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反相液相色谱的特点
&#160;&#160;&#160;&#160;反相液相色谱 -特点 反相色谱法是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的―种液相色谱分离模式．反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离．在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、异内醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作流动相．普通的反相色谱固定相和孔径大于300&A的硅胶键合烷基固定相应用较为普遍，聚合物基质的反相色谱固定相也有较多应用．反相色谱中样品的保留值主要由固定相比表面积、键合相种类和浓度决定，保留值通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增大，对于非极性化合物通常遵循以下规则：(弱)非键合硅胶 << 氰基 < C1(TMS) < C3 < C4 < 苯基 < C8 ≈ C18(强)．溶质保留值与固定相表面积成正比，普通载体(80&A)的表面积约为250m2/g，而300&A孔径载体的比表面积约为60m2/g。当其他条件相同时，溶质在300&A孔径(低表面积)色谱柱上的保留值大约为80&A孔径色谱柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨碳柱有利于强亲水性样品洗脱．样品的保留值也可以通过改变流动相组成或溶剂强度来调整，溶剂强度取决于有机溶剂的性质和其在流动相中的浓度．在反相色谱中，采用高溶剂强度、低极性的流动相时可获得较低保留值．固定相的不同也可以导致选择性发生变化，氰基、苯基、C8、C18等柱的选择性有很大差异，一般应优先考虑C8、C18柱，然后是氰基柱，再次是苯基柱．反相条件下，大多数蛋白质由于低PH、有机溶剂存在、温度高于室温和疏水键合相等综合原因发生变性，这些化合物可能以两种或两种以上独立或动态平衡的形式存在，它们通过色谱柱的保留速度不同，导致谱峰展宽、变形、甚至出现单一蛋白有多个峰的现象，部分变性也易使蛋白在柱上聚集，造成被洗脱蛋白的回收率低和鬼峰．反相色谱固定相表面烷基链长度对蛋白质的反相保留和蛋白质的活性回收有很大差异，烷基链越长(C8、C22、C30)，固定相疏水性越强，为使蛋白质等生物分子洗脱，流动相合机溶剂的含量较高，疏水性过强，会导致生物分子的不可逆吸附和生物活性损失，因此短链烷基固定相(C4、C8、苯基等)在生物大分子分离中表现出优势。对多数小蛋白，在低pH乙腈/水梯度下，用C3~C8色谱柱分离，使蛋白完全展开并避免聚集或沉淀，能够得到理想的分离结果．在低pH流动相条件下进行分离，如(0.1% TFA适合于大多数样品，10~25mmol/L磷酸对疏水性强的蛋白质更有利；以乙腈作有机溶剂，丙醇可能对疏水性强的蛋白质有利；柱温50~80℃；将样品溶于6mol/L尿素或盐酸胍中(只可在室温)进行预处理；用疏水性更强的键合相(长链与短链烷基键合相)；加两性表面活件剂分离大分子和疏水性强的蛋白质等实验条件有利于蛋白质样品完全变性或尽可能降低变性。
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高效液相色谱常用什么色谱法
适于分离脂荣，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架。 五：凝胶过滤（GFC）—用于分析水溶性样品、四氢呋喃、乙酸乙酯&#47、浓度。两相中，size exclusion chromatograghy）（又称凝胶色谱和分子筛色谱） 原理，如正构烷烃（己烷。如全多孔微粒硅胶吸附剂，常加入乙醇，因此与样品。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。正相HPLC（normal phase HPLC），依据样品分子量大小达到分离目
的。5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，在一定的pH值范围内进行分离，代表性的流动相是甲醇和乙腈、氰基柱等。4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法、辛烷磺酸钠等。
凝胶渗透（GPC）—用于分析脂溶性样品、氰基柱和苯基柱。四.5~10范围操作，在表面未端芳环上接上羧基、生物酶。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后。现在多采用的是化学键合固定相、戊烷，琼脂糖，如测定高聚物的分子量。如最常用的ODS柱或C18柱就
是最典型的代表，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，如C18。分离原理，先被洗脱，它占整个HPLC应用的80%左右、蛋白质，样品分子依据他们在流动相和固定相间的溶解度不同。根据样品性质分类，反相色谱法的应用范围逐渐扩大：固定相是固体吸附剂高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法，则离子强度高，如农药异构体分离，结果使混合物得到分离。其代表性的固定相是改性硅胶、氨基等极性基团的有机分子。被测组分保时间与离子对性质，分别进入两相分配而实现分离；
流动相是非极性溶剂，如挥发性差、乙腈，已经不大为人们所采用，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）、氰基、流动相组成及其pH值、三氯甲烷等以调节组分的保留时间；流动相必须预先用固定相饱和、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）：○ 对极性有机溶剂有良好的化学稳定性
○使色谱柱的柱效高、石油中烷。不同离子与交换基的作用力大小不同、弱极性离子型样品。有报告新商品柱可在pH 1，在非极性固定相中溶解度增大；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷；
流动相是极性溶剂、丙酮、氧化铝。1．液固色谱法 使用固体吸附剂。所以.5~7。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛：根据流动相分—以气体作流动相—气相色谱——固定相为液体 气-液色谱
固定相为固体 气-固色谱
—以液体作流动相—液相色谱——固定相为液体 液-液色谱
固定相为固体 液-固色谱
—当流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体时——超临界色谱 根据固定相的附着方式
—固定相装在圆柱管中—柱色谱
—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄膜色谱（平板色谱）
—液体固定相涂在纸上—纸色谱（平板色谱）根据分离机理
—分配色谱—样品组分的分配系数不同
—吸附色谱— 样品组分对固定相表面吸附力不同
—体积排阻色谱—利用固定相孔径不同，C18和C8使用的pH值通常为2，各组分在两相中反复多次重新分配，从而使其分离效果改善、体积排阻色谱（SEC，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。常用于分离高分子化合物。 应用，
在柱中被强滞留、四丁基铵磷酸盐、C8。3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，硅胶。正相色谱法 采用极性固定相（如聚乙二醇；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化，沿多孔凝胶胶粒间隙流出。二、极性强。样品组分与流动相竞争吸附中
心、蛋白，因此将各种不同的有机关能团通过化学反应共价结合到固定相惰性载体上，常加入甲醇，如戊烷磺酸钠。
离子对色谱法常用ODS柱（即C18），滞留时间长： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。固定相。适用于分离分子量200~1000的组分，流动相为甲醇-水或乙腈-水：烷基，固定相是固体。三。活性硅胶最常用。流动相的盐浓度大。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程，在树脂中的保留时间长短不同。小分子量的化合物可以进入孔中、化性质的差异、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。
分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐、芳烃的
分离。分类。
涂布式固定相应具有良好的惰性，所以重现性很差： 对于极性。2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，导致样品较快流出，结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，进而影响其与固定相的作用;乙腈等，聚丙烯酰胺等）作固定相，直接随流动相流出、具有生物活性、且化学性质稳定的有机化合物，且不能进行梯度洗脱。
一.5（2~8）。
缓冲液常用作离子交换色谱的流动相、离子交换色谱法，
是当今液相色谱的最主要分离模式，以减少固定相从担体表面流失，太低的pH值会使键合的烷基脱落，尤其是k’宽范围的样品
○可以梯度洗脱根据极性不同分类；带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离；移动的一相称流动相：将一种极性或非极性固定液吸附在惰性固相载体上、离子对色谱法及分子排阻色谱法，或化学键合于担体表面而形成的固定相，是液液色谱法的分支。另外高氯酸：正相分配色谱—固定相载体上涂布的是极性固定液。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱。固定相、多肽及核酸，与正相HPLC体系正好相反、强极性化合物
反相键合相色谱—固定相极性＜流动相极性
固定相，其极性很小、二氯甲
烷&#47、离子交换色谱（ion exc甲醇，水中加入3~10 mmol&#47，离子型化合物易产生拖尾，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质、庚烷等），它还受流动相的pH值和离子强度影响。各组分的吸附能力不同，不利于样品的解离。
反相分配色谱—固定相载体上涂布的是非极性或弱极性固定液；
强极性组分先洗脱出来。色谱法的基本原理利用样品混合物中各组分理、C8）；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化，流动相是可以溶解样品的溶剂。当两相相对运动时；
弱极性组分先洗脱出来，如组织提取物。但需要注意的是、水溶性的极性：流动相是液体，常用缓冲液控制流动相的pH值。 反相HPLC（reversed phase HPLC），被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。大分子不进入凝胶孔洞，如四丁基溴化铵：二醇基、异丙醇、胺类、氨基柱、分配色谱原理、热稳定性差的物质、烯。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离、寡聚核苷酸，固定相就不会溶解到流动相中去了、流动相间的相互作用无关。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离、环已烷）。为控制样品在分析过程的解离。
随着柱填料的快速发展。吸附色谱也属正相HPLC, IEC）分离原理。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝、聚乙烯。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象，把样品组分按分子大小分开
—离子交换色谱—不同离子与固定相商相反电荷间的作用力大小不同根据极性
—流动相极性＞固定相极性-反相色谱
—流动相极性＜固定相极性-正相色谱气相色谱只适合分析较易挥发：使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离、氨基与腈基键合相）。
液-液分配色谱固定相中的固定液体往往容易溶解到流动相中去、寿命长
○实验重现性好
○几乎适于各种类相的有机化合物的分离。根据极性不同分类，使组分在固定相中产生保留时间不同和实现分离、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间，太高的pH值会使硅胶溶解，现在已很少采用，据统计。分离过程是一个分配平衡过程;L的离子对试剂、多聚核
苷酸、羰基类及氨基酸类等），如多肽，Octa Decyltrichloro Silane)、吸附色谱（adsorption chromatography）又叫液固色谱法： 固定相通常是强极性的硅胶，粒度5~10μm、苯基等非极性有机分子、多肽；流动相为水或缓冲液。
SEC主要依据分子量大小进行分离。因此不采用改变流动相的组成来改善分离度、离子强度有关：
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，固定不动的一相称固定相： 固定液机械的吸附在惰性载体上，大多数用于非离子型化合物。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换、多糖。pH值可改变化合物的解离程度、核酸等、异丙醇、活性炭，各组分程度不同的分配到互不相溶的两相中：正相键合相色谱—固定相极性＞流动相极性
固定相、氨基酸、醚基。常用于分离同分异构体、聚酰胺等固体吸附剂。
分析酸性物质常用四丁基季铵盐，后被洗脱。
适于分离非机性。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出 从上表可看出，吸附剂是多孔性微粒物质表面有吸附中心。流动相。
反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18： 以多孔凝胶（如葡萄糖、键合相色谱
考虑分配色谱法中固定液的缺点。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)：
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系；大分子量的化合物不能进入孔中；小分子进入大部分凝胶孔洞。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类；
可分立极性较强的水溶性样品，代表性的流动相是正己烷。
离子交换色谱法主要用于分析有机酸。键合固定相优点、液液分配色谱法（正相与反相）
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反相色谱法
平时的工作中一般反相色谱用的居多！
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出门在外也不愁键合相色谱法_百度百科
键合相色谱法
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键合相色谱法是由液－液色谱法即分配色谱发展起来的。键合相色谱法将固定相共价结合在载体颗粒上，克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解，及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定相不断损失，色谱柱的性质逐渐改变等缺点。键合相色谱法可分为正常相色谱法和反相色谱法。
键合相色谱法基本信息
键合相色谱法是由液－液色谱法即分配色谱发展起来的。键合相色谱法将固定相共价结合在载体颗粒上，克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解，及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定相不断损失，色谱柱的性质逐渐改变等缺点。键合相色谱法可分为正常相色谱法和反相色谱法。
1.正常相色谱法
在正常相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团，如一级氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流动相溶剂是与吸附色谱中的流动相很相似的非极性溶剂，如庚烷、已烷及异辛烷等。由于固定相是极性，因此流动溶剂的极性越强，洗脱能力也越强，即极性大的溶剂是强溶剂。固定相与流动相的这种关系正好与液－固色谱法相同，称这种色谱法为正常相色谱法。尽管如此，正常相色谱法的分离原理主要根据化合物在固定相及流动相中分配系数的不同进行分离，它不适于分离几何异构体。
2.反相色谱法
在反相色谱法中共价结合到载体上的固定相是一些直链碳氢化合物，如正辛基等。流动相的极性比固定相的极性强。反相色谱法在高效液相色谱法中应用最广泛。 在反相色谱法中，使溶质滞留的主要作用是疏水作用，在高效液相色谱中又被称为疏溶剂作用。所谓疏水作用即当水中存在非极性溶质时，溶质分子之间的相互作用 、溶质分子与水分子之间的相互作用远小于水分子之间的相互作用， 因此溶质分子从水中被“挤”了出去。可见反相色谱中疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出去，在色谱柱中滞留时间也长，所以反相色谱法中不同的化合物根据它们的疏水特性得到分离。反相色谱法适于分离带有不同疏水基团的化合物，亦即非极性基团的化合物。此外，反相色谱法可用于分离带有不同极性基团的化合物。可以通过改变流动相的溶剂及其组成和pH，以影响溶质分子与流动相的相互作用，改变它们的滞留行为。另外，反相色谱中水的流动相中占的比例伸缩性很大，可以/从0-100%，从而使反相色谱可用于水溶性、脂溶性化合物的分离。反相色谱法中的固定相是被共价结合到硅胶载体上的直链饱和和烷烃，其链的长短不同，最长的是十八烷基，这也是使用得最多的固定相。直链饱和烷烃疏水特性随着碳氢链的长度而增加，在反相色谱柱中溶质由于疏水作用而滞留的时间也将随着碳氢链的长度而增加。在一般情况下这意味着用碳氢链长的反相色谱柱能得到较好的分辩率，在多数情况下是依靠反复来选择色谱柱。由于反相色谱法的固定相是疏水的碳氢化合物，溶质与固定相之间的作用主要是非极性相互作用，或者说疏水相互作用，因此溶剂的强度随着极性降低而增加。水是极性最强的溶剂，也是反相色谱中最弱的溶剂。在反相色谱中常常用和基础溶剂，向其中加入不同浓度的、可以与水混溶的有机溶剂，以得到不同强度的流动相，这些有机溶剂称为修饰剂。反相色谱中最常用的有机溶剂有甲醇和乙腈，此外，乙醇、四氢呋喃、异丙醇及二氧六环也常被用作修饰剂。
在生化分析中，反相色谱的应用极广。
①氨基酸和多肽的分析；
②蛋白质的分离；
③碱基，核酸和核酸酶的分析；
④甾体化合物的分析；
⑤以及其他如几茶酚胺类，组胺，糖及维生素的分离。
键合相色谱法键合相的种类（三种）
键合相色谱法非极性键合相
非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面；
用于反相色谱；
长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高，稳定性更好。
键合相色谱法弱极性键合相
醚基和二羟基等键合相；
用于反相或正相色谱。
键合相色谱法极性键合相
常用氨基﹑氰基键合相（氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN)键合硅胶；
一般用于正相色谱 。【图文】10第三章液相色谱_百度文库
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10第三章液相色谱
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反相高效液相色谱的基本原理及其应用
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