深海锰氧化细菌Brachybacterium sp. Mn32对Mn（Ⅱ）的氧化及生物锰氧化物对Zn（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）的吸附研究--《华中农业大学》2008年硕士论文
深海锰氧化细菌Brachybacterium sp. Mn32对Mn（Ⅱ）的氧化及生物锰氧化物对Zn（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）的吸附研究
【摘要】：
锰氧化微生物存在于土壤、淡水、污泥沉积物、海洋等环境。这些微生物能够将可溶的Mn~(2+)氧化为不溶的锰氧化物沉淀。同时,生物锰氧化物具有很强的重金属吸附能力。因此,锰氧化微生物在治理重金属污水中具有重要的应用价值。
海洋锰氧化细菌Brachybacterium sp.Mn32分离自太平洋深海底锰-钴结核区,革兰氏阳性。该菌具有高抗及快速氧化Mn~(2+)的特点。本课题研究了Mn32对Mn~(2+)的去除特点,并对其氧化机制进行了初步研究。本课题还对Mn32氧化生成的生物锰氧化物吸附重金属离子Zn~(2+)、Ni~(2+)的能力进行了研究,并与非生物锰氧化物(商品二氧化锰和化学合成的二氧化锰)进行了对比。
实验结果表明,海洋锰氧化细菌Mn32具有很强的锰氧化和去除能力。在5d内,Mn32能近100%去除150mL培养液中初始浓度为0.2mmol/L的Mn~(2+)。研究发现,Mn32对培养液中Mn~(2+)的去除包括两个方面,一方面是通过氧化酶的作用氧化Mn~(2+)生成锰氧化物沉淀,另一方面是通过Mn32产生的蛋白质及生物锰氧化物吸附Mn~(2+)。
本课题研究了Mn32生成的生物锰氧化物以及商品二氧化锰、化学合成的二氧化锰对重金属离子Zn~(2+)、Ni~(2+)的吸附能力。结果显示Mn32生成的生物锰氧化物对Zn~(2+)、Ni~(2+)的吸附摩尔比分别为0.206和0.132,商品二氧化锰对Zn~(2+)、Ni~(2+)的吸附摩尔比分别为0.059和0.06,化学合成二氧化锰对Zn~(2+)、Ni~(2+)的吸附摩尔比分别为0.064和0.063。生物锰氧化物的吸附能力是非生物锰氧化物吸附能力的2-3倍。
对生物锰氧化物、商品二氧化锰以及化学合成的二氧化锰进行扫描电镜观察,发现生物锰氧化物颗粒比商品二氧化锰以及化学合成的二氧化锰更规则,这是造成对重金属吸附能力差异的一个重要原因。本实验还对三种锰氧化物进行了X射线衍射分析,发现Mn32生成的生物锰氧化物与另外两种非生物锰氧化分属于不同的晶体类型,这也是生物锰氧化物重金属吸附能力强的一个重要原因。
该研究为重金属的微生物净化提供了有较大应用潜力的锰氧化菌,对其重金属吸附机制提供了科学依据。
【关键词】：
【学位授予单位】：华中农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2008【分类号】：X172【目录】：
Abstract7-9
1 前言9-25
1.1 自然界中的锰9
1.2 锰与人体健康9-11
1.3 锰污染与除锰技术11-13
1.4 微生物对锰的氧化作用13-20
1.4.1 微生物锰氧化的生物学作用14
1.4.2 细菌对锰的氧化14-18
1.4.3 真菌对锰的氧化18-20
1.5 生物锰氧化物与金属或类金属的反应20-23
1.6 研究目的与实验路线23-25
1.6.1 研究目的23
1.6.2 技术路线23-25
2 材料与方法25-32
2.1 实验材料25-26
2.1.1 实验菌种25
2.1.2 培养基及组分25
2.1.3 主要试剂25-26
2.1.4 主要仪器26
2.2 实验方法26-32
2.2.1 锰氧化细菌Mn32对几种重金属的抗性26-27
2.2.2 锰氧化细菌Mn32最佳生长pH值27
2.2.3 Mn~(2+)对Mn32生长的影响及Mn32生长曲线27
2.2.4 Mn32对Mn~(2+)的氧化去除27-28
2.2.5 锰氧化细菌Mn32氧化Mn~(2+)机制初探28-29
2.2.6 锰氧化细菌Mn32对Zn~(2+)、Ni~(2+)的吸附测定29
2.2.7 生物锰氧化物对Zn~(2+)、Ni~(2+)的吸附测定29-30
2.2.8 商品MnO_2对Zn~(2+)、Ni~(2+)的吸附测定30-31
2.2.9 化学合成MnO_2对Zn~(2+)、Ni~(2+)的吸附测定31
2.2.10 锰氧化物的扫描电镜观察31-32
2.2.11 锰氧化物的X射线晶体衍射分析32
3 结果与分析32-43
3.1 锰氧化细菌Mn32对几种重金属的抗性32
3.2 锰氧化细菌Mn32最佳生长pH值32-33
3.3 Mn~(2+)对Mn32生长的影响及Mn32生长曲线测定33-34
3.4 锰氧化细菌Mn32对Mn~(2+)的氧化去除34-36
3.5 锰氧化机制初探36-38
3.5.1 铜离子螯合剂对氧化的影响36
3.5.2 Mn~(2+)的诱导作用36-38
3.6 锰氧化细菌对Zn~(2+)、Ni~(2+)的吸附38-39
3.7 锰氧化物对Zn~(2+)、Ni~(2+)的吸附39-41
3.8 锰氧化物的电镜扫描41-42
3.9 锰氧化物的X射线晶体衍射分析42-43
4 讨论43-44
5 结论与展望44-46
参考文献46-55
硕士期间发表论文55-56
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王文明;[D];华中农业大学;2008年
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京公网安备75号桥联适配分子Mal在TLR4信号通路中的结构和功能研究--《南开大学》2013年博士论文
桥联适配分子Mal在TLR4信号通路中的结构和功能研究
【摘要】：Toll样受体(Toll-like receptors,简称TLRs)是一类在脊椎动物和无脊椎动物中广泛分布的模式识别受体,其在宿主抵御病原微生物入侵的自然免疫中发挥了重要作用。TLR通过其胞外结构域识别病原体相关的分子模式,引起自身二聚化激活,从而导致其胞内TIR(Toll/interleukin-1receptor)结构域重新排列组合以募集适配分子来起始细胞质中的信号传导,进而促进炎症因子和抑菌蛋白的表达,并进一步诱发获得性免疫反应。TLR起始信号复合物组装是通过相同类型和不同类型的TIR-TIR结构域之间特异性的相互作用实现的。
TIR结构域是一类α/p型球状蛋白,其二级结构元件之间通过变化各异的loop区连接。不同TLR信号通路的特异性依赖于受体募集不同的包含TIR结构域的适配分子。目前已经发现的包含TIR结构域的适配分子共有五个,分别为：MyD88, Mal,TRIF, TRAM和SARM。其中,Mal又被称为TIRAP,它是在TLRs识别病原体入侵而激活之后,协助TLR2和TLR4募集适配分子MyD88进行胞内信号传导的过程中起关键作用的桥联适配分子。细胞内TLR2／4信号传导起始的关键分子机制是TLR2/4,Mal和MyD88三者的TIR结构域的特异性的组装。然而,这些特异性的TIR-TIR相互作用的分子机制目前仍然还是个悬而未决的问题。
本论文解析了人源Mal的TIR结构域(简称Mal-TIR)2.40A分辨率的晶体结构。通过结构分析发现Mal-TIR的结构明显地区别于其他的TIR结构域,其含有结构上独特的AB loop,而缺少了仅B螺旋和BB loop这两个结构元件。通过进一步的基于结构的功能研究发现在Mal-TIR的结构表面有两个关键的功能区域：其中一个关键区域是Mal-TIR结构上特征性的AB loop区域,依据定点突变和体外直接相互作用实验证实了Mal-TIR通过AB loop与TLR4和MyD88二者的TIR结构域发生直接相互作用;另一关键区域是Mal的二聚体界面,本文通过生化和细胞的实验证实Mal-TIR以背靠背的方式协助Mal分子在执行功能时组装成轴对称性的二聚体。由此,本论文揭示了Mal在TLR4信号通路中行使桥联适配分子的生物学功能的分子机制——Mal分子自身形成背靠背的二聚体,并通过其两个分子的AB loop协助TLR4募集MyD88。
此外,有多项研究表明Mal的自然变异跟一些免疫性疾病有关。其中最受关注的是Mal的单核苷酸突变体S180L,因为S180L突变杂合子的携带者对菌血症,侵袭性肺炎球菌感染,疟疾和过敏性皮炎等传染性免疫疾病具有更强的抵抗力。另一个突变体D96N,有研究表明由于D96N突变影响了对适配分子MyD88的募集和自身的翻译后修饰而导致了Mal的功能缺陷。由此本论文解析了这两个突变体的晶体结构,分别为2.75A和3.10A,为Mal相关的传染性免疫疾病的分子机制研究提供了结构基础。
本论文结合x射线晶体学、生物化学和细胞生物学的研究方法,揭示了Mal在TLR4信号通路中执行适配分子功能的结构特征和分子机制,为进一步研究TIR结构域的特异性组装以及免疫性疾病相关的分子机制提供了结构基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：南开大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：R3416【目录】：
摘要5-7Abstract7-14第一章 引言14-34 第一节 Toll样受体14-20
1.1.1 模式识别理论和Toll样受体的发现14-16
1.1.2 Toll样受体及其配体识别16-20 第二节 Toll样受体在细胞内的信号传导20-25
1.2.1 Toll样受体的胞内适配分子20-22
1.2.2 MyD88依赖的信号通路22-24
1.2.3 TRIF依赖的信号通路24-25 第三节 桥联适配分子Mal的研究现状25-28
1.3.1 Mal在TLRs信号通路中的功能25-26
1.3.2 Mal和疾病的关系26
1.3.3 Mal在细胞内的调控和修饰26-28 第四节 TIR三维结构的研究现状28-30 第五节 本课题研究的综述30-34第二章 Mal的生物信息学分析34-40 第一节 Mal的一级结构分析34-37
2.1.1 Mal的序列同源结构34-35
2.1.2 种属间Mal的序列进化分析35-36
2.1.3 Mal的TIR结构域的序列同源分析36-37 第二节 Mal的二级结构预测37 第三节 Mal-TIR结构域的分析和预测37-39 第四节 Mal-TIR的结构域边界确定和生化性质分析39-40第三章 Mal-TIR的克隆、表达、纯化和结晶40-69 第一节 实验材料40-45
3.1.1 基因40
3.1.2 载体40
3.1.3 大肠杆菌菌株40-41
3.1.4 常用试剂、工具及耗材41-42
3.1.5 仪器及设备42-43
3.1.6 试剂和溶液43-45 第二节 实验方法45-60
3.2.1 cDNA文库制备45-47
3.2.2 质粒构建47-50
3.2.3 目的基因的定点突变PCR50-52
3.2.4 目的蛋白的可溶性表达试验52-53
3.2.5 目的蛋白的大量表达53-54
3.2.6 融合蛋白的大量纯化54-55
3.2.7 晶体生长55-60 第三节 Mal-TIR的分子克隆及表达纯化60-63
3.3.1 Mal-TIR的质粒构建60
3.3.2 Mal-TIR蛋白的大规模表达试验60
3.3.3 Mal-TIR的蛋白纯化60-63 第四节 Mal-TIR的晶体生长和优化63-69
3.4.1 Mal-TIR结晶条件的初步筛选63-64
3.4.2 mMal-TIR的晶体生长和优化64-66
3.4.3 hMal-TIR的晶体生长和优化66-67
3.4.4 hMal-TIR D96N和S180L突变体的晶体生长和优化67-69第四章 Mal-TIR的晶体结构解析69-106 第一节 生物大分子的X射线晶体衍射69-79
4.1.1 晶体的X射线衍射70-71
4.1.2 晶体的正常散射和反常散射71-72
4.1.3 晶体结构和衍射花样的关系72-73
4.1.4 晶体结构的相位问题及其解决方法73-79
4.1.5 X射线衍射法解析晶体结构的过程79 第二节 Mal-TIR的X射线衍射数据收集和处理79-86
4.2.1 X射线光源79-80
4.2.2 防冻剂选择和晶体衍射能力测试80-81
4.2.3 晶体衍射的初步分析81-83
4.2.4 hMal-TIR晶体衍射数据收集和处理83-86 第三节 hMal-TIR晶体衍射相位的确定86-92
4.3.1 用SHELX C程序分析和准备衍射数据86-88
4.3.2 用SHELX D程序计算Se原子的位置88-90
4.3.3 用SHELX E程序解析hMal-TIR的相位90-92 第四节 hMal-TIR结构的模型搭建和精修92-102
4.4.1 蛋白质模型的搭建和精修的基础92-95
4.4.2 hMal-TIR初始模型的搭建95-97
4.4.3 hMal-TIR结构的模型精修97-98
4.4.4 hMal-TIR模型的验证98-102 第五节 hMal-TIR突变体D96N和S180L的结构解析102-106
4.5.1 hMal-TIR突变体晶体的数据收集和处理102-104
4.5.2 hMal-TIR突变体的晶体结构解析104-106第五章 Mal-TIR的结构分析106-115 第一节 Mal-TIR的整体结构106-107 第二节 Mal-TIR分子在晶体中的堆积方式107-108 第三节 Mal-TIR的结构特征108-115
5.3.1 Mal-TIR的同源结构比较109-112
5.3.2 Mal-TIR的结构和功能的关系112-115第六章 Mal在TLR4信号通路中基于结构的功能研究115-142 第一节 实验材料115-118
6.1.1 基因和细胞115
6.1.2 载体115-116
6.1.3 试剂、耗材和仪器116-117
6.1.4 溶液配制117-118 第二节 实验方法118-124
6.2.1 细胞培养118-119
6.2.3 质粒构建119-120
6.2.4 蛋白表达和纯化120-121
6.2.5 NF-κB激活的双荧光素酶实验121-123
6.2.6 GST pull-down实验123
6.2.7 Western blot实验123-124 第三节 Mal-TIR结构表面的功能区域124-129
6.3.1 检测Mal-TIR上功能位点的实验设计124-127
6.3.2 Mal-TIR结构表面的功能区域127-129 第四节 Mal与MyD88和TLR4的相互作用129-132
6.4.1 Mal-TIR AB loop的重要作用129-130
6.4.2 Mal通过AB loop结合MyD88和TLR4130-132 第五节 Mal-TIR的二聚体界面分析132-136
6.5.1 Mal-TIR在生理状态下的二聚体界面132-135
6.5.2 比较Mal-TIR和其他TIR的二聚化方式135-136 第六节 Mal分子疾病相关的突变体136-138 第七节 研究结果讨论和课题展望138-142
6.7.1 结果讨论138-140
6.7.2 课题展望140-142第七章 X射线晶体学在其他研究课题的应用142-149 第一节 Elongator亚复合物Elp4-6的结构基础研究142-143 第二节 线虫Fidgetin-like 1的AAA结构域的结构基础研究143-145 第三节 两个长晶胞蛋白晶体的结构基础研究145-149第八章 结论149-150参考文献150-158致谢158-159个人简历159
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微生物诱导碳酸钙矿化及其在石质材料表面覆膜基础研究
【摘要】：微生物诱导CaCO_3矿化的关键在于微生物代谢过程中自然分泌出酶并不断发生特定酶化作用,产生某些重要的微量有机基质蛋白对矿化的控制作用是当前生物矿化机理及应用研究的一个重要方向。在国家“十一五”科技支撑计划项目(批准号:2007BAB08B01)的资助下,通过碳酸盐矿化菌种的筛选、培养,利用其酶化特性进行CaCO_3矿化试验,并在石质材料表面进行覆膜基础研究。运用现代分析测试技术对矿化膜的耐酸、耐热、粘接力、透气性等各项指标进行检测。为利用微生物技术在石质材料保护研究开展预研工作。研究结果如下:
(1)通过对巴斯德芽孢杆菌进行的培养特性的研究。结果表明,巴斯德芽孢杆菌最适培养基配方为甘露醇40g/L、大豆蛋白胨25g/L、氯化铵3g/L、氯化钠10g/L、pH为8.0;最适培养条件为温度30℃、摇床转速200r/min、接种量4.0%(V/V)、装瓶量75mL/250mL。培养24h,菌体浓度达到高峰。相同培养条件下,优化后的培养基活菌量分别是普通LB和牛肉膏蛋白胨培养基的1.71、1.55倍。
(2)通过对巴斯德芽孢杆菌诱导CaCO_3沉积试验,并对其机理进行分析。结果表明,沉积的CaCO_3颗粒呈分散状态,形貌呈球形、花瓣形和无规则块状体,粒径在1～15μm;晶型是方解石和球霰石混合晶型,含有少量有机物。菌体参与了CaCO_3晶体的形成。尿素酶是在巴斯德芽孢杆菌诱导碳酸钙沉积过程中最关键的要素。因为巴斯德芽孢杆菌在尿素的诱导下分泌尿素酶(主要为胞外酶),分解尿素,产生CO_32-,有Ca~(2+)存在的情况,形成碳酸钙晶体。
(3)通过对巴斯德芽孢杆菌诱CaCO_3晶体形成机理进行研究。结果表明:①通过SEM表征可知,纯水中形成的CaCO_3晶体表面形貌为方解石特征的多层重叠的块状斜六面体结构;而细菌液、细菌代谢物为CaCO_3结晶环境时,形成大小不一的球形或球状聚集体以及一定比例的规则斜六方体;细菌液浓度越高,对CaCO_3晶体形成的调控作用越明显;细菌体对晶体形貌几乎没有影响,形成致密多孔层状晶体结构。②通过XRD分析可以看出,菌体液制备的CaCO_3晶体则全为方解石;而细菌液和细菌代谢物诱导沉积的CaCO_3除了有稳定性最强的晶型方解石外,还出现亚稳态的球霰石晶型,③通过电导率的测定及红外分析,可知细菌液和细菌代谢物中有机物有机物极性基团与Ca~(2+)产生静电、配位等一系列相互作用,调控晶体的生长。
(4)通过对巴斯德芽孢杆菌诱导碳酸钙沉积培养基优化试验。结果表明,最适培养基配方为葡萄糖30 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、尿素50 g/L、硝酸钙浓度0.5mol/L、吐温80浓度0.05%(V/V)、氯化镍250μmol/L。通过SEM、IR及XRD对沉淀物分析,可知沉积碳酸钙形貌呈无规则块状体团聚体,表面粗糙,分布杂乱无章,粒径在20～100μm,晶型是方解石和球霰石混合晶型,菌体参与了CaCO_3晶体的形成。通过TG/DSC及Raman分析,可知沉淀CaCO_3含有少量的有机物。
(5)通过浸泡法和涂覆法在石质材料表面覆膜试验,并对矿化膜各项性能进行测试。结果表明,浸泡法效率较高,浸泡法和涂覆法均能在砂石和大理石表面生成一层粒径在1～10μm的细小碳酸钙颗粒,形成一层致密、50～100μm的CaCO_3矿化膜。浸泡法在试样表面形成的碳酸钙晶体为方解石和球霰石混合晶型,涂覆法仅形成方解石型。矿化膜与基层具有较强的粘结力,矿化膜的耐酸度小于2,能有效抵抗酸雨的腐蚀;具有良好的耐热、抗冻和耐光老化性能,能有效防范因天气变化造成的巨大温差对石质文物造成的气候性破坏,覆膜后能保持原有的透气性,抗渗性能得到显著提高。
通过对微生物仿生矿化保护材料基础应用特性的研究,检测表明它具有较好的表面防护效果和表层加固性能,并且制作工艺简便。这一成果对于发展新型石质保护材料具有重要的参考作用,同时对拓宽生物矿化材料研究的范围提供了一定的依据。
【关键词】：
【学位授予单位】：西南科技大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2011【分类号】：Q93【目录】：
摘要4-6Abstract6-111绪论11-17 1.1 研究意义11 1.2 国内外研究现状及发展趋势11-15
1.2.1 CaCO_3 生物矿化沉积机理12-13
1.2.2 微生物修复石质文物的应用13-14
1.2.3 发展趋势14-15 1.3 课题来源及主要研究内容15-17
1.3.1 课题来源15
1.3.2 研究内容15-16
1.3.3 创新点16
1.3.4 意义16-172 菌株筛选及生物学特性研究17-33 2.1 材料与方法17-21
2.1.1 试验材料17-18
2.1.2 试验方法18-21 2.2 结果与分析21-32
2.2.1 生理生化特征21-22
2.2.2 菌落、菌体形态22
2.2.3 酶化特性22-23
2.2.4 菌株培养特性23-32 2.3 本章小结32-333 微生物诱导CaCO_3 沉积及其机理研究33-48 3.1 材料和方法33-35
3.1.1 试验材料33
3.1.2 试验方法33-35 3.2 结果与分析35-46
3.2.1 微生物诱导CaCO_3 沉积35-36
3.2.2 微生物诱导CaCO_3 矿化机理分析36-40
3.2.3 微生物诱导CaCO_3 晶体形成机理分析40-46 3.3 本章小结46-484 微生物诱导CaCO_3 沉积培养基的优化48-57 4.1 材料与方法48-50
4.1.1 试验材料48
4.1.2 试验方法48-50 4.2 结果与分析50-55
4.2.1 碳源对CaCO_3 沉淀量的影响50
4.2.2 氮源对CaCO_3 沉淀量的影响50-51
4.2.3 正交试验结果与分析51-54
4.2.4 X 射线衍射(XRD)分析54-55 4.3 本章小结55-575 石质材料表面覆膜研究57-68 5.1 材料与方法57-60
5.1.1 试验材料57-58
5.1.2 试验方法58-60 5.2 结果与讨论60-67
5.2.1 浸泡试样SEM 及XRD 表征60-63
5.2.2 涂覆试样SEM 及XRD 表征63-65
5.2.3 矿化膜性能表征65-67 5.3 本章小结67-68结语68-70致谢70-71参考文献71-76攻读硕士学位期间发表的学术论文及研究成果76
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