的品质较好，pH值偏高的精子活力、受精力都显著降低。
精子代谢很强烈，能量消耗快；同时代谢产物能改变精子环境的pH值，导致某些酶的活性被抑制，影响精子受精能力；国内外学者已对此作过专门研究，精液pH值可因精子代谢及其他原因而变化，当精液pH值降低时，精子代谢与活动减弱；反之，因pH值上升，精子代谢与活动增强，能量迅速耗竭，存活时间减少。为维持正常代谢活动，犬精子需要的适宜pH值范围是6．4～7．0[11]。部分国外学者认为最佳pH值为6．6[12]，国内部分学者在配制精液稀释液时未充分考虑pH值的变化，这是造成了精子冻后活力降低的重要因素；辛国省等(2007年)通过对藏獒精液低温保存稀释液的pH值研究认为犬的精液低温保存稀释液的pH为6．5时精子有较高活力[13]。
测定方法：最简单方法是用pH试纸比色，目测即得结果，但结果误差大；比色计测定pH值结果更为准确。
精子代谢能力测定&
精子自身所储存的能量有限，正常情况下，精子主要利用环境中单糖等外源性营养物质进行代谢而获得能量。精子代谢能力测定主要包含精子耗氧量测定和果糖代谢测定。
另外，测定精清中其他化合物，如乳酸、柠檬酸、甘油磷酸胆碱、精氨酸、肉毒碱、类固醇激素和前列腺素等，有助于全面了解精液的品质和动物的生育力。
1.2.3.4其他检查
精子存活时间和存活指数测定&
精子存活时间是指精子在一定外界条件下（保存温度、稀释液、稀释倍数等）总的生存时间；而存活指数是指精子的平均存活时间，反应精子活力下降的速度。精子存活时间越长、存活指数越大，说明精子生活力越强，精液品质越好，所用的稀释液越佳。
微生物检查&
动物正常精液中不含任何微生物，但采精来的精液，往往含有一定数量的细菌。精液中微生物的来源与公犬生殖器官疾病和人工采精的卫生条件密切相关，因此有必要对精液（特别是进口冻精）进行细菌性检查。正常种公犬的鲜精每1ml所含的细菌数量一般不超过1000个，而冻精由于在制作及冷冻包装过程中细菌的感染的机会增多，一般每1ml所含的细菌数量控制在2500个内。
1.2.3.5精液的离心
前列腺液不利于精子的保存（包括常温保存、低温保存和冷冻保存），通常是使用离心的方法去除犬精液中的前列腺液，所以离心也是精液保存中的一个重要步骤；然而离心处理可能对精子造成损害，影响精子受精能力，特别是在冷藏保存和冷冻保存之后。
&&& 奥地利的M.
Koderle等人实验报道，冷冻前对精液进行离心，能造成解冻后精子活力降低、畸形率提高、精子染色质改变，所以进行精液冷冻保存时，不推荐对犬精液进行离心处理[15]。
2008年张国军报道三种离心条件（1000rpm&5min, 2000 rpm&5min, 3000
rpm&5min）对犬精液4℃冷藏保存和冷冻保存解冻后的精子质量无明显影响[16]。
很多关于犬精液保存的研究中使用了不同的离心条件，目前国内外相关研究报道中最常用的离心条件有两种：1、离心力为700g，离心时间为6分钟；2、离心力为1200g，离心时间为6分钟。
1.2.4 精液稀释(Semen dilution)
精液稀释的目的有：扩大精液容量，增加配种数量；降低精子能量消耗，补充营养和保护物质，抑制精液中有害微生物活动，延长精子存活时间，增强受精能力；便于精液保存和运输。因此精液的稀释，是充分体现和发挥人工授精优越性的重要技术环节。目前最普遍使用的一种稀释液是以果糖．Tris-柠檬酸为基础，添加适量的卵黄和甘油。
1.2.4.1稀释液的主要成分和作用&&&
主要用于扩大精液容量，但稀释液的渗透压与精液渗透压相等。单纯扩大精液量的稀释剂有等渗的葡萄糖、蔗糖和氯化钠溶液。
为精子提供营养，补充精子在代谢过程中消耗的能量。常被使用的此类物质有：葡萄糖、果糖、乳糖、卵黄、蜂蜜、奶粉、椰汁等，目前氨基酸、丙酮酸盐也成为稀释液研究的新方向。各种商品化的稀释液也陆续在市场上出现并得到人们的认可，如德国Tiefenbach基于Tris的Triladyl，美国Pennsylvania的C．L．O．N．E．。
瑞典的Suppawiwat
Ponglowhapan等实验分析了稀释液中葡萄糖和果糖在犬精液冷藏保存过程中的作用，实验表明，这两种糖主要作用是支持犬精子的运动；使用EYT（egg-yolk-tris）稀释液长期冷藏保存犬精子时，稀释液配方中果糖最佳浓度是70[18]（1mM：0.001mol/L；果糖的分子量：180.16）。
保护性物质& 保护精子抵抗各种不良外界环境因素的伤害。
缓冲物质：用于保存精液适当的pH值和渗透压，利于精子存活。常用的有：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、酒石酸钾钠、EDTA（乙二胺四乙酸）等。
&&& 美国的N.
Songsasen等人报道了犬精子对渗透压的敏感性[19]，实验显示犬精子对渗透压敏感，但能够承受抗冻保护剂引起的细胞收缩和肿胀。当精子暴露于≥500
mOsm（=milliosmole,毫渗摩尔）NaCL溶液时，精子活力下降明显；当精子暴露于500
mOsm的单糖溶液时，活力也明显下降；但两种溶液对精子的影响不一样，精子在700
mOsm的NaCL溶液中会完全散失活力，而在相同渗透压的单糖溶液中，精子不会完全散失活力，直到单糖溶液的渗透压≥1300
mOsm时，精子才完全散失活力；
防冷刺激物质：由于冷刺激，会使精子遭受冷休克而失去活力，特别是从20℃以上急剧降至0℃时。这是由于精子内的缩醛磷脂融点高，低温下容易凝结。常用的物质有：卵黄和奶类等，此类物质含有卵磷脂，卵磷脂融点低，不易冻结，进入精子体内能替代缩醛磷脂保障代谢的正常进行，同时卵磷脂能稳定精子细胞膜，防止顶体破裂。
精液稀释液中添加卵黄，能够有效地防止精子产生冷休克；卵黄有这种作用主要是由于其中含有低密度脂蛋白（LDL）。巴西的A.S.
Junior等人报道了低密度脂蛋白在犬精液保存中的作用，实验显示低密度脂蛋白能够代替稀释液中的卵黄，在精液冷藏保存和冷冻保存中起到保护作用[20]。法国的D.
Bencharif等人比较了稀释液中不同LDL浓度对犬精液保存的影响，得出结论：与在稀释液中添加卵黄相比，在稀释液中加入6%的LDL能够更好地保护犬精子，使其在冷冻和解冻过程保持更高的活力；实验还表明，犬精子冷冻过程中使用LDL，对精子的受精能力没有影响[21]。
抗冻保护剂：精液在冷冻过程中，精子内外环境的水分会形成冰晶，导致精子损伤和死亡；抗冻物质有助于减轻或消除这种危害。常用的抗冻剂有：甘油、乙二醇（EG）、丙二醇、三羟甲基氨基甲烷（Tris）等[22]。高雅等（2010）报道称，乙二醇与甘油作为保护剂的最佳浓度均为6%，但6%乙二醇对犬冷冻精液的活力高于6%甘油。意大利Ada
Rota等人对比了甘油和乙二醇在犬精液冷冻过程中的作用，实验表明：冷冻精液解冻后3小时内，相比添加甘油的稀释液，在添加乙二醇的稀释液中，直线运动和侧向运动的犬精子增多，同时转圈运动和歪头的精子也增多，这可能提示，犬精子细胞膜的损害，同时引起精子寿命的减短[24]。
抗菌物质：精液稀释液中添加一定抗菌药，有利于抑制细菌的繁殖；细菌在精液中繁殖不仅影响精液品质，而且也会造成输精后母犬生殖道的感染，甚至引起子宫蓄脓、败血症等严重威胁生命的疾病。在采精和精液处理过程中，难免使精液受到细菌的污染，而且精液及稀释液中含有丰富的、有利于细菌繁殖的营养物质，因此，在精液稀释液中加入抗菌药是十分必要的。常用的抗菌物质有青霉素、链霉素、氨苯磺胺等。青霉素和链霉素混合使用更具有广谱的抑菌效果；氨苯磺胺不仅可以抑制细菌微生物的繁殖，而且可以抑制精子的代谢机能，有利于延长精子在体外的存活时间，但它在冷冻过程中对精子反而有害，所以只适用于液体精液的保存；抗生素技术发展很快，新抗生素不断发现与合成，而且作用机制十分复杂，在精液稀释液中的使用有待进一步研究和完善。
其他添加剂&
还有一些添加剂能调节和改善精子外在环境，有利于提高受精机会，促进合子发育，常见的类别有：
酶类& 如β-淀粉酶，能促进精子获能，提高受胎率。
激素类& 如OXT、PGE等，能促进母犬生殖道蠕动，有利于精子运行，从而提高受胎率。
如B族维生素、维生素C[25]、维生素E等，具有改善精子活力，提高受胎率的作用。
其他添加成分& 如ATP、咖啡因、精氨酸等也能提供精子活力。
1.2.4.2& 常用稀释液
冷冻稀释液中的许多成分不止有一种作用，多是“身兼多职”。单糖提供能量只是其一个重要作用之一，它们还有缓冲、抗冻等作用；蛋黄同时具有缓冲、防冻、提供能量、抗氧化等多种作用；Tris-柠檬酸缓冲液除了缓冲酸碱度作用外，还可以起到提供电解质和抗冻等作用。所以说各成分的作用都是相互影响的，也就没有成分一定，比例固定的冷冻稀释液。理想的稀释液各组分间的配比应经过不断试验之后才能清楚。
Adersen稀释液（Adersen’s
Buffer）是国外研究中使用最为普遍的基础冷冻稀释液，其采用Tris-柠檬酸-葡萄糖作为缓冲体系，甘油含量为8
%（v/v），蛋黄含量为20
%（v/v）。近几十年来，很多研究者们在Adersen稀释液的基础上，对其配比稍作改动，来研究新稀释液的冷冻效果。其中，瑞典著名犬科繁殖专家，Linder
Forsberg教授研制出的Uppsala 稀释液（Uppsala
Extender），冷冻效果比较好，现为很多科研工作者所采用或用作研究参照。她在Adersen稀释液的基础上添加了0.5
%（v/v）的Equex STM Paste，使得解冻后精子活力和寿命有了显著地提高，解冻后平均活力可达50%以上。
商业化的冷冻稀释液主要面向于临床兽医或犬主人，具有配方精确、使用方便地优点，促进了犬冷冻精液事业的发展。现在世界上比较著名冷冻试剂有美国的CLONE、Synbiotics、ICG和德国的CaniPro，这些配方保密的稀释液的冷冻效果都是不错的。
1.2.4.3 稀释方法 &
犬精液稀释有两种方法：一步稀释法和两步稀释法。一步稀释法是把含甘油的稀释液在室温下一次稀释完毕；二步稀释法是在室温下第一次添加无甘油稀释液，降温平衡后、冷冻前添加等温含甘油稀释液。二步稀释法使精子逐步适应高渗环境，解冻后的精子质量较好.A.
Pena等研究发现先用含低浓度甘油（3%）稀释液稀释精子，再用含高浓度甘油（7%）稀释液等倍稀释后的精液在解冻后质量更佳[27]。
1.2.5 精液保存(semen
preservation)&
精液保存是为了延长精子的存活时间，维持其受精能力提高公犬配种效能。精液保存方法分液态保存和冷冻保存两大类。
1.2.5.1 精液液态保存 &
指精液稀释后，在0℃以上，以液态形式作短期保存，通过两种基本途径实现：一是控制精液的ph值，利用稀释液的弱酸环境或胶冻环境抑制精子的活动，降低精子能量消耗，使精子在常温（15～30℃）下得以保存更长时间，这种方法是2天内短期保存精液的简单方法；二是降低保存温度（达到0～5℃），减少精子运动和代谢，甚至使精子处于休眠状态，但不丧失生命力这两种情况下保存的精子，一旦环境温度和ph值恢复正常，精子又将重新恢复原有的运动和代谢水平。
1.2.5.2 精液冷冻保存&
是指将采集到的新鲜精液，经过特殊处理后，利用液氮（-196℃）、干冰（-79℃）或其他冷源，以冻结形式长期保持精液。精液冷冻保存是人工授精技术的一项重大革新，极大地提高优良公犬的利用率，加速品种的育成和改良[28-29]。
crystallization）是指在一定降温过程中，水分子重新按几何图形排列形成冰晶（结晶体），冰晶只有在0～-60℃温度范围内形成，降温或升温速度越慢，冰晶形成越大；-15～-25℃时形成冰晶最多，故把此温区称为精子冷冻过程中的危险致死温区；冰晶先形成于精子外水分，造成精子外高渗溶液，使精子脱水损伤，同时精子内水分结晶后，体积增大和冰晶块移动，对精子产生机械损伤，也会造成精子死亡[30]。
玻璃化（vitrification）是在超低温下，水分子保存原来无次序的排列，呈现均匀的冻结团块；精子在玻璃化冻结状态下，不会出现原生质脱水，结构受到保护，解冻后仍可恢复活力；在稀释液中添加甘油等亲水性物质，能减轻冰晶化，但甘油浓度过高对精子又毒害作用[31]。
1.2.5.3 精液冷冻保存步骤
精液冷冻保存技术的一般步骤是：精液品质检查 → 精液稀释 → 降温与平衡 → 分装与冷冻 → 解冻与检查 →
保存与运输。
精液品质检查&
精液品质直接影响冷冻后的效果。鲜精采精后应置于30℃左右的环境中，迅速准确地检查精液品质，作为冷冻精液用的原精液，精子活率应在0.8以上，并应选用公犬的第二段精液。
冷冻保存稀释液，一般是在原有低温保存稀释液的基础上，再添加一定的防冻物质。根据配制的要求和稀释的需要，可分别配制如下三种溶液，便于生产者使用：
基础液& 将糖类、盐类等可经高温消毒的药品成分，成批量地配制成溶液，瓶装密封保存；
Ⅰ液&
根据每次采精量，计算所需的稀释液量，在定量基础液中加入卵黄和抗生素等配制而成，用作精液的第一次稀释；
Ⅱ液& 取需要量的Ⅰ液，按配方比例加入一定量的甘油配制而成，用作精液的第二次稀释。
目前精液冷冻保存应用最广泛的稀释液是卵黄-Tris稀释液（配方见下表），生产中多采用两次稀释法：首先用不含甘油的Ⅰ液对精液进行稀释，放置一定时间后加入Ⅱ液。放置时间的长短，以及此阶段是否降温，没有统一的说法。
降温和平衡&
降温是从30℃经1～2小时缓慢降温至3～5℃，以防止低温对精子的打击。平衡是把稀释后的精液降温后，放置在3～5℃的环境中停留一定时间，是精子有一段适应低温的过程，同时使甘油充分渗入到精子内部，平衡时间通常以2～4小时为宜。
张志平等（2010）报道称，选取0.5%果糖的卵黄-Tris稀释液，平衡120 min，然后熏蒸20 min（设计精液在距液氮面20
cm处），可获得较高的犬精子冻后活力[32]。
分装和冷冻&
精液分装保存形式有三种，即细管型、颗粒型和安培型，应用最广泛的是细管型，管长125 ～ 133
mm,含0.25ml和0.5ml两种剂型，目前大多采用0.25ml的微型细管，提高了精液的利用率。用塑料细管进行精液分装，然后用逐步降温法或一步降温法进行冷冻。冷冻速度可以通过控制从细管到液氮面的距离及冷冻时间得到控制[33]。
张江等（2006）报道称，在Beagle犬精液冷冻研究中，冻管法效果略好于颗粒冷冻法,但是颗粒法与冻管法之间没有统计上的显著差异。
&&& 韩国的Suhee
等在2012年报道犬精液未经降温平衡直接冷冻的实验情况：直接将犬细管精液扔进液氮中保存，解冻后未发现有活力的精子；在液氮蒸汽中冷冻超过2分钟会增加犬精子的畸形率；使用5%的甘油和在液氮蒸汽中降温冷冻是未经降温平衡直接快速冷冻犬精液方法成功的关键；在液氮蒸汽中熏蒸2分钟，能够成功地将犬细管精液冷冻[35]。
禹学礼等（2004）报道在含4％甘油的卵黄-Tris冷冻稀释液中，0.5ml犬细管精液的最佳冷冻程序是[36]：
解冻过程应像冷冻过程一样，必须迅速通过精子的冰晶化温度区，减少对精子的损害；对0.5ml塑料细管精液来说，可在水浴70℃解冻6.5s（Andersen，1972）、70℃解冻8s(Farstad,1984)、50℃解冻30s（Silva等，1995）、30℃解冻30s(Gettlc,1982)、37℃解冻2min及55℃解冻5s（Dobrinski等，1993）。原则上，输精前解冻，解冻后精子活率不低于0.3，解冻后即输精。实验证明，解冻后即输精与解冻后4小时再输精，受胎率由77%降到51%。
保存与运输&
冻结的精液经抽检合格后，按品种、编号、采精日期、型号等标记包装后，转入液氮罐中贮存备用。为保证精液冷冻品质，在贮存和取用过程中必须注意以下事项：
①&&&&
定期添加液氮，不得使冻精的提筒暴露于液氮外；
②&&&&
从液氮罐取冻精时，提筒不得提出液氮罐外，可将提筒置于罐颈下部，用长镊子夹取细管；
③&&&&
转移冻精时，动作要迅速，冻精脱离液氮时间不得超过10秒。
输精（insemination）&
又称为授精，是把一定量精液输入发情母犬生殖道的操作技术。输精是保证母犬妊娠的关键步骤[37]，操作前应做好各方面的准备，以确保输精工作的正常实施[38]。
输精前准备&
母犬的准备&
将发情母犬保定后，尾巴拉向一边，将阴门及附近用温肥皂水擦洗干净，并用消毒液进行消毒，而后再用生理盐水冲洗，之后擦干净。
输精器械的准备&
犬的输精管可用尼龙软管、玻璃细管等自制的输精管，使用前高压灭菌彻底消毒，防止人为造成细菌感染。
精液的准备& 输精用的精液要经过品质检查，确认合格后方可用于输精。
1.2.6.2 输精要求 &
输精量应根据母犬体型和精液品质确定，新鲜精液一般为1.5～10ml,有效精子数为0.6～2亿，活力在0.6以上，每次发情输精2次；冷冻精液输精量为0.25～0.5ml,含1500万个精子，精子活力在0.5以上。
1.2.6.2 输精方法&
母犬的保定&
助手帮忙固定母犬的头部，将保定好的母犬尾巴拉向一侧，用温水洗净母犬外阴部并擦干。
将阴道开膣器加温并涂上液体石蜡，插入阴道，借助光线将开膣器前端顶住子宫颈口，并向前下方推进，便于固定子宫颈。
在输精管前端涂少量液体石蜡，通过阴道开膣器插入子宫颈，尽量插入到深处，然后推到注射器，将精液注入；精液注射完后，用注射器吸入1ml空气再注入，以顶出输精管内残留的精液。接着将输精管后退几厘米，并倒抽注射器，若没有吸到精液，就可以抽出输精管和阴道开膣器；若精液倒流回注射器内，应把精液全部抽出，重新调整开膣器位置，直到准确完成输精操作。
输精后的刺激&
为防止精液的流失，输精后可将母犬后躯抬高几分钟，并用手指伸入阴道前庭内5～10min，按摩阴蒂引起生殖道收缩，促进精子向上运动。
挪威的R.Thomassen等人报道了，使用冷冻精液，采用非外科方式对犬进行人工授精的10年临床数据如下：
从1994年到2003年，总共给526只，99个品种的母犬在发情期进行了685次人工授精，冷冻精液采自368只公犬。总的产仔率是73.1%，平均产仔数是5.7±0.1只。子宫内授精的产仔率（75%；n=665）高于阴道内授精的产仔率（10.0%，n=20;﹤0.05）。发情期授精的产仔率（78%，n=559;P﹤0.01）和产仔数（5.8±0.2；P﹤0.05）高于发情后期授精（55.7%
and 4.5±0.5, n=61）；与授精一次相比，两次授精有更高的产仔率和产仔数；低质量的精液（50%，精子畸形率﹥20%）与高质量的精液（精子活力≥50%，精子畸形率≤20%）相比有更低的产仔率，分别是61%和77%；小型犬产仔数（3.9±0.3，n=50）低于中型犬（5.7±0.3，n=94）、大型犬（5.9±0.2，n=295）、巨型犬（6.1±0.5，n=62）；6岁以上的母犬产仔率（68.2%）低于6岁以下母犬的产仔率（77.0%；P﹤0.05）；产仔数低于3只的母犬妊娠期（61.7±0.4天，n=30）长于产仔数更多母犬的妊娠期（60.5±0.1天，n=177）；这些数据表明，子宫内输精是犬人工授精的常规方式，实验结果也表明犬进行理想人工授精的条件是：母犬不大于6岁，公犬不大于8岁，授精时间应该是母犬排卵后的第2天和第3天。
2.1.2 药品
⑴& 三羟甲基氨基甲烷（Tris Base）：AMRESCO，批号：77-86-1
⑵& 柠檬酸：国药集团化学试剂有限公司，批号：
⑶& 葡萄糖：国药集团化学试剂有限公司，批号：
⑷& 果糖：国药集团化学试剂有限公司，批号：F
⑸& 卵黄：新鲜鸡蛋，北京超市购买
⑹& 青霉素：华北制药股份有限公司，批号X1105313
⑺& 硫酸链霉素：华北制药股份有限公司，批号1009103
⑻& 液氮：60L
⑼& 甘油（丙三醇）：国药集团化学试剂有限公司，批号：
⑽& Equex STM paste：Nova Chemical Sales,
Scituate Inc., MA, USA。
台盼蓝染色液：美国Sigma-Aldrich公司，产品号T8154，批号RNBC0848
吉姆萨染色液：美国Sigma-Aldrich公司，产品号GS500，批号061M4338
中性红：美国Sigma-Aldrich公司，产品号N2880，批号093N4569
⒁& 甲醛：国药集团化学试剂有限公司，批号
⒂& 甲基蓝：北京化学试剂公司，批号060606
⑴& 液氮罐：30L、60L东亚牌液氮罐
⑵& 离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司，SC-2546型
⑶& 显微镜：OLYMPUS CX41、爱国者 EV5680B
⑷& 冰箱：美的 BCD-112CM
⑸& 恒温水浴锅：江苏新康医疗器械有限公司 420-B
计数板：Marker板、血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）、计算机专用精子计数池
⑺& 显微镜转用数显恒温载物台：金坛市华峰仪器有限公司
⑻& 0.5ml精液冷冻塑料管：德国Minitube公司0.5mL型
⑼& 计算机辅助精液分析（CASA）：徐州市宝兴医疗设备有限公司
⑽& 温度计：红外测温仪、水银温度计、零下80℃温度计
⑾& 电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司，FA2014N型
⑿& 其他：移液器、洗耳球、容量瓶、烧杯、天平、载玻片、盖玻片、自制冷冻箱、注射器、
2.2.1 精液采集
采精前先让每条公犬到户外活动半小时，大小便结束后，用生理盐水冲洗阴茎和包皮，使用自制采集器，采精器按要求严格消毒。采用手握按摩法采集精液，收集第一、第二部分精液，第三部分精液未完整收集，采集频率为每周2次。
采集的精液汇集到一起，保存在37℃水浴中。用带刻度的集精杯或离心管直接读取精液的体积，同时记录精液的颜色和气味，初步判断精液是否正常。
2.2.2 精液评估
采集后的精液，取出0.5ml精液用于鲜精的质量评估，其余精液立即进行离心，去除前列腺液，为下一步精液的稀释准备。
本实验采用的离心方式为：离心力为700g，离心时间为6分钟。
本实验评估精液质量最主要的参数是测定精子活力和精子密度。
精子活力的测定
本实验采用目测法和计算机辅助精液分析来测定精子活力。
新鲜精液的精子活力测定，需要在采精后立刻进行，使用移液枪吸取20微升新鲜精液滴在精子计数板上，加盖盖玻片，使精子计数池中充满精液，不要产生气泡，之后将计数板置于100倍镜下观察，配合使用摄像显微镜，计算精子活力。每个样品镜下随机计数5个视野，每次统计精子总数不少于200个。精子计数板也可以用血球计数板或Makler细胞计数板代替。
精子活力 直线前行精子数/总精子数&100%
精子密度测定
精子密度是指每毫升精液中所含的精子数，成年健康公犬精子密度通常为1.25（0.4～5.4）亿/毫升。
本实验采用血球计数板计数法和使用进口精子密度仪测定精子密度。
血球计数板测定精子密度：用3%氯化钠溶液将一定量（取样通常是10微升）精液稀释100倍，然后使用显微镜和血球计数板计算稀释精液中的精子数，最后根据计数板原理（血球计数板的计数室深0.1mm，底部为正方形，边长是1.0mm；底部正方形又划分成25个小方格，每个小方格又是由16个小正方形组成；计算室容积是0.1立方毫米）换算出精子密度。
精子质膜完整性测定
本实验采用低渗肿胀法（HOST）进行测量。
2.2.3 精液稀释
精液稀释是充分体现和发挥人工授精优越性的重要技术环节，其主要的意义有：扩大精液容量、为精子提供营养和保护物质、抑制精液中有害微生物活动，从而达到延长精子存活时间和保存精子受精能力的目的。是以果糖．Tris-柠檬酸为基础，添加适量的卵黄和甘油。
本实验使用两种稀释液：稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ（配方见下表），并系统对比两种不同稀释液对犬精子在不同条件下保存的影响。
精子液态保存时，使用不含甘油的稀释液（配制时不加甘油，蒸馏水定容至100ml其它组成成分不变），采用一次稀释法。
精子冷冻保存时，采用两次稀释法，首先用不含甘油的稀释液对精液进行稀释，放置一定时间后，加入含有双倍甘油的稀释液，保证最后精液中稀释液成分含量符合实验要求。
稀释液配制后保存于4℃ 的冻箱中备用,使用前, 将其置于37℃ 的恒温水浴中预热, 待新鲜精液检查完后,
根据原精的活力和密度进行1～2倍稀释。
2.2.4精液保存
&&& 实验根据添加稀释液Ⅰ、稀释液Ⅱ和未加稀释液（原精液）分成三组，在其他实验条件相同的情况下，对精液进行常温保存、冷藏保存和冷冻保存，对不同组别的精子进行定期观察；本实验的目的是建立一套可行的犬精液保存技术，同时寻找犬精液保存的最佳稀释液。
2.2.4.1& 常温保存&
将按要求稀释后的精液装入1ml的离心管中，置于常温（30℃）下保存，每隔一定时间检测精子活力，直至大部分精子死亡。
2.2.4.2& 低温保存
将按要求稀释后的精液装入1ml的离心管中，并将离心管放在离心管盒中，离心管盒中装满常温水，这样可以使精液降温速度减慢，到达平衡的作用；同时将整个离心管盒置于5℃冰箱中保存，每隔一定时间检测精子活力，直至大部分精子死亡。
2.2.4.3& 冷冻保存
将稀释后的精液用0.5ml的塑料管进行分装并封口，裹上10层纱布和脱脂棉置于5℃冰箱中平衡2小时，然后将平衡好的细管精液置于自制的冷冻漂浮器上（与液氮面距离为2cm，此处液氮蒸汽温度为-80℃～-110℃）熏蒸10分钟后投入液氮中保存。
自制冷冻箱：准备一个带盖的泡沫箱，箱体厚度大于2cm，大小要与自制冷冻漂浮器配套，如果太大，使用中会浪费液氮，如果太小操作会不便；本实验中冷冻箱长、宽、高分别为40cm、30cm、30cm。
自制冷冻漂浮器：准备两块平整对称的长方体泡沫，通过两根水平放置的光滑小竹签连接在一起，调整小竹签形成水平面的位置，使之在放到液氮中时，竹签形成的水平面与液氮面的距离为2cm,同时两根竹签的间距要合适，利于保证放置细管精液的稳定，距离太远或太近都可能造成细管精液提前掉入液氮中。
冷冻过程：冷冻箱提前装好液氮，液氮的深度至少3cm，并将自制冷冻漂浮器放入其中，然后盖上盖静置10分钟，使液氮蒸汽均匀稳定；待液氮蒸汽稳定后，打开盖子，将装有精液的细管转移至漂浮器上，同时保持管间距为1cm左右，然后盖上盖子；静置10分钟（此操作中，精子经历了危险的降温过程），然后晃动冷冻箱，使细管精液从漂浮器上落入箱底的液氮中；在液氮中浸泡10分钟后，将细管精液快速转移入液氮罐内长期存储。
解冻：解冻过程与冷冻过程一样，必须迅速通过精子的冰晶化温度区，减少对精子的损害。本实验采用的解冻方法是，将镊子夹住细管精液从液氮中取出，迅速浸入37℃的水浴中，快速晃动细管约30秒，直至精液彻底融化。然后将细管从水中取出，擦干净表面的水，签掉细管封口端，将精液装入1ml离心管中，放入37℃水浴中保存，并定时对解冻后的精液进行质量评估，直至大部分精子死亡。
试验都重复3次，应用SPSS统计软件（17.0. 0版本SPSS Inc., Chicago, IL,
USA）进行统计。选用数据分析中的描述性分析及单因素方差分析中的最小差异性显著法（LSD，Least Significant
Difference）对数据进行平均数和方差分析，当P＜0.05时认为有显著差异。所有试验结果的数据用平均值±均值标准误（Mean±S.E.M）表示。
用稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ对犬精液进行低温（5℃）保存，将未经处理的犬新鲜精液作为对照组，间隔一定时间对各组精液的精子活力进行测定，结果表明：在低温（5℃）条件下，对照组活力下降显著，在第24小时时，对照组活力已经降到5%左右；同时，在低温（5℃）条件下，采用稀释液Ⅰ保存犬精子的时间和活力（288h,
59.5±3.1%）与使用稀释液Ⅱ保存犬精子（288h，60.1±2.7%）效果差异不显著，但在288h(12d)内，稀释液Ⅱ的保存效果优于稀释液Ⅰ的保存效果；在12d之后稀释液Ⅱ的保存效果不如稀释液Ⅰ的保存效果；稀释液Ⅱ中犬精子在360h(15d)时活力接近5%；稀释液Ⅰ中犬精子在504h(21d)时活力接近5%。
精子在冰箱中降温的冷应激，接着将整个烧杯置于4℃冰箱，平衡1.5小时；第二～四步是在平衡1.5小时后，每隔10分钟，加入2ml等温的稀释液Ⅱ-2（见表4），并混合均匀。
在4℃冰箱中，进行精液的细管分装，并及时密封；将装有精液细管的泡沫支架迅速并平稳地放置到自制的装有液氮的冷冻箱中，使精液细管在液氮面上保存10分钟，之后晃动冷冻箱，使细管从支架上落入箱底的液氮中，在液氮中浸泡10分钟后，将细管精液转移到液氮罐中长期储存。
液氮中取出精液细管，在37℃水浴中解冻1分钟后，转移入加有0.8ml稀释液Ⅱ-3的塑料带帽小试管中，并在水浴中保存6小时，对解冻后的精液在第0、1、
2、4和6小时进行品质鉴定。
&&& 2cm熏蒸犬细管精液，解冻后精子活力为64.1%，在37℃水浴1小时后活力最高达到69%，经过6小时，活力仍保存在50%左右；其他组别在刚解冻时，精子活力与2cm组相似，随着解冻后时间的延长，所有组别的精子活力都在下降；2cm组精子活力下降最慢，对精子保存效果最好。
&&& [40]，而在相同温度条件下保存精液，稀释液的组分对精液保存效果起决定性作用。为了选择更好的犬精液保存稀释液，便于提高犬人工授精的效果，本实验系统对比了两种稀释液对犬精液保存的效果。这两种稀释液都是在临床中广泛被使用，同时制作也比较方便。
稀释液Ⅰ（Andersen稀释液）是研究犬精液冷冻保存试验中使用最为普遍的稀释液，该稀释液以Tris-柠檬酸-果糖作为缓冲体系，使用8%的甘油，20%的蛋黄。该稀释液配方最早是由Andersen在1975年提出，此后被国内外学者大量引用，并进行改良；瑞典著名犬科繁殖专家Linder
Forsberg教授调整了Andersen稀释液中多种组分的含量比例，研制出Uppsala稀释液（Uppsala是瑞典第四大城市，其中乌普萨拉大学是世界上历史第二悠久的大学），并使用该稀释液进行更深入关于犬精液冷冻的研究。两种稀释液的配方原料完全一样，但主要成分比例不同，Andersen稀释液含2.422
g Tris（三羟甲基氨基甲烷）、1.36 g 柠檬酸、1.0 g
果糖、8ml甘油，Uppsala稀释液将Tris、柠檬酸、果糖和甘油分别调整为3.025g、1.7 g、1.275
g和5ml。由于主要成分被调整，必然会引起稀释液性能的变化，造成溶液的PH值、渗透压、缓冲能力等多方面的改变，从而形成对犬精子不同的保护效果。
可能是由于国内在这方面的研究起步较晚，从业人员较少的原因，国内关于犬精液冷冻方面的文献资料比较缺乏，而且其中涉及到犬精液稀释保存时基本上采用Andersen稀释液的配方，而在近几年国外发表的相关文章中，Uppsala稀释液配方被大量使用。关于Andersen稀释液和Uppsala稀释液对于犬精液保存效果的影响却没有在国内外相关文献中涉及，本试验意在填补这一空白，为相关试验研究提供参考。
选择未经处理的犬新鲜精液作为对照组，这是由于临床中，新鲜精液经常未经处理就用于人工授精；此时，一般情况下，未向精液中添加抗生素，所以对照组犬精液也未添加抗生素。
评价精液保存效果最好的方法是对比人工授精后犬的受孕率，然而，这一工作很难在实验室条件下完成，所以，临床上评估与精子受精能力有关的精子参数显得十分重要；对精子进行评估主要包括精子活率和活力、形态、质膜完整性、细菌学检查等指标，在众多评估项目中，精子活力是最重要的指标；精子必须有良好的活力才能达到输卵管与卵母细胞结合；同时，有实验表明在相同保存条件下，精子活力、质膜完整率、顶体完整率存在高度正相关[42-43]。
虽然精子的检测指标与精子的受精能力关系密切，但二者不是完全的正相关，这主要是由于使精子成功受精的过程更加复杂，不仅与精子本身有关，同时与人工授精的技能和母犬的生理状态有密切关系。同时评定精子的受精能力需要全面的检测指标，而且检测指标之间并非完全正相关，比如精子的运动速度与精子的存活时间，精子运动速度越快，消耗能量越快，存活时间就越短，但这样的精子更可能与卵子结合而完成受精过程；这种关系可以用于理解前列腺液与精子的关系，前列腺液好比精子的兴奋剂，能在短时间内使精子快速运动，但激烈的运动会使精子寿命缩短，造成精液的活力迅速下降，如果前列腺液能使快速运动的精子在死亡前就与卵子相遇并完成受精，那前列腺液就是有利于提高精子的受精率，而此时前列腺液却降低了精子的活力。
两种不同稀释液对犬精液常温（30℃）保存效果的影响
本实验的常温设定为30℃，这是符合犬人工授精临床使用情况的；目前犬人工授精场地多为犬舍，甚至是室外，所以夏季的时候，20℃室温条件一般不合实际。
实验结果表明，在常温（30℃）条件下，犬精子在体外的生存能力很差；对照组保存2小时，精子活力就已经下降到50%以下，由此提示，在常温下进行原精的人工授精时，采集到公犬精液应及时输入母犬体内，否则精子将在体外大量死亡。
与其他组别相比，对照组是犬的新鲜精液，其中含有除精子之外的精液其他成分，主要是大量的前列腺液；会显著延长精子的保存寿命，其中以稀释液Ⅰ的保存效果更佳，在体外7小时，能使精子活力保持在50%以上，能够满足常温下犬一般情况人工授精的需要。
&&& PH值会升高，这可能由于精子运动和精液中细菌代谢所产生产物造成的；同时，PH值升高会诱发精子运动代谢能力增强，加速精子的能量消耗，从而引起精子的死亡。
两种稀释液对犬精子都有良好的保护力，但二者之间差别不显著；两种稀释液组分的调整，会造成溶液性能的变化，由于缺少相应的实验设备，不能准确量化两种稀释液的渗透压和PH值变化，但从实验观察数据看，这种稀释液性能的变化在精子的承受范围之内，同时稀释液Ⅰ表现更好一点。
两种不同稀释液对犬精液冷藏（5℃）保存效果的影响
精液的冷藏保存一般是用于精液的长途运输，随着交通的发展，运输时间越来越短，同时良好的冷藏稀释液不仅能使精液保存更加持久的活力，而且保存更好的受精能力。稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ能在12天内保存精子活力在60%以上，已经能满足实际生产中对精液长途运输的要求。
本实验中，对照组精子活力下降显著，经过24小时，活力已经降到5%左右，这与之前报道的数据情况相符[44]。但根据目前的研究数据，我们不能断定精清会缩短精子的存活时间；不过实验表明，稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ会显著延长精子的存活时间。这很可能是由于拥有更好的缓冲能力，对精子具有更好的保护力，在精子保存过程中，两组稀释液的PH值和渗透压只有轻微的变化，而对照组原精液的PH值上升比较明显，这可能是因为精子运动的代谢产物和精液中污染的细菌代谢造成的精液PH值变化[45]；PH值升高会诱发精子运动代谢能力增强，加速精子的能量消耗，从而引起精子的死亡。
在冷藏条件下，由于环境温度的降低，精子代谢能力下降，能量消耗也降低，所以活力下降的速度比常温条件下明显减慢，但与实验组相比，对照组新鲜精液中前列腺液还是起到加速消耗精子能量的作用，使精子快速死亡。
稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ除了含有良好缓冲物质三羟甲基氨基甲烷（Tris）和柠檬酸外，同时含有精子的营养物质果糖、防冷刺激物质卵黄，以及抗菌物质青霉素和链霉素，从而有效地延长精子的存活时间。二者之间对精子活力的影响还是有差别的，在12天之前，稀释液Ⅱ表现更好的保护力，而在12天之后，稀释液Ⅰ表现更好；这种实验结果，好像提示：精子总的能量是一定的，在稀释液Ⅱ中释放快一些，精子表现活力高，但维持时间短一些，而在稀释液Ⅰ中，由于精子活力相当低一些，能量消耗慢一些，所以精子存活时间就长一点，但此种假设未经试验论证。
在临床实践中，为了保证良好的人工授精率，需要选用活力更高的精液进行AI，所以对犬精液进行十天内的冷藏保存时，建议选择稀释液Ⅱ。
两种不同稀释液对犬精液冷冻（-196℃）保存效果的影响
两种稀释液对犬精子的冷冻保存都有良好的保护作用，稀释液Ⅱ保存效果稍好，这很可能与两种稀释液中甘油的浓度不同有关。
在稀释液中添加甘油作为抗冻保护剂，能有效地消除精子内外环境中的水分形成冰晶，使稀释液在低温下，减轻冰晶化，增加玻璃化；精子在玻璃化冻结状态下，不会出现原生质脱水，结构受到保护，解冻后仍可恢复活力；但甘油浓度过高对精子又有毒害作用[46-47]。稀释液Ⅱ中甘油浓度为5%，比甘油浓度为8%的稀释液Ⅰ对精子保存效果更好。
本试验没有设对照组，这是由于在预实验的时候，就发现犬的新鲜精液在未经处理的时候直接进行液氮冷冻，解冻后没有发现成活的精子，这说明没有抗冻保护剂的保护，精子无法耐受细胞内外水分子的冰晶化作用。
分析两种稀释液解冻后精子的活力数据，发现精子活力并非解冻后一直在下降，解冻后1小时精子活力比刚解冻时要高，这很可能是由于刚解冻，精子未完全从冷冻状态复活过来，而关于精子在解冻后多长时间活力最高的问题需要进一步实验才能明确。
不同液氮熏蒸距离对犬细管精液冷冻的影响
与上组实验结果相似，所有组别在刚解冻时（0h），精子活力低于解冻后1h时，这很可能是由于刚解冻时部分成活的精子未完全从冷冻状态复活过来，做直线运动的能力较差，造成观察者计算直线运动精子数时忽略了这部分成活的精子，从而产生计算结果比实际值低。
不同液氮熏蒸距离对犬细管精液冷冻会有不同的影响[48]，这是由于距液氮面不同距离，液氮蒸汽的温度不同，从而造成对犬细管精液冷冻的速率不同，继而影响精液冷冻保存的效果[47]。
OEP 是Orvus es
Paste的缩写，也被称为Equex.STM，是一种表面活性剂，对精子膜结构有保护、修补作用，能够提高冻融精子活力、存活率及质膜完整率[49-50]；与卵黄共同作用能有效抑制精子顶体的异常变化，在一定程度上提高冷冻精液质量。OEP能有效抑制精子顶体囊泡形成，能使顶体囊泡明显缩小。至今为止，OEP对冻融精子的保护机理尚不完全清楚，2002年Yi
等人认为OEP通过分散卵黄中的类脂形成细小乳脂颗粒体，使这些类脂物更易进入精子质膜，而不是直接作用于精子膜结构．OEP与卵黄相互作用时间延长可以提高犬冻融精子的质量，但与卵黄相互作用时的温度对犬冻融精子质量无显著影响[52]
。据报道，在稀释液中添加0.5% Equex STM能够提高解冻后精子活力(Rota et al., 1999a; Pena and
Linde-Forsberg, 2000a)，同时显著提高精子与透明带结合能力(Strom Holst et al.,
2000)。在稀释液中添加0.5%的Equex STM
能相对提高精子细胞内Ca2+浓度和细胞膜的液化通透性。对比两组(实验3和实验4)精液冷冻保存实验，实验结果表明：稀释液中添加0.5%的OEP能有效地提高解冻后精子的活力。
Ⅰ（Andersen稀释液）保存效果更好；液氮冷冻保存时，稀释液Ⅱ（Uppsala稀释液）保存效果更好。
在常温（30℃）条件下，犬新鲜精液中的精子活力在采精后1小时下降到50%左右，7小时下降到5%左右；稀释液Ⅰ中的精子保存7小时后，活力降到62%左右。
在低温（5℃）条件下，未经处理的犬新鲜精液经过24小时，活力下降到5%左右；稀释液Ⅰ中的精子经过288小时（12天）的体外保存，活力下降到60%左右，经过21天，活力下降到5%左右。
经过液氮的冷冻（-196℃）保存，两种稀释液对犬精子都有良好的保护作用，但二者差异不明显。
使用液氮熏蒸法对犬细管精液进行降温冷冻时，将犬细管精液放在距离液氮面2cm位置进行熏蒸效果比3cm、4cm和6cm距离组别略好，但之间差异不显著。
[1]&&&&&&&&&&&&
Harrop A E. Artificial insemination of a bitch with preserved
semen. Br Vet J，: 424~425
[2]&&&&&&&&&&&&
Rowson L E A. Infertility in cow，sow and bitch. Ir Vet J.1954, 8:
[3]&&&&&&&&&&&&
Curry M R. Cryopreservation of semen from domestic livestock[J].Rev
Reprod，2000，(1) :46~52
[4]&&&&&&&&&&&&
杨利国主编. 动物繁育新技术. 北京：中国农业出版社, 8
[5]&&&&&&&&&&&&
梁书文，张卫宪主编. 宠物繁殖. 北京：中国农业科学技术出版社, 2
[6]&&&&&&&&&&&&
赵兴绪主编. 犬和猫的繁殖调控. 北京：中国农业出版社,2
[7]&&&&&&&&&&&&
Holt, W V. Fundamental aspects of sperm cryobiology: the importance
of species and individual differences. Theriogenology，2000，53,
[8]&&&&&&&&&&&&
禹学礼，庞有志，栗颖华，等. 犬颗粒冻精人工授精的实验[J]. 黑龙江动物繁殖,
[9]&&&&&&&&&&&&
Petrunkina A M，Gropper B E Topfer-Petersen A R，et a1．Volume regulatory
function and sperm membrane dynamics as parameters for evaluating
cryoprotective efficiency of a freezing extender. Theriogenology,
[10]&&&&&&&&
任康. 猪精液体外保存及精子损伤研究：[硕士学位论文]. 北京：中国农业大学，2009
[11]&&&&&&&&
渊锡藩，张一玲. 家畜繁殖学[M]. 杨陵：天则出版社，6
[12]&&&&&&&&
Yildlz C，Kaya A，Aksoy M，et a1．Influence of sugar supplmentation of
the extender motility，viability and aerosomal intergnty of dog
spermatozoa during freezing[ J]．Theriogenology,2000(54)
[13]&&&&&&&&
辛国省，张勇，龙瑞军，等. 藏獒精液冷冻过程中pH值及甘油对其活力的影响们. 经济动物学报, )：59~65
[14]&&&&&&&&
Sharma P K，Vemulapalli S，Kohn S. Effect of centrifuge speed,
refeigenation medium, and sperm washing meduim on cryopreserved
sperm quality after thawing. Arch Androl，~38
[15]&&&&&&&&
Koderle M，Aurich C，Schafer-Somi S. The influence of
cryopreservation and seminal plasma on the chromatin structure of
dog spermatozoa.Theriogenology，5~220
[16]&&&&&&&&
张国军. 离心对犬精液冷藏保存和冷冻保存复温后精子质量的影响：[硕士学位论文] . 北京： 中国农业大学，2008
[17]&&&&&&&&
王宪龙，刘彦，曾中明. 国外犬精液冷冻技术的研究进展[J]. 中国畜牧杂志, )：26~29
[18]&&&&&&&&
Ponglowhapan S.， Essen-Gustavsson B.， Linde C. Forsberg.Influence
of glucose and fructose in the extender during long-term storage of
chilled canine semen.Theriogenology，8~517
[19]&&&&&&&&
Songsasen N，Yu I，Murton S，et al. Osmotic sensitivity of canine
sperm atozoa. Cryobiology ，~90
[20]&&&&&&&&
Varela Junior A S，Corcini C D，Ulguim R R，et al. Effect of low
density lipoprotein on the quality of cryopreserved dog emen.
Animal Reproduction Science，：323~327
[21]&&&&&&&&
Bencharif D， Amirat L，Anton M， et al. The advantages of LDL (Low
Density Lipoproteins) in the cryopreservation of canine semen.
Theriogenology，78~1488
[22]&&&&&&&&
Martins-Bessa A, Rocha A, Mayenco-Aguirre A. Comparing ethylene
glycol with glycerol for cryopreservation of canine semen in
egg-yolk TRIS extenders. Theriogenology，47~2055.
[23]&&&&&&&&
高雅，罗桂河，李卫东，等. 不同浓度乙二醇和甘油对犬精液冷冻效果的影响. 中国农学报, ):25~28
[24]&&&&&&&&
Rota A.， Milani C.， Cabianca G. Comparison between glycerol and
ethylene glycol for dog semen cryopreservation .
Theriogenology，48~1858
[25]&&&&&&&&
Wittayarat M, Kimura T, Kodama R, et al. Long-term preservation of
chilled canine semen using vitamin C in combination with green tea
polyphenol [J]. Cryo letters, ): 318~26.
[26]&&&&&&&&
彭建国，周明. 添加咖啡因对犬冷冻精液成活率的影响. 甘肃畜牧兽医, 2009(3)：15
[27]&&&&&&&&
Pena A，Linde-Forsberg C. Effects of Equex，one or two stip
dilution，and two freezing and trawing rates on post-thaw survival
of dog spermatoa[J] .Theriogenology，9~875
[28]&&&&&&&&
Alamo D.， Batista M.， Gonzalez F. et al.Cryopreservation of semen
in the dog: Use of ultra-freezers of-152.8℃ as a viable alternative
to liquid nitrogen. Theriogenology, ~82
[29]&&&&&&&&
Eilts B. E. Theoretical aspects of canine semen cryopreservation.
Theriogenology，2~697
[30]&&&&&&&&
Hewitt D A，Leahy R，Sheldon I M，et al. Cryopreservation of
epididymal dog sperm. Animal Reproduction Science,
[31]&&&&&&&&
Burgess C M, Bredl J C, Plummer J M, et al. Vital and
ultrastructural changes in dog spermatozoa during cyopreservation
[J]. Journal of reproduction and fertility Supplement, 2001, 57
[32]&&&&&&&&
张志平，张君涛，牛森，等. 犬精液冷冻方法的优化试验. 中国农学通报, )：14~16
[33]&&&&&&&&
Battista M, Parks J, Concannon P W. Canine sperm post-thaw survival
following freezing in straws or pellets using pipes, lactose, tris
or test extenders. In: Proceedings of the 11th Int Congr Anim
Reprod and AI, Dublin 3, 1988，pp. 229~231
[34]&&&&&&&&
张江，乔伟伟，顾剑新，等. 不同冷冻剂型和稀释保护剂对Beagle犬精液冷冻的影响.
实验动物与比较医学，Mar.): 50~54
[35]&&&&&&&&
Kim S.， Lee Y.， Yang O. et al. Feezing without cooling
equilibration in canine sperm. nimal Reproduction
Science，：111~ 118
[36]&&&&&&&&
禹学礼，栗颖华，昝林森，等. 程序降温法冷冻犬细管精液的实验. 中国农学通报, 2004,
20(4)：33~36&&
[37]&&&&&&&&
England G C W, Burgess C M, Freeman S L, et al. Relationship
between the fertile period and sperm transport in the bitch [J].
Theriogenology, ~7):
[38]&&&&&&&&
Rota A.，Milani C，Romagnoli S，et al.Pregnancy and conception rate
after two intravaginal inseminations with dog semen frozen either
with 5% glycerol or 5% ethylene glycol. Animal Reproduc tion
Science , ~97
[39]&&&&&&&&
Thomassen R，Sanson G，Krogen&s A，et al. Artificial insemination with
frozen semen in dogs：A retrospective study of 10 years using a
non-surgical approach. Theriogenology，45~1650
[40]&&&&&&&&
Watson, P F. The causes of reduced fertility with cryopreserved
semen. Anim. Reprod. Sci.
[41]&&&&&&&&
Amann R. Can the fertility potential of a semen sample be predicted
accurately. J Androl，~98
[42]&&&&&&&&
Kumi-Diaka J. Subjecting canine semen to the hypo-osmotic
test.Theriogenology，79~1289
[43]&&&&&&&&
Kumi-Diaka J，Badtram G. Effects of storage on sperm membrane
integrity and other functional characteristics of canine
spermatozoa: in vitro bioassay for canine semen. Theriogenology，
[44]&&&&&&&&
England G C W，Allen W E. Factors affecting the viability of canine
spermatozoa II.Effects of eminal plasma and
blood.Theriogenology，3~381
[45]&&&&&&&&
Rota A，Stom B，Linde-Forsberg C. Effects of seminal plasma and three
extenders on canine semen stored at 4℃.
Theriogenology，5~900
[46]&&&&&&&&
Bruce E，Eilts. Theoretical aspects of canine semen
Cryopreservation. Theriogenology，2~697
[47]&&&&&&&&
Fahy, G M. The relevance of cryoprotectant “toxicity” to
cryobiology. Cryobiology，1986,23： 1~13
[48]&&&&&&&&
Yu I, Songsasen N, Godke R A，et al.Differences among dogs in
response of their spermatozoa to cryopreservation using various
cooling and warming rates. Cryobiology，~78
[49]&&&&&&&&
Tsutsui T.，Hase M.，Hori T. Effct addition of Orvus ES paste to
frozen canine seine extender . Sperm acrosomes[J]. J Vet Med
Sc，)：537~538
[50]&&&&&&&&
Rota A, Iguer-Ouada M, Verstegen, et al. Fertility after vaginal or
uterine deposition of dog semen frozen in a tris extender with or
without Equex STM paste.Theriogenology, 45~1058
[51]&&&&&&&&
Yi Y J，Im G S，Park C S. Lactose-egg yolk diluent supplemented with
glucosamine affect acrosome morphology and motility of
frozen-thawed boar sperm[J] . Animal Reproduction
Science，7~194
[52]&&&&&&&&
李新红，高超，赵蕾. OEP、SDS与卵黄的相互作用时间及温度对犬冻融精子质量的影响.复旦学报（自然科学版）, 2007,
46(6)：52 ~56
[53]&&&&&&&&
Alhaide A K，Watson P F. Cryopreservation of dog semen: The effects
of Equex STM paste on plasma membrane fluidity and the control of
intracellular free calcium. Animal Reproduction
Science，：147~161
本论文是在导师施振声教授直接指导下完成的，从论文选题、设计，到实验实施、数据整理分析，以及论文的撰写，无不凝聚着恩师的心血和汗水。恩师严谨务实的为学之道，正直宽厚的为人之道，儒雅风趣的处世之道都让我印象深刻、受益匪浅；在此向我敬爱的恩师表达我内心崇高的敬意和诚挚的感谢。
非常感谢对本实验做出极大贡献的杨应华硕士，没有你的帮助，我根本无法顺利完成此项实验！
感谢钟友刚老师在学习和试验中给以我的许多指导和帮助，感谢中国农业大学动物医院提供良好的实验条件和场地！
在此，向所有关心过、帮助过我的老师、同学和朋友们致以崇高的敬意和衷心的感谢！
最后，深深感谢我的家人，没有她们的支持和帮助，我是无法安心学习和工作的！！！
二零一三年十一月于北京
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