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Daintain在巨噬细胞RAW2647中的功能研究
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求巨噬细胞RAW264.7
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我也有K562& &能交换RAW264.7吗
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PTS2对LPS引起的RAW264.7细胞中iNOS蛋白表达的影响及其机理研究
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PTS2对LPS引起的RAW264.7细胞中iNOS蛋白表达的影响及
官方公共微信蓖麻毒素对小鼠巨噬细胞系Raw 264.7细胞自噬作用研究--《吉林大学》2015年硕士论文
蓖麻毒素对小鼠巨噬细胞系Raw 264.7细胞自噬作用研究
【摘要】：蓖麻毒素(RT)是天然毒素中毒性较强的毒素之一，具有很强的细胞毒性。由于所用剂量不同，作用有所不同。高剂量RT可抑制蛋白质合成，低剂量RT可诱导细胞因子的产生、脂质过氧化损伤，诱导细胞凋亡。近年来，RT被广泛用于抗癌免疫毒素的研究及生物杀虫剂。自噬广泛存在于真核生物中，在细胞生长发育、细胞分化等过程中起着重要的作用，可以维持细胞自身的动态平衡。当机体处于营养缺失，氧化应激等刺激下，机体自噬水平会上调。但RT作用Raw264.7细胞后，是否对细胞自噬有作用目前尚不清楚。
实验目的：
本实验以小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞为研究对象，探讨RT对小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬的作用。
实验方法：
(1)检测RT对小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬的作用
MTT方法检测Raw264.7细胞存活率；免疫荧光方法检测LC3蛋白表达；Western blot方法检测LC3、beclin-1、p62、mTOR、p-mTOR蛋白表达；流式细胞数检测细胞自噬强度；透射电镜检测细胞超微结构。
(2)检测自噬抑制剂3MA对RT作用Raw264.7细胞自噬的作用
采用MTT方法检测3MA对细胞存活率的影响；Western Blot检测LC3蛋白表达。
(3)检测P38MAPK信号通路对RT作用Raw264.7细胞自噬的作用
采用Western Blot方法检测P38MAPK和p-p38MAPK蛋白表达。
实验结果：
(1) RT对小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬的作用
MTT检测RT对Raw264.7细胞存活率结果显示，RT作用小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞24h和48h后，RT对Raw264.7细胞的存活率具有时间和剂量依赖性。作用24h时，RT作用Raw264.7细胞的半数致死浓度大概在100ng/mL左右。
采用免疫荧光方法检测LC3蛋白表达。激光共聚焦结果显示，同对照组相比，两组阳性对照中LC3蛋白表达量增高，RT作用Raw264.7细胞1h，2h，4h后，结果显示LC3蛋白表达量显著增高。
采用Western Blot方法检测LC3、Beclin-1、P62、mTOR、p-mTOR蛋白表达结果显示，除了mTOR蛋白，其余所有蛋白表达均比对照组高。RT分别作用1h、2h、4h后，LC3蛋白表达量明显增多；Beclin-1蛋白表达先增加后降低；P62蛋白表达随着时间延长，表达量降低；mTOR蛋白表达无明显变化；而p-mTOR蛋白表达比空白对照组强。
采用流式细胞数检测细胞自噬的强度，所得流式结果显示，RT作用后，细胞自噬强度明显增强，作用2h后，细胞自噬强度最高。
采用透射电镜观测细胞超微结构，透射电镜结果显示，RT作用细胞后，同对照组相比，自噬空泡显著增多，细胞体积明显变大，细胞器更加活跃。
(2)3MA对RT作用小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬的作用
采用MTT方法检测加入3MA自噬抑制剂后，RT对小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞存活的影响，结果显示，加入3MA自噬抑制剂后，细胞死亡率增高。
采用Western Blot方法检测加入3MA自噬抑制剂后，LC3蛋白表达情况。结果显示，加入3MA自噬抑制剂后，LC3蛋白表达量降低。
(3) P38-MAPK信号通路对RT作用Raw264.7细胞后细胞自噬作用
采用Western Blot方法检测p38MAPK信号通路对细胞自噬的作用。结果显示，p38MAPK蛋白表达量无明显变化，而p-P38MAPK蛋白表达量增高。
综合以上研究结果表明：低剂量的RT可以诱导小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬，自噬发生时，自噬空泡明显增多，自噬相关蛋白表达增高；加入3MA自噬抑制剂后，细胞死亡率增加，说明细胞自噬在RT作用细胞的过程中起到一定的保护作用；在自噬发生的过程中，其调控信号可能是通过P38MAPK信号通路进行的，具体机制还需进一步研究。
【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：R285.5【目录】：
中文摘要4-6Abstract6-12前言12-14第1章 文献综述14-24 1.1 蓖麻毒素的研究进展14-18
1.1.1 RT 的结构14-17
1.1.2 RT 的作用机理17-18
1.1.3 RT 可结合哺乳动物细胞18 1.2 自噬的研究进展18-24
1.2.1 自噬的分类及形成18-20
1.2.2 自噬的分子机制20-21
1.2.3 自噬的调节21-22
1.2.4 自噬与疾病22-24第2章 蓖麻毒素对小鼠巨噬细胞系 Raw264.7 细胞自噬作用研究24-41 2.1 实验材料及设备24-28
2.1.1 细胞株与 RT24
2.1.2 主要仪器设备24-25
2.1.3 主要试剂25-27
2.1.4 主要试剂的配制27-28 2.2 实验方法28-32
2.2.1 小鼠巨噬细胞 Raw 264.7 的培养28
2.2.2 MTT 检测 RT 作用后细胞的存活28-29
2.2.3 激光共聚焦检测 LC3 蛋白表达29
2.2.4 Western Blot 检测自噬相关蛋白的表达29-31
2.2.5 流式细胞术检测细胞自噬强度31
2.2.6 透射电镜观测自噬空泡的形成31-32 2.3 实验结果32-39
2.3.1 RT 对小鼠巨噬细胞 Raw 264.7 细胞的作用32-36
2.3.2 自噬抑制剂 3MA 对 RT 作用小鼠巨噬细胞系 Raw 264.7 细胞自噬的作用36-38
2.3.3 P38 信号通路在 RT 诱导小鼠巨噬细胞 Raw 264.7 细胞自噬过程中的作用38-39 2.4 讨论39-41第3章 结论41-42参考文献42-51致谢51
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