安全高效的肿瘤基因治疗重组腺病毒载体的构建--《吉林大学》2013年硕士论文
安全高效的肿瘤基因治疗重组腺病毒载体的构建
【摘要】：重组5型腺病毒载体已经被广泛应用到肿瘤的基因治疗的研究中，并且在一些例如乳腺癌，膀胱癌，结肠癌等肿瘤疾病中取得了良好的肿瘤抑制效果。但是，重组腺病毒在注射到人体通过血液循环进入靶组织的过程中大量的向肝组织中富集，给肝组织造成了巨大的压力。本论文根据课题组前期研究基础，设计构建新型的重组5型腺病毒载体，希望能够在体内实现安全而又高效抑制肿瘤细胞的生长。
新型重组5型腺病毒载体根据腺病毒感染宿主细胞过程中涉及的三种主要结合方式进行对腺病毒基因组进行修饰，来降低病毒在肝组织中的富集。通过在腺病毒的HI-loop环上加入RGD（Arg-Gly-Asp）小肽，增强腺病毒对多种肿瘤细胞（无CAR或低CAR表达）的感染和表达能力。在腺病毒knob区进行点突变，改变病毒与CAR受体的结合位点，降低由fiber纤毛蛋白与CAR受体介导的结合过程，从而降低载体感染肝细胞的能力。通过将5型腺病毒六邻体的HVR区的HVR5和HVR7替换成26型腺病毒的对应区域，降低病毒载体HVR区与FX因子结合介导的进入宿主细胞的过程。
另外，利用端粒酶启动子hTERT携带自杀基因HSV-TK，实现5型腺病毒载体特异的杀伤肿瘤细胞，降低其全身毒性，进一步增强体内安全性。
本文构建在Ad5-RGD的基础上构建了Ad5-mu-RGD和Ad5-HVR26-mu-RGD，其中Ad5-mu-RGD的构建较为顺利，目前已完成体外病毒感染活性评价实验和体外肿瘤杀伤实验并利用活体成像以及荧光实时定量PCR的手段分析了其在体内的感染和分布情况。结果显示：在不同CAR受体表达水平的肿瘤细胞中，重组腺病毒Ad5-mu-RGD和骨架未经过修饰的重组腺病毒Ad5-luc感染能力的高低各有不同，充分的验证了在腺病毒进入宿主体内的过程中重组腺病毒RGD短肽结合不同细胞表面整合素能力的高低导致的影响的不同。重组病毒Ad5-luc和Ad5-RGD-luc相比存在感染能力上的差距，证明了在腺病毒knob区HI-loop插入RGD基序可以广泛地提高腺病毒进入不同肿瘤细胞的能力。在对正常肝细胞的感染能力上Ad5-mu-RGD-luc明显低于Ad5-RGD-luc，表明把AB-loop的Ser408、Pro409进行点突变起到了预期的效果，降低了病毒在肝的富集能力，减轻了病毒在治疗肿瘤的过程中带给肝脏的压力。抗肿瘤活性的体外评价上，携带自杀基因的重组腺病毒对于不同肿瘤细胞的杀伤活性有所不同。相关的体内的肿瘤杀伤试验和肝组织损伤分析目前正在进行。Ad5-HVR26-mu-RGD目前完成了其构建，正在进行病毒的包装。
【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：R730.5【目录】：
摘要4-6Abstract6-11第一章 前言11-24 1.1 腺病毒相关知识简介11-14
1.1.1 腺病毒颗粒形态及其结构11-12
1.1.2 病毒基因组构成及功能12-13
1.1.3 腺病毒衣壳蛋白结构与功能13-14 1.2 腺病毒感染细胞的过程14-16
1.2.1 粘附和进入细胞14-16
1.2.2 转录与复制及病毒的释放16 1.3 腺病毒作为基因治疗载体的简介16-17
1.3.1 腺病毒载体的特点16-17 1.4 基因治疗在癌症治疗中的应用17-19
1.4.1 自杀基因疗法治疗癌症策略17-18
1.4.2 人类端粒酶启动子 hTERT18-19 1.5 论文设计与实验方案19-24
1.5.1 论文立题依据19
1.5.2 论文构思19-21
1.5.3 实验方案与技术路线21-24第二章 实验材料和方法24-37 2.1 材料、仪器和试剂24-26
2.1.1 菌种、质粒、细胞以及动物24
2.1.2 主要化学试剂24-26
2.1.3 主要仪器26 2.2 实验方法26-37
2.2.1 质粒的小量提取26-27
2.2.2 质粒的大量提取27-28
2.2.3 DNA 的 PCR 扩增28-29
2.2.4 提取病毒基因组 DNA29-30
2.2.5 腺病毒的包装30
2.2.6 重组腺病毒的筛选30-31
2.2.7 腺病毒的扩增31-32
2.2.8 纯化腺病毒--氯化铯密度梯度离心法32-33
2.2.9 衣壳蛋白染色法测定重组腺病毒载体的滴度33
2.2.10 重组腺病毒的检测33-34
2.2.11 流式细胞仪检测人源肿瘤细胞表面 CAR 受体的表达34
2.2.12 Luciferase 活性的检测34
2.2.13 实时定量 PCR 检测重组腺病毒在小鼠体内分布34-35
2.2.14 重组腺病毒载体在小鼠体内的生物学分布35-36
2.2.15 重组腺病毒对于肿瘤细胞生长的特异性抑制36-37第三章 结果与讨论37-60 3.1 构建腺病毒骨架质粒 Ad-mu-RGD 和 Ad-HVR26-mu-RGD37-46
3.1.1 质粒 Adeno-X-mu-RGD 的构建及鉴定37-39
3.1.2 穿梭载体 pRSETB 的改造及鉴定39-40
3.1.3 pRSETB-AdMax6k 的构建及鉴定40-42
3.1.4 pRSETB9k 的构建及鉴定42-44
3.1.5 Ad5-mu-RGD 和 Ad5-HVR26-mu-RGD 的构建及鉴定44-46 3.2 重组腺病毒 Ad5-mu-RGD-luc 和 Ad5-mu-RGD-hTERT-TK 的包装与纯化46-50
3.2.1 重组腺病毒的包装46-48
3.2.2 重组腺病毒的鉴定48-49
3.2.3 重组腺病毒滴度的检测49-50 3.3 流式细胞仪检测肿瘤细胞表面 CAR 受体表达50-51 3.4 重组腺病毒在体外感染细胞能力的评价51-53 3.5 重组腺病毒载体在生物体内的分布特点53-56 3.6 重组腺病毒载体在体外对肿瘤细胞杀伤效果的评价56-57 3.7 结论57-60参考文献60-64致谢64-65
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京公网安备75号人类腺病毒用作重组疫苗和基因治疗载体的优势与前景--《中华实验和临床病毒学杂志》1995年02期
人类腺病毒用作重组疫苗和基因治疗载体的优势与前景
【摘要】：人类腺病毒用作重组疫苗和基因治疗载体的优势与前景张德礼自从１９５３年分离到第一株人类腺病毒（Ａｄ）以来，目前发现Ａｄ已达４７个血清型。近年来已经从蛋白结构、遗传背景、致病作用及细胞转化机理等多方面对Ａｄ进行了十分详细的研究，并且利用Ａｄ强启动子构建了...
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R392-33【正文快照】：
人类腺病毒用作重组疫苗和基因治疗载体的优势与前景张德礼自从１９５３年分离到第一株人类腺病毒（Ａｄ）以来，目前发现Ａｄ已达４７个血清型。近年来已经从蛋白结构、遗传背景、致病作用及细胞转化机理等多方面对Ａｄ进行了十分详细的研究，并且利用Ａｄ强启动子构建了基
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肺腺癌，已经化疗完，基因检测说可以做靶向治疗，我想...
肺腺癌，已经化疗完，基因检测说可以做靶向...
病情描述（发病时间、主要症状、症状变化等）：肺腺癌，已经化疗完，基因检测说可以做靶向治疗，我想咨询什么时候开始做靶向治疗为佳？曾经治疗情况和效果： 4个化疗，没做放疗。
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问题分析：你好，癌症晚期中医效果较好,因为晚期癌症患者因为癌细胞消耗性大体质虚弱,癌细胞大多已经多处转移,西医意见建议：局部治疗效果不佳,而且患者也不能耐受手术与放化疗,服用中药可以全面调理机体内环境,补气养血,扶正祛邪,有效控制病情,缓解痛苦,延长生命..建议采用中医动态的疗法治疗。
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建议：，周期也是根据病人身体，意见建议：病情，以及承受能力来决定，价格的话每个医院每个地区也是不一样、具体你可以去医院做详细的指导检查在做决定
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指导意见：早期争取手术,术后化疗，服用中药巩固疗效,仅手术切除局部病灶是无用的,应该采用中医动态疗法服用中药进行 全面调理,活血化瘀,软坚散结,滋阴润肺,增强免疫力,抑制癌细胞生长扩散.
问放疗好还是化疗好
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专长：长期从事肿瘤临床工作，对肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌及腹膜后肿瘤等本专业常见肿瘤都有着丰富的临床经验,熟悉各种肿瘤治疗方法。采用国际领先水平的CLS生物细胞免疫抗癌法对肿瘤患者进行有效治疗，使病人生存率达到国内较高水平
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病情分析：化疗属于将药物通过静脉输液的方式输送进体内杀灭肿瘤细胞。放疗是应用放射线或放射粒子辐射杀灭肿瘤细胞。两者的共同点在于疗法均不能特异性辨识肿瘤细胞与正常细胞，故治疗后的副作用与不良反应较多。在临床可同时应用，但对体质较差的癌症患者的伤害较大。推荐不能手术的癌症患者选择CLS生物免疫治疗。意见建议：CLS多细胞免疫治疗是优于手术、放疗和化疗的最新肿瘤治疗技术 ，通过生物技术在高标准的实验室内培养出可杀伤肿瘤的自体免疫细胞，回输体内，直接 杀伤癌细胞的治疗方法。与传统的治疗方法不同，生物免疫治疗主要是调动人体的天然抗癌 能力，恢复机体内环境的平衡，临床上常常在晚期术后或放化疗后联合生物免疫治疗。生物免疫治疗可以精确杀死手术后残余癌细胞，提升放化疗治疗效果，提高患者机体免疫能力， 更好的防转移，防复发。对放化疗起到减毒增效的作用，有利于放化疗的顺利进行，同时，在原先DC-CIK细胞基础上又加入了三种细胞，分别是NK、CD3AK、γδT细胞，在治疗肿瘤过程中效果更加明显。
问男，56，吸烟30多年，今年3月查出肺腺癌，做了3期化疗...
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问肺腺癌化疗结束，需要放疗治疗吗？？一年前因为出现了...
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