小木虫 --- 500万硕博科研人员喜爱的学术科研平台
&&查看话题
PCR的结果只有引物二聚体出来，目的片段没有。换过很多条件。求大神指导
做的是金银花ITS2序列
体系 总25ul
mix 12.5ul
双蒸水 7.5ul
模板& & 3ul
下面是两个引物的条带。不过可能图倒了
一般不是做30个循环么？？？
谢大神。今年放假，现在已经不做了。等来年去学校再试
是这样。我的目的片段大概是300bp。出来的是50bp左右。可能是引物二聚体或者非特异性扩增。我刚接触这一块，还有很多东西要学。多谢，多谢。
多谢指点。我想可能也有这方面的问题。等来年我回学校再试试
其实有很多方面我确实不确定。我们目的片段查了文献232bp。反应条件老师给的，没出来结果才想的优化。另，实验室条件不太好，梯度pcr只能一遍一遍的做(ಥ_ಥ)。我还有很多方面要学，最后，多谢给我建议。
鎬讳箣銆傚璋㈠缓璁紝鎴戜細濂藉ソ鍔犳补鐨
闄嶈繃浜嗭紝娌℃湁浠涔堢敤锛屽彲鑳戒篃鏈夊叾浠栨柟闈㈤棶棰樸傛垜鍐嶇湅鐪
乱码了。。=_=。因为放假的原因，我实验要到明年再开始，多谢指点
闄嶆俯璇曡繃涓鐐广備笉杩囨垜杩樺緱閲嶆柊寮濮嬭瘯
我不确定哪个是一般，条件的话我再看看，需要跟老师商量一下，明年再继续
研究生必备与500万研究生在线互动！
扫描下载送金币下载丁香园 App
关注今日：42 | 主题：270519
每发1个新帖可以获得0.5个丁当奖励
【求助】如何去除引物二聚体，急！
楼层直达：
这个帖子发布于4年零238天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好，我第一次设计了引物，前几天引物刚合成回来，很是激动，因为不知道自己设计的怎么样。这几天刚做了实验验证了一下，结果令人失望，因为我做了两个平行的EP管，其中一管电泳的结果是有目的条带但很浅很浅（如下图黑框中所圈中的），（我上样加的是5ul ），在maker的最前面即100bp的位置有很亮的条带，应该是引物二聚体我的一个老师一看电泳结果，说可能得重新设计引物，说实话，我一听这个心里就很难受了，因为我当初设计时真的很认真，我用的是primer5.0设计的引物，设计完后，就有一项令人不满，即Cross dimer那的△G=-7.7，Tm均是53度多点，上下相差0.6度，GC%一个是55.6%，另一个是52.6%。评分也均是100（我没有刻意追求评分）。若老师让我重新设计引物，我真是找不到更好的了，因为大家都知道，设计引物时很难找到那种一点瑕疵都没有的（即在primer5.0下边一个都不”红“的）引物。以前我们用过两对引物（是我们没来科室前老师设计的），这两对引物也均有cross dimer ,而且其中有一对的△G的绝对值比7.7还高，扩增的效果也不错，最后经过摸索条件还有引物二聚体，但是目的条带很亮。所以我就是想说，我设计的这对引物是不是没有什么问题，是不是经过摸索条件把引物二聚体去掉或减少呢？对了，我们做得是RT-PCR,用的是一步法，但设程序时有逆转录和PCR扩增两个部分，我所用的引物0.5ul （100ulM),体系是28ul 。我的引物浓度是不是过大(我们以前扩增成功的55.5ul体系中用的引物也是1ul，100ulM）？一个PCR体系中引物的浓度该如何确定呢？我除了从引物浓度方面考虑，还应从哪几方面考虑？该如何调整才能有效去除引物二聚体增亮目的条带呢？我的老师的建议是分两步走，即在原来体系的基础上什么都不变，只是在程序上只进行到反转录这一步，然后就电泳，看是否有目的产物,若有目的产物再做梯度PCR摸索退火温度。.我不知道为何这样做？这样就不会形成引物二聚体了吗？原来一步法的体系只做反转录那一步合适吗？我是一个新手，我真的不太懂这方面的知识，也正在学习中，希望各位专家帮帮忙！谢谢！如果有什么看不懂的咱们可在QQ上交流（单纯为了学习，非诚勿扰），我很诚恳的向各位专家请教！
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
说实话，你这个引物已经很不错了，我设计过好多引物，估计没有过这么好的，另外看看国外文章里给的引物，更烂。一步法没用过，好久以前看过好像一步法和二步法各有优点吧，不过具体我现在想不起来了，你还是试试二部法吧，可以适当调高一下退火温度，凭你这个引物，摸到合适条件应该能做出来。还有引物长度20.21好点吧，引物长点好配对，引物3’端比较重要，尽量按要求严格点
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
liangxiaolei 说实话，你这个引物已经很不错了，我设计过好多引物，估计没有过这么好的，另外看看国外文章里给的引物，更烂。一步法没用过，好久以前看过好像一步法和二步法各有优点吧，不过具体我现在想不起来了，你还是试试二部法吧，可以适当调高一下退火温度，凭你这个引物，摸到合适条件应该能做出来。还有引物长度20.21好点吧，引物长点好配对，引物3’端比较重要，尽量按要求严格点退火温度，一般要比给定的退火温度高吗？我PCR的时候，发现温度越高，引物二聚体越多呢？怎么一般筛选合适的退火温度的时候，考虑多大的范围呢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
建议换成2步发吧，然后能做个梯度PCR最好，温度从tm值上下5度开始，没2度设个梯度，这样 大概做6个样就能看到一个明显的变化，再用哪个比较好的温度进行PCR。另外，做realtime的时候，你这个目的片段是不是有点长啊，一般200到300bp就行了。底下的那个看着也不像引物二聚体，最好能将你的引物序列在NCBI上blast一下，看看到底是不是非特异扩增，然后再下结论。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
你的空白对照是哪个？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
跟空白对照比较一下，如果跑前面的亮度和对照差不多，那估计就是引物二聚体了。可是看你怎么亮，觉得不是二聚体，很可能是非特异性条带。和楼上的建议一样，觉得还是得好好去blast一下
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园君，已阅读到文档的结尾了呢~~
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
实时荧光定量检测中引物二聚体的优化
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口}