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百草枯中毒诊断与治疗“泰山专家共识”
百草枯中毒诊断与治疗“泰山专家共识” 重症医学转载自医脉通
百草枯中毒是当前严重影响我国人民群众身体健康的中毒性疾病，目前尚无特效解毒药，具有很高的病死率。近年来关于百草枯中毒的基础与临床研究国内外已经取得了部分进展，但是对于中、重度百草枯中毒的救治仍然没有形成突破。山东大学齐鲁医院在百草枯中毒救治“齐鲁方案”( QiluScheme) 的基础上，深入研究最新临床证据，广泛征求国内知名专家的意见，参考专家组编写的全国统编教材《急诊医学》《预防医学》“百草枯中毒”有关章节及国家标准《职业性急性百草枯中毒的诊断》( GBZ246—2013) ，提出百草枯中毒诊断与治疗“泰山专家共识”( 简称“泰山共识”) 征求意见稿。～3日，第三届全国百草枯农药中毒学术会议在山东省济南市召开，百草枯中毒诊断与治疗“泰山专家共识”征求意见稿经修订后获大会通过。1 概念急性百草枯中毒(acute paraquat poisoning)是指短时间接触较大剂量或高浓度百草枯后出现的以急性肺损伤为主，伴有严重肝肾损伤的全身中毒性疾病，口服中毒患者多伴有消化道损伤，重症患者多死于呼吸衰竭或多脏器功能衰竭。20 世纪50 年代末，百草枯的除草作用首次被发现，1962年市场上开始出现百草枯产品。由于百草枯中毒没有特效解毒剂，所以病死率很高。口服自杀是我国百草枯中毒的主要原因。临床也有误食被百草枯污染的蔬菜导致中毒的病例，儿童百草枯中毒主要是将百草枯药液当做饮料误服所致，职业活动中的百草枯中毒主要是百草枯药液经皮肤黏膜接触吸收所致。2 毒理学特点及发病机制百草枯为联吡啶类化合物，分子式C12H14N2C12，大鼠经口LD50为100 mg /kg，尽管在毒理学分类上被列为中等毒性毒物，但由于具有很高的病死率，临床上应列为剧毒毒物。肺是百草枯中毒损伤的主要靶器官之一，它同时会造成严重的肝肾损害。百草枯中毒晚期则出现肺泡内和肺间质纤维化，称为“百草枯肺”，是急性呼吸窘迫综合征(ARDS) 的一种变异形式。百草枯在体内很少降解，常以原形随粪、尿排出，少量经乳汁排出。目前关于其机制的研究主要有以下几个方面:（1）百草枯对机体抗氧化防御系统的毒性作用，百草枯毒性的主要分子机制是对机体氧化-还原系统的破坏和细胞内的氧化应激反应。（2）百草枯引起的细胞因子变化，细胞因子在百草枯中毒大鼠急性肺损伤致肺纤维化中可能起关键的作用。（3） 百草枯引起的基因表达变化，基因表达改变可能会成为以后百草枯中毒肺损伤的研究方向之一。（4）百草枯肺损伤可能与联吡啶阳离子产生胞内钙超载有关。（5）内皮素可能与百草枯中毒导致的多器官功能衰竭有关，可作为评价多器官功能衰竭程度的临床指标之一。3 临床表现3.1 潜伏期根据接触途径和剂量不同，潜伏期可从数分钟到数天。口服量大者即刻出现恶心、呕吐症状。根据接触途径和剂量不同，潜伏期可从数分钟到数天。口服量大者即刻出现恶心、呕吐症状。3.2 呼吸系统肺为主要靶器官，呼吸系统损害的表现最为突出，主要有胸闷、气短、低氧血症、进行性呼吸困难，严重者1～3d内可迅速出现肺水肿及肺炎表现，可因ARDS、MODS致死。7d后存活患者其病情变化以进行性肺渗出性炎性病变和纤维化形成、呼吸衰竭为主，21d后肺纤维化进展减慢，但仍有不少患者3周后死于肺纤维化引起的呼吸衰竭。有些患者早期可无明显症状或仅有其他脏器损害表现，在数日后可迅速出现迟发性肺水肿及炎症表现，往往预后不良。3.3 消化系统损害胃肠道及肝胆为主要靶器官，主要表现为口咽部及食管灼伤，恶心、呕吐、腹痛，甚至出现呕血、便血，个别患者出现食管黏膜表层剥脱症。肝损害表现为转氨酶升高及黄疸等。3.4 泌尿系统损害肾脏为主要靶器官，肾功损害早于肺损害，中毒数小时后即可出现蛋白尿及血肌酐和尿素氮升高，严重者出现急性肾衰竭，但无尿者并不多见。3.5 免疫系统免疫器官可能为主要靶器官，突出表现为局部脏器及全身炎症反应。3.6 循环系统损害心脏为靶器官，主要表现胸闷、心悸，心电图可有T波及ST—T改变、心律失常等。3.7 神经系统损害多见于严重中毒患者，脑为靶器官，重症患者表现为意识障碍。3.8 血液系统损害骨髓为非靶器官，中毒早期即可出现白细胞及中性粒细胞增高。血小板减少可能与血液净化有关，个别病人可出现急性造血功能停滞。3.9 内分泌系统甲状腺可能为非靶器官，但部分患者出现甲状腺功能减退。3.10 运动系统骨骼及肌肉为非靶器官个别患者随诊出现远期股骨头坏死，可能与激素的使用有关。3.11 局部表现皮肤污染可引起接触性皮炎，甚至出现灼伤性损害，有不少经皮肤接触吸收后引起肺纤维化改变甚至致死的病例报告。眼污染百草枯后可出现刺激症状及结膜或角膜灼伤。4 辅助检查4.1 常规检查血常规检查可以出现白细胞计数增高，早期尿常规检查即可有尿蛋白阳性。肝脏丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、γ-谷丙酰基转肽酶可升高，总胆红素、直接胆红素和间接胆红素均可升高。肾损伤时血肌酐、尿素氮、胱抑素可明显升高，严重的低钾血症是百草枯中毒常见的电解质紊乱之一。动脉血气分析可有氧分压降低，二氧化碳分压也可降低或正常。4.2 毒物分析可行血液、尿液百草枯测定，注意样本要保存在塑料试管内，不可用玻璃试管。血液、尿液百草枯浓度测定可采用高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用方法定量测定。尿液百草枯也可采用碳酸氢钠-连二亚硫酸钠定性及半定量快速检测方法。根据我们实验室质控标准，血液百草枯浓度精确定量超过0.5μg/ml或尿液快速半定量检测百草枯浓度超过30μg/ml提示病情严重; 血液百草枯浓度精确定量超过1.0μg/ml或尿液快速半定量检测百草枯浓度超过100μg/ml提示预后不良。4.3 肺部影像学及肺功能检查肺HRCT 早期以渗出性病变为主，中晚期出现肺纤维化表现。重症患者可出现胸腔积液、纵隔及皮下气肿、气胸等。出现顽固性低氧血症及呼吸衰竭者提示预后不良。肺功能检查可作为患者治疗终结出院及随诊时评估指标，部分患者可留有限制性通气障碍及小气道病变表现。血D-二聚体升高可能与肺损伤相关，明显升高者往往提示肺损伤较重。4.4 心电图检查心电图可有T波及ST—T改变、心律失常等表现。5 诊断与鉴别诊断根据短期内接触较大剂量或高浓度的百草枯病史，出现以急性肺损伤为主，伴有严重肝肾损伤等多器官损害的临床表现，参考血液或尿液中百草枯含量的测定，经过综合分析，排除其他原因所致的类似疾病后即可诊断。职业性急性百草枯中毒的诊断参照《职业性急性百草枯中毒的诊断》( GBZ246—2013) 进行。非职业性百草枯中毒的诊断可参考GBZ246—2013 及何凤生院士推荐的百草枯中毒诊断分级方法。我们根据中毒病例临床特点及毒物分析结果，提出和推荐如下百草枯中毒诊断分级标准。轻度中毒: 除胃肠道症状外，可有急性轻度中毒性肾病( 见GBZ79—2013)，早期尿液快速半定量检测( 碳酸氢钠-连二亚硫酸钠法) 百草枯浓度＜10μg/ml。中度中毒: 在轻度中毒基础上，具备下列表现之一者: ( a) 急性化学性肺炎( 见GBZ73—2009)：( b) 急性中度中毒性肾病( 见GBZ79—2013) ; ( c) 急性轻度中毒性肝病( 见GBZ59—2010) 。早期尿液快速半定量检测百草枯浓度10～30μg/ml。重度中毒: 在中度中毒基础上，具备下列表现之一者: ( a) 急性化学性肺水肿( 见GBZ73—2009)：( b) 急性呼吸窘迫综合征( 见GBZ73—2009)：( c) 纵隔气肿、气胸( 见GBZ73—2009) 或皮下气肿：( d) 胸腔积液或弥漫性肺纤维化：( e) 急性重度中毒性肾病( 见GBZ79—2013)：( f) 多器官功能障碍综合征( 见GBZ77—2002)：( g) 急性中度或重度中毒性肝病( 见GBZ59—2010) 。早期尿液快速半定量检测百草枯浓度＞30μg/ml。其他影响因素包括服毒后是否立即进行催吐、服毒后至洗胃的时间间隔、服毒时是否空腹以及服毒后至正规治疗的时间间隔等，在诊断时也应该充分考虑。主要应与其他除草剂如乙草胺、草甘膦等中毒鉴别，应注意百草枯与其他除草剂混配中毒的可能。另外还应与其他原因引起的肺间质病变鉴别。6 治疗6.1 现场急救一般治疗接触量大者立即脱离现场。皮肤污染时立即用流动清水或肥皂水冲洗15 min，眼污染时立即用清水冲洗10min，口服者立即给予催吐和洗胃，然后采用“白+黑方案”进行全胃肠洗消治疗，“白”即思密达( 因漂白土无药准字号，以思密达替代) ，“黑”即活性炭。具体方法: 思密达30g 溶于20％甘露醇250ml，分次服用，活性炭30g( 粉剂) 溶于20％甘露醇250ml，分次服用。首次剂量2h内服完，第2天及以后分次服完即可。第3、4天甘露醇剂量减半，可加适量矿泉水稀释。在没有上述药品的情况下，中毒早期现场给与适量泥浆水口服有助于改善预后。6.2 早期的胃肠营养及消化道损伤的处理口咽部及食管损伤往往在中毒2～3d后出现，早期以流质饮食为主，除非患者有口咽部、食管严重损伤及消化道出血，否则不建议禁食。口腔真菌感染多发生在治疗1周后，一旦发生可给予抗真菌药物如制霉菌素局部治疗。6.3 积极开展早期血液灌流血液灌流是清除血液中百草枯的有效治疗手段。早期血液灌流可以迅速清除毒物，宜在洗胃后马上进行，6h 内完成效果较好，超过上述时限血液灌流仍可有效清除毒物。但是，由于百草枯经胃肠道吸收快，且迅速分布到身体各组织器官，血液净化较难减轻体内各器官的百草枯负荷量，毒物检测结果对血液灌流治疗具有指导意义。目前尚无令人信服的临床证据证明持续血液净化及反复血浆置换有益。6.4 糖皮质激素糖皮质激素是治疗百草枯中毒的主要治疗药物，早期足量糖皮质激素治疗首选甲泼尼龙，重症患者可给予甲泼尼龙每日500～1000mg冲击治疗，连用3～5d后，根据病情逐渐减量。6.5 抗凝及抗氧化治疗百草枯中毒可伴有肺部微循环障碍，血浆D-二聚体升高，因此积极给予抗凝治疗有助于改善病情。可给予低分子肝素5000U，皮下注射，每日1次。有出血倾向者暂缓使用。还原型谷胱甘肽可有效对抗百草枯的过氧化损伤，剂量2.4g，静脉滴注，每日1次。6.6 控制中毒性肺水肿中毒性肺水肿和重症中毒性肺炎是百草枯中毒的主要死亡原因，肺纤维化是晚期死亡的主要原因。因此，积极控制中毒性肺水肿、治疗重症中毒性肺炎是抢救成功的关键之一。糖皮质激素及抗氧化剂是治疗中毒性肺水肿和中毒性肺炎的主要措施。6.7 防治晚期肺纤维化，合理使用环磷酰胺传统的加勒比方案包括环磷酰胺、地塞米松、呋塞米、维生素B 和维生素C，但是鉴于百草枯中毒可以引起严重的肝肾损害，而环磷酰胺作为一种烷化剂具有明显的肝肾毒性，重症患者并没有因为早期使用环磷酰胺而受益。目前对于百草枯中毒，特别是重度中毒是否使用环磷酰胺及何时使用尚存在不同意见。我们认为肝肾功能恢复( 一般2周) 后，如果仍有肺损伤，可以使用环磷酰胺800mg，加入生理盐水中静脉滴注1次，1个月后根据肺CT 情况决定是否重复使用。6.8 合理氧疗及机械通气治疗百草枯中毒吸氧可促进氧自由基形成，加重百草枯引起的肺损伤，原则上不予吸氧。但对于血气分析氧分压＜40mmHg 或血氧饱和度＜70％ 的呼吸衰竭患者，应该积极给与吸氧，可采用鼻导管、面罩等给氧方式。吸氧不能改善症状时可考虑机械通气治疗，包括无创通气及有创通气辅助呼吸。临床上需要机械通气治疗的患者多预后不良。6.9 治疗肝肾损害及黄疸积极给予保肝、利胆治疗，重视胆汁淤积性黄疸治疗; 积极给予保护肾功能治疗，给予输液、利尿改善循环等综合治疗。6.10 纠正电解质紊乱，维持酸碱平衡百草枯中毒往往出现严重的低钾血症，应积极给予补钾治疗，可采用口服与静脉滴注相结合的方式。对于其他电解质紊乱及酸碱平衡失调也应积极对症处理。6.11 中医药及其他治疗临床实践证实，中医中药在治疗百草枯中毒中具有独特的疗效，丹参制剂、虫草制剂及血必净注射液合理使用有助于病情的恢复。有关肺移植治疗百草枯中毒致肺纤维化，迄今为止国外仅有1 例成功的病例报道，其余均失败。目前国内外没有更多的体外膜式氧合( ECMO) 救治百草枯中毒的成功经验。6.12 重视远期随诊评估，达到临床治愈所有患者均需要较长期的随诊，动态观察病情变化。7 呼吁只有全面禁止或严格限制百草枯的生产和使用，才能从根本上遏制百草枯中毒的发生。事实上，百草枯中毒不仅仅是一个单纯的医学问题，更是一个带来严重影响的社会问题， 有鉴于此，我们专家组共同呼吁: 关爱生命，禁止生产和使用百草枯!共识来源：中国工业医学杂志,）:117-119
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银杏叶提取物对百草枯致PC12细胞损伤的保护作用及机制
发布时间： 来源：安徽省医学协会信息中心
作者：康小刚，陈建宗，王百忍，徐震，李海龙，奚淑芳&&& 【关键词】& 银杏叶提取物&&& Neuroprotective effects of ginkgo biloba extract against paraquatinduced PC12 cell line damage and its mechanism　　【Abstract】 AIM: To study the neuroprotective effect and related mechanisms of ginkgo biloba extract (EGB761) against paraquat(PQ) induced apoptosis in pheochromocytoma (PC12) cells. METHODS:& Using PQinduced PC12 cells damage as the model of Parkinsons disease in vitro, the cytotoxicity of PQ was measured by 3［4, 5dimethylthiazol2yl］2, 5diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, the impairment of PC12 cells was detected by lactate dehydrogenase (LDH) assay, the apoptosis of PC12 cells was detected by flow cytometry and the morphological change of PC12 cells was observed by caspase3 immunocytochemical staining. RESULTS:& 40 mg/L EGB761 played a protective role in the damage induced by 300 μmol/L PQ for 24 h. EGB761 significantly inhibited LDH release induced by PQ in PC12 cells （0.25±0.01）(P&0.05 vs PQ group). EGB761 decreased the rate of apoptosis to 17.1% and the overexpression of caspase3 induced by PQ in PC12 cells. CONCLUSION:& EGB761 can protect cells from the necrosis and apoptosis induced by PQ, which may be related to the inhibition of caspase3 protease activation.　　【Keywords】 g PC12 neuroprotection　　【摘要】 目的： 探讨百草枯(PQ)对PC12细胞的损伤作用，观测银杏叶提取物（EGB761）对该损伤的保护作用并探讨其作用机制. 方法： MTT比色试验检测细胞活性；乳酸脱氢酶(LDH)测定细胞损伤程度；流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡；caspase3免疫细胞化学染色观察细胞凋亡. 结果： 40 mg/L EGB761对300 μmol/L PQ作用于PC12细胞24 h，具有一定的保护作用；EGB761可明显抑制PQ诱导的PC12细胞LDH的释放（0.25±0.01）(与PQ组比较，P＜0.05)；EGB761可降低PC12细胞的凋亡百分率，PQ组凋亡百分率为66.7%，使用EGB761保护后凋亡百分率降为17.1%；并可减少PQ诱导的PC12细胞caspase3过度表达. 结论： EGB761可减轻PQ诱导的PC12细胞损伤和凋亡，该作用可能与抑制caspase3蛋白酶的激活有关.　　【关键词】银杏叶提取物；PC12细胞；百草枯；细胞凋亡；神经保护　　0引言　　流行病学资料显示，环境因素如除草剂、杀虫剂等与帕金森病的发生有关［1］. 二氢吡啶类除草剂百草枯（1，1′二甲基4，4′联吡啶，Paraquat, PQ）是一种常用农药，其结构与神经毒素MPTP的活性代谢产物MPP+极其相似，也具有与MPP+相类似的神经毒性［2］. 我们拟用其作
为建立帕金森病体外模型的工具药物，研究银杏叶提取物（ginkgo biloba extract, EGB761）对PQ诱导的PC12细胞毒性损伤的保护作用及可能的作用机制.　　1材料和方法　　1.1材料　　EGB761（银杏叶提取物注射液，商品名金纳多，每支17.5 g/5L，批号： 2210903）为德国威玛舒培博士药厂产品；PQ、胰蛋白酶、4甲基偶氮唑蓝（MTT）, Annexin VFITC, PI为Sigma公司产品；DMEM培养液、胎牛血清、马血清为Gibco公司产品；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；兔抗鼠Caspase3抗体为北京中山公司产品. 倒置相差显微镜： 德国LEICA公司；CO2孵箱： SANYO公司；酶联免疫检测仪： DYNATECH公司；流式细胞仪：美国BECKMANCOULER公司.　　1.2方法　　1.2.1PC12细胞的培养PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株，购于日本.& 培养于100 mL/L马血清、50 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃, 50 mL/L CO2条件下培养，每2～3 d 换液1次. 细胞80%融合时，用1.25 g/L胰酶消化，1∶3分瓶传代. 选取对数生长期细胞进行实验处理.　　1.2.2药物处理根据MTT比色试验筛选的PQ浓度及作用时间和EGB761保护浓度，实验分正常对照组、损伤组、保护组. 正常对照组不加药，损伤组只加PQ，保护组加入EGB761 2 h后再加PQ，各组均在加药24 h后进行检测.　　1.2.3MTT比色法检测细胞活性细胞以2×107/L接种于96孔板，设0, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 μmol/L PQ组，每组设4个复孔. 筛选出实验处理浓度. 以所选PQ浓度为终浓度处理细胞，设正常对照组及4, 8, 12, 24, 48, 72 h损伤组，每组设4个复孔. 筛选出损伤作用时间. 继之进行以下实验. 设正常对照组，损伤组及1, 10, 20, 40, 60, 80, 100 mg/L EGB761保护组，保护组在加入EGB761 2 h后再加PQ，每组设4个复孔. 终止培养前4 h每孔加入MTT溶液20 μL，置37℃继续培养4 h. 弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min使蓝色结晶充分溶解，上酶标仪以波长560 nm检测每孔吸光度值（A值）.&　　1.2.4LDH释放的测定LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2，4二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力. 药物处理后，每样品收集培养上清20 μL，加入基质缓冲液250 μL、辅酶I 50 μL，混匀，37℃水浴15 min；再加入2，4二硝基苯肼250 μL，混匀，37℃水浴15 min；加入0.4 mol/L& NaOH 2.5 mL，混匀，室温放置3 min，上酶标仪以波长440 nm检测每孔A值.　　1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡药物处理后，用1.25 g/L胰蛋白酶0.4 g/L EDTA（1∶1）消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×108个/L. 取1 mL细胞，1000 r/min 4℃离心10 min，弃上清液. 加入1 mL冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000 r/min 4℃离心10 min，弃上清液. 将细胞重悬浮于200 μL结合缓冲液，加入10 μL& Annexin VFITC和5 μL PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min. 加入300 μL结合缓冲液，立即上机检测.　　1.2.6Caspase3免疫细胞化学染色细胞爬片，药物处理后，以0.01 mol/L& PBS（pH 7.4）漂洗细胞3 min×2次；40 mL/L多聚甲醛固定15 0.01 mol/L& PBS冲洗5 min×3次；用30 mL/L H2O2处理15 min以阻断内源性过氧化氢酶；50 mL/L正常羊血清封闭20 min；加入1∶100稀释的兔抗鼠Caspase3抗体，4℃过夜；PBS冲洗5 min×3次；加入生物素化IgG抗体，室温孵育30 min；PBS清洗5 min×3次；滴加1∶500稀释的SABC复合物，孵育30 min；PBS清洗5 min×3次；避光条件下，用DAB显色液反应10～20 min；蒸馏水洗1 min×2次；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片.　　统计学处理： 实验数据以x±s表示，统计分析采用SPSS10.0统计软件进行方差分析和LSDt检验,P&lt
;0.05认为差异有显著性.2结果　　2.1EGB761拮抗PQ对PC12细胞的毒性作用　　2.1.1PQ的浓度和作用时间与PC12细胞的损害程度相关如图1A所示，PQ的浓度为50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 μmol/L孵育细胞24 h，随着浓度增加，细胞生存率逐渐下降，其中300, 400, 500, 600 μmol/L剂量组与对照组相比（对照组设为1）分别降至75.5%, 69.6%, 60.7%, 52.3%, 43.9, 25%, 17% (P&0.05). 说明PQ对PC12细胞的损伤具有浓度依赖性，浓度越大，对细胞的毒性越强. 选取PQ 300 μmol/L分别以4, 8, 12, 24, 48, 72& h作用于PC12细胞，细胞生存率与对照组相比依次为85%, 79.1%, 72.8%, 54%, 35.9%, 16.5%). 其中24, 48, 72 h与对照组相比有显著性差异（P&0.05，图1B). 说明PQ对PC12细胞的损伤也与时间有关，时间越长，损伤越大. 据此，将PQ 300 μmol/L（细胞生存率52.3%）作用24 h（细胞生存率54%）作为以下实验的干预点.　　2.1.2EGB761对PQ诱导的PC12细胞损伤可起到保护作用不同浓度的EGB761对PQ的损伤都有保护作用，并使PC12细胞活性呈剂量依赖性的增强(图1C). 根据实验结果选取EGB761 40 mg/L为进一步实验的药物浓度.　　2.2EGB761可抑制PQ所引起的PC12细胞损伤对照组未加任何处理因素，LDH的释放量为0.244±0.011; 300 μmol/L PQ作用PC12细胞24 h后，LDH释放量明显增多（0.27±0.02）（与正常对照组比较，P＜0.05），使用40 mg/L EGB761后可明显抑制PQ所致LDH释放量的升高（0.25±0.01）(n=5，与PQ组比较，P&0.05).　　2.3EGB761抑制PQ诱导的PC12细胞的凋亡Annexin V和PI双标，FCM检测，可区分出凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞，准确得出细胞凋亡百分率. 正常对照组、损伤组、保护组细胞分别为6.3%, 66.7%, 17.1%. 损伤组细胞凋亡百分率明显升高，使用EGB761后，凋亡百分率明显降低（图2）. 　　2.4EGB761对PQ诱导PC12细胞表达Caspase3的影响Caspase3染色阳性反应产物呈棕黄色，均匀分布于PC12细胞胞质及突起内，着色深浅代表caspase3表达强弱. PQ作用24 h后，PC12细胞的caspase3表达明显增强，染色细胞呈深棕黄色，阳性染色分布于胞质和突起中，着色细胞数目多，细胞形态改变，突起变短（图3B）；使用EGB761后，细胞着色较浅，细胞形态结构较好（图3C）.　　3讨论　　大量实验证实EGB761对多种损伤引起的神经损害具有保护作用，其在治疗神经变性性疾病方面的良好作用日益引起人们的兴趣［3］. PC12细胞是来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞系，与黑质DA能神经元有许多相同的特征，被广泛用作研究黑质DA能神经元的细胞模型. 我们采用MTT比色试验，其原理为活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTT还原为蓝紫色的结晶，结晶的产量与活细胞数成正相关. 通过测定其A值来反映细胞代谢活性的强弱，表明细胞存活率降低，PQ的剂量越大，作用时间越长，A值降低越多.& 而用EGB761进行干预后，A值有所升高，亦即细胞存活较之单纯PQ作用组增多. 进一步检测LDH释放量，单纯PQ损伤后LDH释放量升高，EGB761保护组则降低，证实损伤有所减轻. FCM可比较精确的反映细胞凋亡，利用Annexin V和PI双标，区分正常活细胞、凋亡细胞和死亡细胞，可获得细胞凋亡百分率，是目前较为理想的凋亡定量检测方法. 我们利用FCM得出，PQ损伤后，细胞凋亡百分率远远高于正常对照组，EGB761保护组凋亡百分率则与对照组接近. 以上实验均表明EGB761对PQ诱导的PC12细胞损伤和凋亡具有明显的保护作用.　　在很多种哺乳动物细胞类型中，Caspase3在通过不同途径触发细胞凋亡的过程中扮演着非常重要的角色，它的激活在细胞凋亡中起着关键的作用［4］. 本实验通过免疫细胞化学染色，对PQ及EGB761干预的PC12细胞进行观测. 发现PQ作用后，Caspase3的表达增强，细胞染色较正常对照组深，着色细胞多，细胞形态改变. 使用EGB761后Caspase3的表达减弱. 上述结果表明，EGB761对PQ诱导的细胞损伤具有一定的保护作用，其作用机制
可能是使Caspase3激活减弱，表达减少，从而减少蛋白质分解和DNA断裂，减少细胞凋亡的发生.　　【参考文献】　　［1］ Wesseling C, Van B, Ruepert C. Paraquat in developing countries ［J］. Int J Occup Environ Health, -286.　　［2］ Brooks CA, Chadwick HA.Gelbard. Paraquat elicited neurobehavioral syndrome caused by dopaminergic neuron loss ［J］. Brain Res, -10.　　［3］ Christen Y. The effects of Ginkgo biloba extract (EGb 761) on neurodegenerative processes ［A］//Christen Y.Ginkgo biloba Extract (EGb 761) as a Neuroprotective Agent: From Basic Studies to Clinical Trials ［M］. Advances in Ginkgo Biloba Extract Research. .　　［4］ Strasser A, OConnor L, Dixit VM. Apoptosis signaling ［J］. Annu Rev Biochem, -245
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●必选○可选
●病人初步评估
生命体征(T、BP、R、P)等
●询问病史
排除合并/其它毒物中毒;
确认中毒病史(参见我院提供病史确认谈话单),包括:原因、触毒时间、进毒量、有无呕吐、入院前洗胃时间和洗胃量
●病情告知谈话和治疗选择
病情特点、治疗方案选择、预后和费用(综合知情谈话书)
●首次辅助检查
●血常规●电解质●血糖
●肾功能●凝血谱●血气分析
●肝功能●心肌酶谱
○胆碱酯酶○ HbCO
肝功能可后期完善
○联系血液灌流
仅针对有条件医院
●急诊洗胃(适应症:口服中毒者)
种类:首选2%NaHCO3,NS或清水
剂量:至少5L,至洗胃液无色无味
留置胃液标本,毒物鉴定准备
○ 15%漂白土混悬液300ml tid
○蒙脱石散剂 10包qd或酌情增减
○活性炭100g qd 或酌情增减
可三选一、但必须选一种
○ 20%甘露醇250ml
○ 50%硫酸镁60g
○生大黄20g~30g/日
12h内排出绿色大便,1~2次/d
可三选一、但必须选一种或联合采用
●激素治疗(病人不存在激素治疗的常见禁忌)
甲强龙80mg q6h×7d;减为q8h×7d然后逐日减量。A
也可试用大剂量,甲强龙 1g/d 用3dB, 然后逐日减量。
见综合知情谈话书
甲强龙剂量供参考,可据病人实际情况调整。
○免疫抑制剂
备选,见综合知情谈话书
环磷酰***0.3-0.6 iv gtt qd×7dB
○血液灌流
前3d根据情况q12 h,
之后q 12 h ~ qd,疗程据临床而定。
○透析和CRRT
( 抗氧化剂和抗纤维化药物)
VitC 5-10 g/d
心得安 10mg po tid
甘露醇250ml 1-2次/d ivgtt
还原型谷胱甘肽1.8g-2.4g/qd
N-乙酰半胱氨酸 8 g/d
○ VitE 0.1 po tid
○乌司他丁
●补液和利尿
氧疗和呼吸支持
无明显缺氧时禁止吸氧
出现明显缺氧时予低流量吸氧,吸氧无法改善出现呼吸衰竭或ARDS时行机械通气。
无明显缺氧时禁忌
●脏器功能监测
定期检测肝、肾、心、肺功能
定期胸部X片/CT评估
○毒物监测
有条件连续监测血、尿毒物浓度
A . 甲强龙剂量根据石汉文教授在2008年北京协和急诊医学国际高峰论坛上的报告。
B. 主要参考文献:①石汉文教授在2008年北京协和急诊医学国际高峰论坛上的报告。
②王文生,卢清龙等,综合救治百草枯中毒60例临床分析,中国急救医学 ):515-517。
③王文生,马增香等,大剂量甲泼尼龙联用环磷酰***改善百草枯中毒患者肺组织损伤的临床研究,中华急诊医学杂志 ):757-759。
④ Lin JL,Lin-Tan DT,Chen KH.Repeated pulse of methylprednisolone and cyclophosphamide with continuous dexamethasone therapy for patients with severe paraquat poisoning. Critical Care Medicine,2006(02).
百草枯中毒病史确认和知情同意书
患者姓名: 性别: 年龄: 床号: 住院号:
一、病史确认
由于百草枯的毒性极强,致死剂量小,病情进展迅速,目前尚缺乏特效解毒药,死亡率很高。确切了解患者的中毒情况对于病情的判断和进一步的救治非常重要,错误的信息直接影响后续的救治。我们已仔细向患方确认以下情况无误。
□口服□接触□吸入
服毒后是否呕吐
入院距离中毒时间
外院就诊情况
□无□有(填以下内容)
中毒至洗胃时间
血液净化情况
特殊用药及剂量
注:若表格中情况家属不了解或患者无法提供请填写“不明”。
二、病情告知
百草枯毒性极强,中毒后病情进展迅速,目前尚缺乏特效解毒药,是国际性的医学难题。人口服致死剂量为 30~50mg/kg,可经胃肠道、皮肤和呼吸道吸收,对皮肤、肝脏、肺脏、肾脏等全身多个器官均有不同程度的损伤,尤其以肺受损最为严重,最终导致多器官功能衰竭而死亡。百草枯中毒后的常见临床症状如下:
消化系统:经口中毒者出现口腔、消化道黏膜糜烂溃疡,严重时伴发消化道穿孔、大出血或中毒性肝病、肝功能衰竭。
中枢神经系统:可表现为头晕、头痛、肌肉痉挛、抽搐、幻觉、恐惧、昏迷等。
心脏:可见心肌炎、心包出血、各种心律失常、心肌缺血、心力衰竭等。
肾脏:血尿、蛋白尿,严重者并发急性肾功能衰竭。
肺脏:由于肺部细胞对其有主动摄取和蓄积作用,使得肺受损最为严重,常导致肺间质水肿及肺纤维化,后期并发ARDS等严重情况。肺部病变出现越早、范围越大、预后越差。肺纤维化多在中毒后 5~9天发生, 2~3周达高峰。也有慢性及轻度中毒者,早期呼吸道症状不典型,但 1~2周内出现肺部症状,最终因肺纤维化、呼吸衰竭而死亡。也可在中毒 3周后死于肺功能衰竭。
皮肤、黏膜:接触部位出现皮肤烧伤,如红斑、水疱、溃疡等,经皮肤中毒吸收量大可造成全身性中毒损害。若眼结膜、角膜接触百草枯后,可引起严重炎症反应,继发虹膜炎、形成溃疡、穿孔等,影响视力。另可有鼻、喉损伤。
其它临床症状: 如发热、贫血、血小板减少和高铁血红蛋白血症等。
百草枯中毒一般需要入住重症监护病房严密监测治疗,期间可能发生心脏骤停,并发全身感染、脓毒症等,发生其它意外情况;而且要使用多种有创治疗手段(气管插管、呼吸机支持、血液净化),以及多种贵重药物,治疗费用高且治疗周期长,但仍有很高的不良预后率,包括大部分最终死亡、少部分长期需要生命支持设备维持和后遗肺功能障碍等。
三、治疗选择
百草枯中毒的治疗包括常规性措施,如洗胃、毒物吸附、导泻、补液利尿、抗氧化剂和抗纤维化药物选择性使用等。另外还有一些特殊和供选择的治疗方案,均已有资料提示有一定的效果,但存在下述问题:1)部分属有创性操作而有风险;2)治疗费用较高;3)使用后可能出现严重不良反应;4)有限的资料表明对某些患者可能有效,尚未广泛临床推广,使用后可能也会出现不良反应。包括以下内容:
洗胃:属于百草枯中毒常规的抢救措施,一般要求24小时内应尽可能早地洗胃,放弃洗胃将导致毒物大量
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